עיצוב ניסיוני בתוך נושא באמצעות משימת מיקום אובייקט בחולדות

Summary

פרוטוקול זה מספק שלבים מפורטים עבור משימת מיקום אובייקט עם ארבע חזרות באמצעות אותה קבוצת חולדות. קידוד חלש וחזק יכול לייצר זיכרונות לטווח קצר וארוך. הגמישות של הפרוטוקול עם חזרה יכולה להיות מועילה למחקרים הכוללים ניתוחים על ידי חיסכון בזמן ובעבודה.

Abstract

זיהוי מקום אובייקט היא שיטה בולטת המשמשת לחקר זיכרון מרחבי במכרסמים. זיכרון זיהוי מיקום אובייקט זה מהווה את הבסיס למשימת מיקום האובייקט. מאמר זה מספק פרוטוקול נרחב להנחות את הקמת משימת מיקום אובייקט עם אפשרות של עד ארבע חזרות באמצעות אותה קבוצה של חולדות. פרוטוקולי קידוד חלשים וחזקים יכולים לשמש לחקר זיכרונות מרחביים לטווח קצר וארוך בעלי חוזק משתנה ולאפשר יישום של מניפולציות רלוונטיות מעכבות זיכרון או משפרות. בנוסף, חזרה על הבדיקה עם איזון הנגד המוצג כאן מאפשרת שילוב של תוצאות משתי בדיקות או יותר להשוואת פנים-נושאים כדי להפחית את השונות בין חולדות. שיטה זו מסייעת להגביר את הכוח הסטטיסטי ומומלצת בחום, במיוחד בעת הפעלת ניסויים המייצרים שונות גבוהה בהתנהגות הפרט. זה מזקק ישירות את המחקר על ידי הגדלת הנתונים המתקבלים מכל בעל חיים והפחתת המספר הכולל של בעלי חיים הדרושים. לבסוף, יישום משימת מיקום האובייקט החוזרת מגבירה את היעילות של מחקרים הכוללים הליכים כירורגיים על ידי חיסכון בזמן ובעבודה.

Introduction

משימות זיהוי ספונטניות ( למשל, זיהויאובייקטים, זיהוי מקום אובייקט) נוצלו במידה רבה בחקירת הזיכרון במכרסמים. בדיקות אלה אינן כמו מגוון הבדיקות המשמשות להערכת זיכרון המבוססות על התניית פחד או מוטיבציה לתגמול, בכך שמשימות הכרה ספונטניות מבוססות אך ורק על התנהגות גישוש ספונטנית כלפי גירויים חדשים. התנהגות זו, המכונה "העדפה נאוטית"¹, טבועה מכרסמים, כמו גם במינים יונקים אחרים וכמה שאינם יונקים כגון ציפורים ודגים². זיהוי מיקום אובייקט, התלוי בזיכרון מרחבי, ניתן לראות באמצעות משימת מיקום האובייקט (הידועה גם כמשימת זיהוי אובייקט מרחבי)³. מחקרי נגע הראו כי זיהוי מקום אובייקט דורש היפוקמפוס שלם^4,5. בגלל פרוטוקול האימון הפשוט יחסית והיעדר כל חיזוק, משימה זו עדיפה במחקרים רבים. היעדר חיזוק חיובי ושלילי ממזער את הפרמטרים הנוספים ואזורי המוח שעשויים להניע את ההתנהגות. לפיכך, ההתנהגות כאן היא נייטרלית ומבוססת על סקרנות וזיכרון מרחבי, ומאפשרת חקירה של מנגנונים המעורבים בקידוד, איחוד ואחזור של הזיכרון המרחבי.

הפרוטוקול עבור משימת מיקום אובייקט מורכב בדרך כלל מהפעלות הרגלה ואחריו הפעלה אחת של קידוד וניסויים בבדיקה, המופרדים על-ידי תקופת עיכוב, המשתנה ממספר דקות לשעות. מומלץ מאוד כי חולדות מטופלים מראש כדי למזער את רמת הלחץ של בעלי החיים, ולכן, התנהגות שיכולה להשפיע על זיכרון הכרה, כגון סלידה לחידוש. באופן דומה, פרוטוקול הרגלה מעוצב היטב ממלא תפקיד חיוני במניעת מתח שעלול לעכב את ההתנהגות הטבעית של החולדה במהלך המשימה. עם זאת, היקף הטיפול וההרגל משתנה במידה רבה בין מעבדות לנסיינים, אשר עשוי לתרום לשכפול נמוך^6,7,8. במשפט הקידוד, החולדה ניתנת זמן לחקור זירה עם שני חפצים זהים הממוקמים בשתי פינות ייעודיות. בניסוי המבחן, המתעכב בתקופה מסוימת, ניתן לעכבר זמן לחקור את הזירה עם אותם חפצים, אך הפעם אחד מהם הועבר למיקום חדשני. ההעדפה הספונטנית המוצגת על ידי החולדות והעלייה המתקבלת בזמן שהוקדש לחקר האובייקט במיקום החדש מעידים על זיהוי מרחבי ועל הזיכרון של מיקומי האובייקט³. שינוי גירסת הניסיון של הקידוד (משך ומספר החזרות) משפיע על חוזק הזיכרון.

בהתאם למטרה של המחקר, אורך העיכוב בין קידוד לניסויים בדיקה ניתן לשנות מודל חלבון-סינתזה-סינתזה זיכרון לטווח קצר או זיכרון לטווח ארוך תלוי סינתזת חלבון. לפיכך, משימת מיקום האובייקט יכולה לשמש עבור מגוון רחב של מחקרים על ידי התאמת הפרוטוקול לפי הצורך. יתר על כן, יישום של מניפולציות ניסיוניות, כגון התערבויות פרמקולוגיות ואופטוגנטיות, אפשריים גם בין ניסויים אלה, כמו הדמיית vivo. ישנם מספר מחקרים^9,10 המדווחים על חזרות חוזרות ונשנות של משימת מיקום האובייקט בתוך אותה קבוצת חולדות. זה מנוגד לשימוש המסורתי שבו בעל חיים אחד יש מושב אחד ללא חזרות. עם זאת, האפקטיביות של פרדיגמות אלה לא נחקרה ביסודיות, ואין ניירות שיטה המתארים אלה. למיטב ידיעתנו, זהו התיאור המדווח הראשון של פרוטוקול המתאר בפירוט משימת מיקום אובייקט עם עד ארבע חזרות באמצעות אותה קבוצת חולדות, אשר גם משווה באופן שיטתי את התוצאות מכל חזרה. ניתן להשתמש בחזרות כדי לאזן את תנאי הניסוי כדי לאפשר השוואת מקצועות עם שונות מופחתת בין בדיקות. החזרה האמינה של המשימה מאפשרת לאגד נתונים, כלומר ניתן ליצור כמות גדולה מספיק של נתונים באמצעות מספר קטן יחסית של חולדות. לבסוף, חזרות באמצעות אותו חולדה יכול להיות מועיל בניסויים מעורבים ניתוחים והשתלות על ידי הפחתת מספר החולדות הנדרשות, כתוצאה מכך, חוסך זמן ועלויות עבודה.

מחקר זה מציג פרוטוקול נרחב המפרט כיצד לבצע משימת מיקום אובייקט בחולדות בוגרות באמצעות ניסויי קידוד חזקים וחלשים ואחריו ניסויי בדיקה עם עיכובים של שעה ו-24 שעות. פרוטוקול הקידוד החזק מייצר זיכרון זיהוי משמעותי מבחינה סטטיסטית כאשר נבדק עם עיכובים של 1-h ו-24 שעות ולכן ניתן להשתמש בו כדי לחקור זיכרונות לטווח קצר וארוך בעת יישום מניפולציות כדי לעכב את הזיכרונות האלה¹¹. לעומת זאת, פרוטוקול הקידוד החלש מייצר זיכרון משמעותי לטווח קצר רק כאשר הוא נבדק עם עיכוב של שעה. היעדר זיכרון לטווח ארוך יכול לשמש כדי ללמוד מניפולציות לשיפור השמירה של זיכרון^11,12. פרוטוקול זה כולל גם טיפול מפורט ומפגשי הרגלה, שמטרתם להגדיל את השכפול של משימת מיקום האובייקט. מאמר זה מדגים גם חזרה על המשימה בארבעה הקשרים נפרדים עם אותה קבוצה של חולדות באמצעות פרוטוקול הקידוד החלש, אשר מאושר לייצר תוצאות לשכפול ועקביות בכל פעם.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הרשויות הלאומיות הדניות (מספר רישיון: 2018-15-0201-01405) בהתאם לחקיקה הדנית והאיחוד האירופי לרווחת בעלי חיים.

1. התקנה ניסיונית והכנה של הקשרים נפרדים

1. זירת מיקום אובייקט עם הקשר
   הערה: ההתקנה שלהלן מודגמת בתיבה אטומה לרעש סגורה (איור 1B) עם מקור האור הממוקם לאורך קצוות התקרה והמצלמה הממוקמת במרכז תקרת התיבה. הזירה, 60 ס"מ על 60 ס"מ עם קירות בגובה 100 ס"מ (איור 1B),ממוקמת בתוך הקופסה ומבודדת לחלוטין מהחדר שמסביב. כל הרמזים המרחביים נמצאים בתוך הזירה. פעולה זו מפשטת את התהליך של יצירת הקשרים נפרדים. ניתן להשיג רמה דומה של בידוד מהחדר שמסביב על ידי צירוף זירת שדה פתוח רגילה עם וילון אחיד סביב הקירות.
   1. השיגו זירה מרובעת העשויה מפלסטיק קשה אטום ולא נקבובי ברוחב מינימלי של 60 ס"מ וגובה מינימלי של 50 ס"מ. בחר צבע לרצפה המנוגד לצבע החולדה להקלטה מוצלחת של תנועות חולדה על ידי התוכנה האוטומטית (אם ישים). הניחו את הזירה בתוךקופסה (איור 1B)או על פלטפורמה המוקפת בוילון.
   2. כדי ליצור הקשר, השג שכבה שנייה של קירות הניתנים להוספה (למשל, כיסוי קיר העשוי מאותו חומר כמו הזירה, או טפט פלסטיק שניתן לנקות בקלות) בצבעים ו/או בדפוסים שונים(למשל, שחור, לבן, פסים או נקודות). הכנס את השכבה השנייה של קירות בזירה כך שהם נבדלים זה מזה.
   3. השג רמזים מרחביים תלת-ממדיים (3D) (1-2 לכל הקשר) עם ממדים המשתנים בין 10 ס"מ x 10 ס"מ x 5 ס"מ ו- 20 ס"מ x 15 ס"מ x 15 ס"מ (רוחב x אורך x גובה) ויש להם (i) צורות גיאומטריות נפרדות וצבעים (ii) המנוגדים לצבע הקיר. תלו אותם על הקירות גבוהים מספיק כדי שחולדות לא יוכלו להגיע לרמזים האלה.
   4. השג זוגות שונים של אובייקטים (רבים כמו מספר ההקשר) שאינם נקבוביים, לא לעיסים וקלים לניקוי. השתדלו ליצור צורות ומרקמים גיאומטריים נפרדים עבור כל אובייקט חדש. בחר אובייקטים שרוחבם וגובהם בין 5 ל- 15 ס"מ (הימנע מאובייקטים גבוהים יותר). ראו איור 1D לדוגמה של ארבעה עצמים נפרדים (קונוסים, כדורי פוטבול, מנסרות מלבניות ומנסרות משולשות).
      הערה: כל אובייקט צריך לעניין דומה לחולדות, כך שסכום זמני החיפוש הכוללים של כל האובייקטים דומים.
   5. מצא את הפתרון הטוב ביותר להצמדת האובייקטים על רצפת הזירה (למשל, באמצעות מחצלות דביקות, סרט דו צדדי, חיבור לוח מתכת מתחת לעצם ומגנט זיווג מתחת לזירה וכו ').
   6. בעת יצירת הקשר אחר, צור מחדש את הקירות כך שהם מנוגדים להתפלגות הצבע והתבנית של הקירות מההקשרים הקודמים. השתמש ברמזים מרחביים תלת-ממדיים חדשים השונים מכל הרמזים הקודמים ומנוגדים לה. ראה איור 1C לדוגמה של ארבעה הקשרים נפרדים.
   7. השג מקור אור שיבטיח תאורה מפוזרת ושוויונית בתוך הזירה ויש לו אפשרות עמומה יותר. התאם את עוצמת האור לכ-100-120 לוקס בפינות הזירה לאחר יצירת כל הקשר. להשיג מצלמה ולהניח אותו במרכז התקרה של התיבה.
      הערה: ניתן להתאים את עוצמת האור לרמה נמוכה יותר אם לא נעשה שימוש בתוכנת ניקוד אוטומטית.
2. דלי אובייקטים
   1. להשיג דלי (קוטר >50 ס"מ). אל תבחר צורה מרובעת כדי למנוע דמיון כלשהו לזירה הניסיונית. מלאו אותו בחומר מצעים.
   2. השג 5-10 אובייקטים בצורות וגדלים שונים (שונים מהאובייקטים שישמשו בניסוי) והצב את כולם באקראי בדלי(איור 1A).

איור 1: ההתקנה הניסיונית, הכוללת ארבעה הקשרים ואובייקטים נפרדים. (A)דלי האובייקטים להרגלת אובייקטים. (ב)מנגנון הניסוי (משמאל), המקיף את זירת מיקום האובייקט, המצלמה ומקור האור. התיבה הניסיונית והזירה לפני הגדרת ההקשר (אמצע) והזירה עם הגדרת הקשר (מימין). (C)ארבעה הקשרים (1-4) עם צבעים ודפוסי קיר נפרדים, כמו גם רמזים מרחביים תלת ממדיים. (D)ארבעה אובייקטים המשמשים בהקשרים 1-4, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

3. תוכנת מצלמה ומעקב (אופציונלי)
   1. להשיג תוכנה שניתן להשתמש בה כדי לשלוט מרחוק במקליט המצלמה שיכולה לעקוב אחר אפים של חולדות. בצע את התאמות התוכנה עבור כל הקשר ספציפי ומתח חולדה לפני כל ניסוי.
4. איזון נגדי של מיקומי אובייקטים וקבוצות ניסוי
   1. הכן שילובים אפשריים של מיקומי אובייקטים עבור קידוד וניסויים בבדיקה, ותן שם למונים. צרו את השילובים כך שיכסו את כל הפינות כמיקומי אובייקטים, ותנועת אובייקטים מפינות סמוכות לפינות אלכסונית ולהיפך (איור 2A).
   2. הכן לוח זמנים לניסוי הספציפי, התאמת כל חולדה בקבוצת ניסוי אחת עם מונה. השתמש בכל זוג של שני המונים המשויך (איור 2A) בתוך קבוצה אחת, אם יש מספיק חולדות. השתמש באותה קבוצת מונים עבור שתי קבוצות הניסוי במפגש קידוד/בדיקה יחיד (איור 2B). הקצאה מחדש של מונים עבור ההפעלות הבאות (כלומר, כל הקשר חדש).
      הערה: הפעל את החולדות בסדר מעורב במהלך מפגשי קידוד / בדיקה (לדוגמה,אל תריץ את כל החולדות בכלוב אחד אחרי השני; במקום זאת, לסובב כלובים כדי להבטיח סביבה רגועה בתוך כלוב של יותר מעכברוש אחד).
   3. בעת שימוש בשני הקשרים או יותר כדי לאזן את קבוצות הניסוי (למשל, זיכרון של שעה אחת לעומת קבוצות זיכרון של 24 שעות), הקצה חולדות לכל קבוצה ושנה את הקבוצות בהקשרים הבאים (איור 2B).

איור 2: שיטות איזון נגדי מייצגות. (א)כיוונים אפשריים של אובייקטים בזירה בקידוד וניסויי מבחן נקראים כמונים. אובייקט 1 הוא תמיד האובייקט הנע. כל שני מונים מאוזנים כך שהמיקום של האובייקט הנע משתנה. כל פינה תפוסה פעמיים, ואובייקט 1 מועבר מאלכסון לסמוך ולהיפך עבור מספר שווה של פעמים. (ב)דוגמה ללוח זמנים של קידוד/בדיקה עבור שתי הפעלות מאוזנות (לדוגמה, הקשרים 1 ו- 2). חולדות מוקצות לתנאי ניסוי בהקשר 1 (מושב X, משמאל). קבוצה של זוגות מונים(כלומר, 1-2, 3-4, 5-6 ו-7-8) נבחרים ומוקצים לכל חולדה בקבוצת ניסוי אחת. אותו סט של מונים מוקצה לחולדות בשתי קבוצות הניסוי. בפגישה הבאה בהקשר 2 (מושב X+1; מימין), החולדות בקבוצות הניסוי משתנות לאיזון נגדי, ומוקצים קבוצה חדשה של זוגות מונים. יש לציין את הזמן בתחילת הקידוד וניסויי המבחן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הערה: כל הטיפול, ההרגלה, ומפגשי הקידוד/בדיקה בפרוטוקול זה עברו אופטימיזציה בשלב האור של מחזור בהיר/כהה של 12 שעות, ולכן, מומלץ לבצע ניסויים בשלב האור.

2. טיפול והרגלה

1. התחל לטפל בחולדות החל מגמילה (אם החולדות גדלות במתקן הביתי) או שבועיים-שלושה לפני תחילת הניסויים (במקרה שהחולדות מוזמנות ממתקן חיצוני, לאחר שאפשרו להן להתאקלם שבוע לאחר ההגעה).
2. לבלות לפחות 10-15 דקות על כל כלוב של 4 חולדות במשך 2 או 3 ימים בשבוע עד החולדות נוחות להיות נגע ונאסף על ידי הנסיין. התאם את הזמן המוקצה לכל כלוב בהתאם למספר החולדות בכלוב.
   הערה: חשוב שכל הנסיינים המצפים לעבוד עם החולדות נוכחים במהלך הטיפול.
3. במקרים שבהם הטיפול מתחיל בגימה, הפחת את הטיפול למינימום (אופציונלי) לאחר הגעה לרמה זו. אם מתחילים 2-3 שבועות לפני הניסויים, להמשיך לטפל עד תחילת מפגשי הרגלה.
4. הביאו את החולדות בכלובים שלהם לחדר הניסויים כדי להרגיל את החולדות לתחבורה, כמו גם לחדר הניסויים. אפשר לחולדות לשבת לפחות 30 דקות כדי לתת להם זמן להירגע ולהרגיל. לאחר מכן, להחזיר את החולדות / כלובים לחדר הדיור.
   הערה: ניתן לשלב שלב 2.4 עם טיפול וחזרה על עצמו מספר פעמים לפי הצורך. הרגלה נוספת יכולה להיות מיושמת בשלב זה אם הפרוטוקול כולל מניפולציות נוספות (למשל, טיפול בהליך של זריקות וכו ').
5. בצע הרגלה אובייקט להרגיל חולדות אינטראקציה עם אובייקטים ולהפחית את רמות הלחץ הכללי הנובעות מהחוויה של סביבות חדשות.
   1. לפגישה 1, הביאו את כל הכלובים הביתה לחדר הניסויים, ותנו לחולדות להרגיל לחדר ולהסתפק בלפחות 30 דקות. שים חולדות (2-4 חולדות) מאותו כלוב יחד בדלי במשך 20 דקות. נקה את הדלי על ידי הסרת כל חומר צואתי בין כל קבוצה של חולדות. חזור על ההליך עבור כל הכלובים. שים את כל החולדות בכלובי הבית שלהם ותחזור לחדר הדיור.
   2. לפגישה 2, ביום נפרד להביא את כל הכלובים לחדר הניסוי ולהשאיר לפחות 30 דקות. שים כל חולדה בנפרד בדלי במשך 10 דקות. מניחים את החולדה בחזרה לכלוב הבית ולנקות את הדלי אחרי כל חולדה. החזירו את כל הכלובים לחדר הדיור.
   3. עבור הפעלה 3, חזור על שלב 2.5.2 ביום נפרד.
6. אם המנגנון הניסיוני הוא תיבה סגורה (איור 1B), בחר לבצע הרגלה של קופסה ריקה כדי להרגיל את החולדות למנגנון הניסוי החדש. בפגישה 4, להביא את כל הכלובים לחדר הניסויים ולהשאיר לפחות 30 דקות. הניחו חולדות מאותו כלוב יחד (2-4 חולדות) בזירה הריקה ללא הקשר או רמזים מרחביים(איור 1B,אמצע) למשך 20 דקות. מחזירים את כל החולדות לכלוב הביתי, ומנגבים את הזירה עם 70% אתנול אחרי כל קבוצת חולדות.
   הערה: שלבים 2.5 ו- 2.6 צריכים להתבצע בשבוע אחד, לפני שבוע ההרגלה של ההקשר (שלב 2.7; ראו איור 3). הפסקה של כמה ימים במהלך צעדים אלה מקובלת. עם זאת, לאחר תחילת שלב 2.7, כל שלב צריך להתבצע בימים רצופים כמפורט, עד לסוף ניסוי הבדיקה (שלב 2.9).
7. בצע הרגלה הקשר להרגיל חולדות להקשר ורמזים 3D, כדי להפחית את רמות הלחץ הכלליות ולתמוך בלמידה המרחבית של הסביבה.
   1. שנה את הזירה הריקה כדי ליצור את ההקשר הראשון כמתואר בסעיף 1.1, אך אל תשים את האובייקטים בזירה. הכן את ציוד ההקלטה.
   2. לפגישה 1, הביאו את כל הכלובים לחדר הניסויים והשאירו למשך 30 דקות לפחות. הפעל את הרשמקול אם פעולה זו באופן ידני. מניחים את החולדה הראשונה במרכז הזירה, ומאפשרים לעכברוש לחקור את הזירה במשך 10 דקות. לאחר מכן, לעצור את הרשמקול (אם ידני), ולהחזיר את החולדה לכלוב הביתי. נגב את הזירה ביסודיות עם 70% אתנול אחרי כל חולדה, והחזיר את כל הכלובים לחדר הדיור בסיום.
   3. עבור מפגשים 2 ו -3, חזור על שלב 2.7.2 עבור כל חולדה במשך יומיים רצופים, כך שיש 3 מפגשים של הרגלה הקשר לכל חולדה בסך הכל.
      הערה: שקול לדשדש את הסדר שבו חולדות נכנסות לזירה, במיוחד כאשר מתמודדים עם קבוצה גדולה. זה נמנע הפעלת חולדות ספציפיות שוב ושוב באותו הזמן של היום.

איור 3: עיצוב הניסוי ההתנהגותי כולל טיפול, הרגלה ופרוטוקולי משימות של מיקום אובייקטים. חולדות צריכות להיות מטופלות באופן קבוע החל מכמה שבועות לפני שבוע ההרגלה. בשבוע 0, חפצים ותיבות ניסיוניות מתבצעים מעל 4 מפגשים עם מרווחים של 24 שעות לפחות בין לבין. בשבוע 1, הרגלה הקשר מתבצעת מעל 3 מפגשים רצופים עם מרווחים של 24 שעות בין לבין, ואחריו קידוד וניסויים במבחן. צריך להיות מרווח מינימלי של 48 שעות ועד שבוע לפני שתמשיך בפגישה הבאה (למשל, להתחיל הרגלה להקשר הבא בשבוע 2 או 3). קיצור: האב, הרגלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

8. ניסוי קידוד (מושב 4)
   הערה: במקרה של מניפולציות פרמקולוגיות, זמן סביר לנהל סוכן יכול להיות לפני או מיד לאחר ניסוי הקידוד ו /או לפני הניסוי הבדיקה בהתאם לאופיו של הסוכן הפרמקולוגי.
   1. הביאו את כל הכלובים לחדר הניסויים והשאירו לפחות 30 דקות. בעזרת לוח הזמנים שהוכן מראש(איור 2B),מקם את זוג האובייקטים הזהים הראשונים במיקומים המיועדים (ב-2 פינות ובמרחק של >10 ס"מ מכל קיר בהתאמה; ניתן להשתמש בפיסת קרטון בצורת L לשמירה על מרחק זהה בכל פעם) באמצעות מחצלות דביקות או סרט דו-צדדי.
   2. הפעל את הרשמקול (אם ידני). מניחים את החולדה הראשונה בזירה מול קיר או פינה שאינה תפוסה על ידי כל אובייקט (מרחק שווה לכל אובייקט).
      הערה: בצע את השלבים הבאים עבור קידוד חלש או חזק.
   3. עבור קידוד חלש (ניסיון אחד),לאפשר לחולדה לחקור את הזירה ואת האובייקטים במשך 20 דקות. לאחר מכן, לעצור את הרשמקול (אם ידני), ולהחזיר את החולדה לכלוב הבית. הסר את האובייקטים, ולנגב את שני האובייקטים ואת הזירה ביסודיות עם 70% אתנול.
   4. חזור על שלב 2.8.3 עבור כל החולדות, כך שכל חולדה מקבלת 1 ניסוי קידוד של 20 דקות.
   5. עבור קידוד חזק (3 ניסויים),לאפשר לחולדה לחקור את הזירה ואת האובייקטים במשך 5 דקות. לאחר מכן, לעצור את הרשמקול (אם ידני), ולהחזיר את החולדה לכלוב הבית. אל תסיר את האובייקטים. נגב את הזירה ואת האובייקטים עם 70% אתנול.
   6. חזור על שלב 2.8.5 עוד פעמיים עם אותה חולדה כך שיש 3 ניסויים בסך הכל. תחזיר את החולדה לכלוב הביתי כשי תם הזמן. מוציאים את החפצים לניקוי יסודי, ומנגבים את החפצים ואת הזירה עם 70% אתנול.
      הערה: מרווח בין ניסיון עבור חולדה צריך להיות כ 1-2 דקות.
   7. חזור על שלבים 2.8.5-2.8.6 עבור כל חולדה.
   8. אם זמן ההשהיה קצר מ-24 שעות, השאר את הכלובים בחדר הניסויים עד לניסוי המבחן. אם לא, החזירו את כל הכלובים לחדר הדיור לאחר השלמתם.
9. גירסת ניסיון (הפעלה 4)
   הערה: יש לספור את תקופת ההשהיה מתחילת גירסת הניסיון של הקידוד.
   1. במקרה של עיכוב של 24 שעות (או כל עיכוב המחייב את ניסוי הבדיקה להתבצע למחרת), להביא את כל הכלובים לחדר הניסויים, משאיר מספיק זמן לפני הבדיקה הראשונה, כך החולדות ניתן להשאיר לפחות 30 דקות. על פי לוח הזמנים, מקם את האובייקטים במיקומים המיועדים (אחד האובייקטים במיקום חדש).
   2. כאשר הגיע הזמן, הפעל את הרשמקול (אם ידני). מניחים את החולדה הראשונה בזירה מול קיר או פינה שאינה תפוסה על ידי כל אובייקט (מרחק שווה לכל אובייקט).
   3. אפשר לעכברוש לחקור את הזירה והחפצים במשך 5 דקות. לאחר מכן, עצור את הרשמקול (אם ידני). תחזיר את החולדה לכלוב הביתי. הסר את האובייקטים, ולנגב את שני האובייקטים ואת הזירה ביסודיות עם 70% אתנול.
   4. חזור על השלבים 2.9.2-2.9.3 עבור כל חולדה. תחזיר את כל הכלובים לחדר הדיור.
      הערה: בכל מפגש קידוד/בדיקה עוקב, התחל את פרוטוקול ההרגלה החל בשלב 2.7 (הרגלה הקשרית) לאחר מרווח של 48 שעות לפחות ועד שבוע אחד.

3. ניתוח נתונים

1. עבור כל חולדה, הבקיע את זמן החיפוש עבור כל אובייקט הן בקידוד והן במבחנים באמצעות תוכנה המיועדת למטרה זו או באמצעות הגדרה ידנית. ניסויי קידוד ציון לכל אורך הזמן. ניסויי מבחן ציון במשך 2 דקות לביצועי האפליה הטובים ביותר³. אם אתה משתמש בנתוני תוכנה מקוונים אוטומטיים, יצא את נתוני הניקוד מהתוכנה.
2. ספירת זמן החיפוש כאשר החולדה נמצאת במגע עם האובייקט, מרחרח את האובייקט או פונה לאובייקט במרחק של פחות מ -2 ס"מ. כלול טיפוס וישיבה על האובייקט כחקירה אלא אם כן נראה שתשומת הלב של החולדה נמצאת במקום אחר מאשר האובייקט (למשל, מבט הרחק מהאובייקט).
3. חשב את זמן החיפוש הכולל עבור שני האובייקטים עבור כל חולדה. שקול להוציא כל חולדה שיש לה זמן חקירה כולל של פחות מ -10 s בניסוי הבדיקה (עבור 2 דקות ניקוד) מן המבחן הזה, כפי שהוא עשוי לשקף חקירה לא אמינה.
4. חשב את אחוז החיפוש עבור כל אובייקט (משוואה 1) או את אינדקס האפליה (DI) עבור כל חולדה (משוואה 2) וחשב ערכי ממוצעים עבור הקבוצות.
   (1)
   
   הערה: אם % חקירה היא 50% או DI הוא 0, זה אומר שהביצועים הם ברמת הסיכוי, ולעכברוש אין העדפה לאף אחד מהאובייקטים. אחוז החיפוש הממוצע ו- DI במהלך ניסויי קידוד צריכים להיות ~ 50% או 0, בהתאמה. כל חולדה המציגה העדפה גבוהה יותר מ[± ממוצע (2 × SD)] עבור כל אחד מהאובייקטים בניסוי הקידוד צריך להיות מוחרג מניתוח הבדיקה המתאימה. זה מאפשר פרשנות אמינה של העדפה בניסוי הבדיקה כזיכרון של מיקום האובייקט היציב. ניתן לחשב ערך זה עבור בדיקה בודדת או עבור נתוני קידוד משולבים ממספר בדיקות.
5. נתח את הנתונים בשיטה המתאימה ביותר להתקנה הניסיונית. השתמש בבדיקת tמדגם אחד לזיהוי העדפה משמעותית מעל רמת הסיכוי.
6. תוך שימוש ביותר מהקשר אחד עם איזון נגדי, שלב את התוצאות של אותו מצב ניסיוני על-פני הקשרים.
   הערה: פעולה זו תגרום לקבוצות המורכבות מאותן חולדות, המאפשרות השוואת בין נושאים באמצעות t-testמשויך לשתי קבוצות ושימוש בניתוח אמצעים חוזרים ונשנים של שונות (ANOVA) עבור יותר משתי קבוצות.

תוצאות

מוצגות כאן התוצאות הייצוגיות הן לפרוטוקולי הקידוד החזקים והן החלשים המתוארים באמצעות טירוצין הידרוקסילאז זכר (Th)-Cre חולדות מהונדסות¹³ עם זן Long-Evans backcrossed ארבע פעמים לזן ליסטר ברדס וחולדות בר בר בר ליסטר ברדס. חולדות מהונדסות Th-Cre שימשו קו חולדה זה ישמש במחקרים עתידיים מעורבים אופטוגנטיקה. באמצעות כל פרוטוקול, הזיכרון נבדק עם עיכובים של 1 ו 24 שעות. בדיקות בשעה 1 שעות מדגימים זיכרון לטווח קצר, בעוד בדיקות 24 שעות להדגים זיכרון לטווח ארוך. ערך החרגה של העדפת הקידוד חושב כמתואר בפרוטוקול, תוך שימוש בנתונים המשולבים מחמש בדיקות (פרוטוקולי קידוד חזקים וחלשים) כ[50.8% ± (2×10.8%)] . חולדות שהיו בעלות העדפת קידוד מעל ומתחת לערכים אלה הוחרגו מהניתוחים של המבחנים המתאימים.

לניסויי קידוד חזקים, 16 חולדות שימשו, ולניסויי קידוד חלשים נעשה שימוש ב-19 חולדות. במהלך ניסויי הקידוד החזקים (3 × 5 דקות קידוד; איור 4A), לא הייתה העדפה משמעותית לאף אחד מהאובייקטים (52.0 ± 1.9%, n = 16, t₁₅ = 1.1, p = 0.29; מדגם אחד t-testלעומת רמת סיכוי). פרוטוקול קידוד חזק זה הוביל להעדפה של האובייקט במיקום החדש, כפי שמוצג במונחים של חיפוש באחוזים ממוצעים, שהיה גבוה משמעותית מרמת הסיכוי (50%) בבדיקות עם עיכובים של 1 שעות ו- 24 שעות (זיכרון של שעה אחת, 77.9 ± 2.4%, n = 8, t₇ = 11.8, p < 0.001; זיכרון 24 שעות, 65.2 ± 5.3%, n = 8, t₇ = 2.8, p = 0.025; מדגם אחד t-testלעומת רמת סיכוי). לא היה הבדל משמעותי בין זיכרון של שעה ו-24 שעות (p = 0.056; t-testשל וולש לא משוחזר).

במהלך ניסויי הקידוד החלשים (קידוד של 20 דקות; תוצאות שחולפו מארבעה הקשרים; איור 4B), לא הייתה העדפה משמעותית לאף אחד מהאובייקטים (51.1 ± 1.0%, n = 66, t₆₅ = 1.2, p = 0.24; מדגם אחד t-testלעומת רמת סיכוי). פרוטוקול קידוד חלש זה הניב עלייה משמעותית בהעדפה של האובייקט במיקום החדש בהשוואה לרמת מקריות בבדיקות עם עיכוב של שעה אחת, אך לא עיכוב של 24 שעות (נתונים משולבים מכל ארבעת ההקשרים; זיכרון של שעה אחת, 66.7 ± 2.0%, n = 32, t₃₁ = 8.2, p < 0.001; זיכרון 24 שעות, 49.6 ± 2.6%, n = 34, t₃₃ = 0.16, p = 0.87; מדגם אחד t-testלעומת רמת סיכוי). היה הבדל משמעותי בין הביצועים במבחנים עם עיכובים של שעה ו-24 שעות (זיכרון של 1 שעות: n = 32, זיכרון 24 שעות: n = 34, t_61.5 = 5.2, p < 0.001; t-testשל וולש לא משופר).

זיכרון ברמת הקבוצה לא נצפה במבחן ההשהיה של 24 שעות כפי שנמדד על-ידי ביצועים ברמת המזל, אלא הראה וריאציות בודדות. וריאציה גבוהה יותר זו עבור חלשים עד ללא זיכרון תנאים (למשל,בדיקה 24 שעות) נצפתה בדרך כלל עקב חקירה אקראית יותר של האובייקטים. לפיכך, חשוב לא לפרש את הביצועים של חולדות בנפרד. במקום זאת, ניתן להשתמש בחלוקה של נקודות נתונים בודדות יחד עם ממוצע הקבוצה כתוצאה האמינה של הבדיקה. ככל שהקידוד חזק יותר, כך התנהגות החולדות הופכת אחידה יותר, ומספר החולדות הדרוש להגעה למשמעות סטטיסטית, כפי שניתן לראות באיור 4A לפרוטוקול הקידוד החזק. לעומת זאת, קבוצות גדולות יותר נדרשות להשגת תוצאות אמינות לתנאים חלשים(איור 4B).

איור 4: ביצועי זיכרון לאחר קידוד חזק וחלש. (A) ניסוי הקידוד החזק (3 × 5 דקות קידוד) ואחריו ניסויי מבחן של 1-h או 24 שעות. לא הייתה העדפה משמעותית לאף אחד מהאובייקטים במהלך ניסויי קידוד (n = 16). הקידוד החזק יצר העדפה מוגברת באופן משמעותי לאובייקט במיקום החדש במבחנים עם עיכובים של 1-שעה ו-24 שעות בהשוואה לרמת הסיכוי (זיכרון של 1 שעות ו-24 שעות: n = 8 בכל קבוצה). לא היה הבדל משמעותי בין קבוצות. (B)ניסוי הקידוד החלש (קידוד של 20 דקות) ואחריו ניסויי מבחן של 1-שעה או 24 שעות. לא הייתה העדפה משמעותית לאף אחד מהאובייקטים כקבוצה במהלך ניסויי קידוד (n = 66). הקידוד החלש יצר העדפה מוגברת באופן משמעותי לאובייקט במיקום החדש במבחן עם עיכוב של שעה אחת, אך לא 24 שעות, בהשוואה לרמת הסיכוי (זיכרון של 1 שעות: n = 32; זיכרון של 24 שעות: n = 34). היה הבדל משמעותי בין הביצועים במבחנים עם עיכובים של שעה ו-24 שעות. התוצאות אוגדו מארבעה הקשרים. נקודות נתונים בודדות מוצגות כנקודות. כל מייצגי הפעילויות מציגים את אחוז החיפוש של האובייקט במיקום חדשני כממוצע ± SEM. * p < 0.05, ***p < 0.001; מדגם אחד t-testלעומת רמת סיכוי (50%, קו מקווקו). ^###p < 0.001; ns, לא משמעותי; מבחן ה-t-testשל וולש לא פורסם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

יתרון משמעותי בפרוטוקול שנקבע זה הוא שניתן לבצע אותו ארבע פעמים באמצעות ארבעה הקשרים נפרדים (איור 1C) עם אותה קבוצה של חולדות. התוצאות המוצגות באיור 5 ממחישות דרך אפשרית אחת להשתמש באיזון נגדי עם שתי קבוצות ניסיוניות (קבוצות זיכרון של שעה ו-24 שעות). שתי הקבוצות היו מאוזנות בשני הקשרים (הקשרים 1 ו-2), והדבר חזר על עצמו בשני הקשרים נוספים (הקשרים 3 ו-4; איור 5א). התוצאות מארבעת ההקשרים מוצגות בנפרד באיור 5B,D, שבו הזיכרון עבור כל קבוצת ניסוי הוערך על-ידי השוואת ההעדפה לרמת סיכוי בכל הקשר (זיכרון 1-h: הקשר 1, 69.9 ± 3.6%, n = 9, t₈ = 5.5, p < 0.001; הקשר 2, 65.6 ± 3.9%, n = 9, t₈ = 4.0, p = 0.004; הקשר 3, 65.2 ± 3.8%, n = 7, t₆ = 4.0, p = 0.007; הקשר 4, 65.3 ± 5.6%, n = 7, t₆ = 2.7, p = 0.035; זיכרון של 24 שעות: הקשר 1, 45.1 ± 6.4%, n = 9, t₈ = 0.77, p = 0.46; הקשר 2, 49.1 ± 4.9%, n = 9, t₈ = 0.18, p = 0.86; הקשר 3, 57.2 ± 4.1%, n = 8, t₇ = 1.7, p = 0.12; הקשר 4, 47.6 ± 4.7%, n = 8, t₇ = 0.52, p = 0.62; מדגם אחד t-testלעומת רמת סיכוי).

בהקשרים 1, 2 ו- 4, השוואת בין-נושאים של הקבוצות חשפה הבדלים משמעותיים בין זיכרון של שעה אחת ל- 24 שעות (זיכרון של 1 שעות לעומת זיכרון של 24 שעות: הקשר 1, t_12.7 = 3.4, p = 0.005; הקשר 2, t_15.2 = 2.6, p = 0.019; הקשר 3, t_13.0 = 1.4, p = 0.17; הקשר 4, t_12.2 = 2.4, p = 0.032; מבחן ה-t-testשל וולש לא משוער). לקבלת ייצוג טוב יותר והשוואת נתונים בתוך הנושא, שולבו התוצאות משני הקשרים מאוזנים (איור 5C,E). קבוצות הניסוי המשולבות הושוו שוב לרמת המזל בנפרד (הקשרים 1 ו-2 יחד: זיכרון של שעה אחת, 67.8 ± 2.6%, n = 18, t₁₇ = 6.7, p < 0.001; זיכרון 24 שעות, זיכרון 27.1 ± 3.9%, n = 18, t₁₇ = 0.74, p = 0.47; הקשרים 3 ו- 4 יחד: זיכרון של שעה אחת, 65.3 ± 3.3%, n = 14, t₁₃ = 4.7, p < 0.001; זיכרון של 24 שעות, 52.4 ± 3.2%, n = 16, t₁₅ = 0.73, p = 0.48; מדגם אחד t-testלעומת רמת סיכוי). לאחר מכן, קבוצות הניסוי הושוו זו לזו.

בשני זוגות ההקשרים, היו הבדלים משמעותיים בין קבוצות כפי שנחשפו על-ידי השוואות בתוך הנושאים (זיכרון של שעה אחת לעומת זיכרון של 24 שעות: הקשרים 1 ו-2 יחד, t₁₆ = 3.5, p = 0.003; הקשרים 3 ו- 4 יחד, t₁₃ = 2.4, p = 0.032; מבחן tמזווג). תוצאות דומות הושגו עם חולדות בר בר בר בר בר בר, מדי, בפרוטוקול הקידוד החלש באמצעות הקשרים 1 ו 4 עבור שני מפגשים מאוזן (נתונים לא מוצגים). השכפול והמהימנות של התוצאות אומתו על-ידי השוואת כל ערכת נתונים באמצעות ANOVA חד-כיוונית. לא זוהה הבדל משמעותי בין ארבעת ההקשרים (זיכרון 1-h: F_3,28 = 0.31, p = 0.81; זיכרון 24 שעות: F_3,30 = 0.99, p = 0.41). לכן, ניתן לחזור על בדיקת מיקום האובייקט באופן אמין עם השפעה מינימלית של חזרות, בהתחשב בכך שההוראות בפרוטוקול זה מתבצעות.

איור 5: דרכים שונות להציג ולנתח את תוצאות פרוטוקול הקידוד החלש עם שתי קבוצות ניסוי המאוזנות על פני שני מפגשים. (A) העיצוב הניסיוני לאיזון נגדי עם שתי קבוצות זיכרון (קבוצות זיכרון של 1-h ו- 24 שעות) על פני שני מפגשים (הקשרים 1 ו - 2). האיזון הנגדי חזר על עצמו בשני מפגשים נוספים (הקשרים 3 ו-4). (B ו- D) התוצאות מכל הקשר וקבוצות הניסוי הושוו בנפרד לרמת הסיכוי ולשני. בכל ארבעת ההקשרים, ההעדפה של האובייקט במיקום החדש במבחנים עם עיכוב של שעה אחת גדלה באופן משמעותי בהשוואה לרמת הסיכוי [הקשר 1 ו-2: n = 9 לכל קבוצה (B); הקשר 3 ו- 4: n = 7 לכל קבוצה (D)]. במבחני עיכוב של 24 שעות, ההעדפה של האובייקט במיקום החדש לא הייתה שונה מההזדמנות (הקשר 1 ו- 2: n = 9 לכל קבוצה; הקשר 3 ו- 4: n = 8 לכל קבוצה). היה הבדל משמעותי בין ההעדפות של קבוצות ניסוי בהקשרים 1, 2 ו-4, אך לא בהקשר 3, כפי שנחשף בהשוואת בין נושאים. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; מדגם אחד t-testלעומת רמת סיכוי (50%, קו מקווקו). ^#p < 0.05; ^##p < 0.01; ns, לא משמעותי; מבחן ה-t-testשל וולש לא פורסם. (C ו- E) התוצאות מוצגות לאחר שילוב קבוצות הניסוי משני ההקשרים המאוזנים [הקשרים 1 ו- 2 יחד, n = 17 לכל קבוצה (C); הקשרים 3 ו- 4 משולבים, n = 14 לכל קבוצה (E)]. ההעדפה לאובייקט במיקום החדש הוגדלה באופן משמעותי בהשוואה לרמת הסיכוי במבחנים עם עיכוב של שעה אחת, אך לא 24 שעות, בשני זוגות ההקשרים. ההשוואה בין הנושאים של קבוצות הניסוי חשפה הבדלים משמעותיים בין ההעדפות של האובייקט במיקום החדש במבחנים עם עיכובים של שעה ו-24 שעות בשני זוגות ההקשרים. עמ' < 0.001; מדגם אחד t-testלעומת רמת סיכוי (50%, קו מקווקו). ^#p < 0.05, ^##p < 0.01; מבחן טימזווג. נקודות נתונים בודדות מוצגות כנקודות. כל מייצגי הפעילויות מציגים את אחוז החיפוש של האובייקט במיקום החדש כממוצע ± SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

ניתן להשתמש במשימת מיקום האובייקט במגוון מחקרים כדי לחקור זיכרון מרחבי כמתואר קודם לכן. הגמישות של ההתקנה מאפשרת מידול של זיכרון לטווח קצר וארוך של עוצמות שונות, וזה יכול להיות מיושם בקלות בעלות נמוכה. עם זאת, מכיוון שיש פרמטרים רבים בפרוטוקול שיכולים להשפיע על התוצאות, ומחקרים שונים משתנים מעט בפרמטרים אלה 6 , ניתן להתמודד עם^קשייםבהצלחה ביישום המשימה בפעם הראשונה. הפרוטוקול לעיל נועד להנחות את הקוראים בתהליך זה בצורה חלקה. צעדים חיוניים נוספים שעשויים להיות משמעותיים ביישום מוצלח של המשימה עם שכפול גבוה יידונו להלן.

למרות קידוד / מבחן מפגש לעתים קרובות הוא המוקד בעת הפעלת ניסויים מיקום אובייקט, טיפול ופרוטוקולי הרגלה יש השפעה עמוקה על התוצאה של סוג זה של בדיקות התנהגותיות שבו התוצאה תלויה בהתנהגות חולדה טבעית ללא הפרעה^14,15. ככזה, השלבים שקדמו לפגישת הקידוד/בדיקה צריכים להיות מתוכננים בזהירות, שכן הם יכולים להשפיע על התנהגות החולדה והזיכרון וכתוצאה מכך, להשפיע על התוצאות הסופיות. רמה טובה של טיפול והרגלה כך חולדות להכיר את הנסיין ואת המשימה תמזער את ההשפעה של גורמי מתח תוך הגדלת הסבירות להפגין התנהגות טבעית⁸. כפי שהוזכר בפרוטוקול, הטיפול יכול להתחיל כבר גמילה של גורים אם זן החולדה נשמר במתקן הביתי. בהתבסס על ניסיון קודם (נתונים לא הראו) וממנה של מספר מחקרים קודמים^16,17, טיפול מוקדם זה גורם חרדה נמוכה וסקרנות משופרת בחודשים הבאים.

כמו המשימה מיקום האובייקט תלוי אך ורק על כונן חקר מהותי של החולדות, התנהגות צפויה יכולה להיות מעוכבת בקלות אם חולדות אינן להוטות לחקור או מסרבות להתקרב לחידוש, המכונה "התנהגות ניאופובית"¹. ככזה, מומלץ מאוד לכלול פרוטוקול טיפול והרגלה יסודיים בהתאם לצרכים הספציפיים של המחקר. פרוטוקול זה יכול לשמש כמדריך דרישה מינימלי, וניתן ליישם צעדים נוספים (למשל,אם המחקר יכלול זריקות בשלב מאוחר יותר, נדרשת הרגלה להליכי הזרקה ותנוחת החזקה ספציפית). הזן וגיל החולדות הניסיוניות הם שני גורמים משפיעים אחרים ויש לשקול לפני תכנון ניסוי כדי למנוע תוצאות תת-אופטימליות. זנים שונים חולדה יכול להיות התנהגויות שונות ורמות חרדה בסיסית^18,19,20 ולכן, התאמה ספציפית לפרוטוקול עשוי להידרש בהתאם למתח בשימוש.

פרוטוקול זה מאושר לעבוד היטב עם חולדות מהונדסות Th-Cre עם זן Long-אוונס backcrossed ארבע פעמים לזן ליסטר ברדס וחולדות בר בר. גיל התחלה אידיאלי מבחינה לוגית עבור חולדות בניסויים התנהגותיים הוא סביב 12 שבועות²⁰, אבל שונות בין זן ואת הדרישות הספציפיות של המשימה צריך להיות בחשבון. זה יכול להיות גם אפשרי להשתמש בחולדות מתפתחות אם זה עניין עבור המחקר, אם כי התאמות לפרוטוקול עשוי להידרש ואינם מכוסים כאן. עם זאת, חשוב לשקול אם החולדה בגיל נתון פיתחה את הפונקציות הקוגניטיביות הנדרשות לביצוע משימה זו בהצלחה. מחקר²¹ החוקר את זה דיווח כי רק החולדות המתבגרות ביום שלאחר ההולדה 38 ולא לפני כן, הראו זיכרון מרחבי אלוקנטרי המשתקף בהעדפה לאובייקט במיקום החדש, כפי שנצפו בחולדות בוגרות. הפרוטוקול שהוצג כאן היה מוצלח באמצעות חולדות שהיו בנות 15-16 שבועות בתחילת מפגש הקידוד / הבדיקה הראשון. בעבר, אותו פרוטוקול קידוד חזק הניב תוצאות תת-אופטימליות עד שליליות בעת שימוש בחולדות בנות 23 שבועות שלא הגיעו לרמה האופטימלית של התרגלות בשל חוסר טיפול והרגל בגיל צעיר מספיק. חולדות אלה לא הצליחו לבצע באופן שונה מרמת המזל או למעשה, הפגינו סלידה לחידוש כפי שנצפה מבחינת העדפה לאובייקטים היציבים במקום האובייקטים שנעקרו (נתונים לא מוצגים). תוצאות אלה מספקות ראיות לכך שהגיל והתזמון של הרגלת הטיפול יכולים להשפיע על יעילות ההרגל וכתוצאה מכך, לתרום לתצפית על התנהגות חרדה וניאופובית במבחנים.

כאן מפורטים שני פרוטוקולים שונים, המבטיחים קידוד חזק או חלש בפעילות מיקום האובייקט. במהלך הקמת פרוטוקולים אלה, נצפתה כי העניין באובייקטים ירד לאחר 5-10 דקות של חקירה במהלך ניסויים ארוכים יחיד(למשל, 20 דקות קידוד), וחולדות בסופו של דבר הפסיק לחקור. התוצאה היא זיכרון חלש יותר של מיקומי האובייקטים. פרוטוקול קידוד המשתלב בניסויי קידוד עם תקופות מנוחה קצרות(למשל, קידוד של 3 x 5 דקות) מתגבר על כך ומוביל לחקירה גבוהה לאורך כל הניסויים. לכן, זמן החיפוש הפעיל והמערך השונה של שני פרוטוקולי הקידוד האלה משפיעים על חוזק הזיכרון, שהוא חזק יותר לאחר קידוד של 3 x 5 דקות מאשר לאחר פרוטוקולי קידוד של 20 דקות. תוצאות דומות יכולות גם להיות מושגות באמצעות משכי זמן שונים במקצת עם ניסוי יחיד לעומת פרוטוקולי ניסוי interleaved, והתאמות ניתן לבצע כדי להתאים את הצרכים של המחקר ואת זן החולדה.

בניגוד לפרוטוקולים המשתמשים בשדה פתוח לבן רגיל עם רמזים חיצוניים בלבד בחדר, הפרוטוקול המוצג כאן משתמש בזירה עם הקשרים ברורים ורמזים תוך מבוך שסביר להניח שדורש יותר זמן ללמוד. לפיכך, מומלץ לתוספת של שלב הרגלה הקשר בפרוטוקול לפני משפט הקידוד. זה יאפשר לחולדות ליצור מפה מרחבית של כל הקשר במהלך ההרגלה ולהקטין את משך תקופת הקידוד הבאה, שכן החולדות יצטרכו רק לקודד את מיקומי האובייקטים ביחס למפה זו. יתר על כן, הרגלה הקשר יאפשר חולדות להרגיל לכל מסיח דעת אפשרי בתוך כל הקשר, כגון רמזים מרחביים 3D, מזעור התנהגויות אחרות מאשר חקר אובייקטים בפגישת הקידוד / הבדיקה לעקוב. עם יישום שיטת איזון נגדי יסודי המורכבת ממספר רמות (כלומר, מגוון רחב של צירופי מיקום אובייקט (מונים) וכיוון תזוזת האובייקט), העדפות לא רצויות שעלולות לעלות עקב שינויים בעוצמת האור וצבעי הקיר / דפוסים בפינות הזירה ממוזערים.

יש לקחת בחשבון מספר גורמים בעת חזרה על המשימה כדי להגדיל את השכפול בין קידוד / הפעלות בדיקה ולמזער את ההשפעה של חזרה. ראשית, הקשרים ברורים (רבים כמו מספר החזרות של מפגשי קידוד/בדיקה) צריכים להיות מתוכננים כדי למנוע הצטברות של זיכרון מרחבי שעלול להיגרם על ידי ביצוע הפעלות חוזרות ונשנות באמצעות אותו הקשר. כדי להשיג זאת, נעשה שימוש במנגנון עם קירות הניתנים להחלפה בצבעים ובדפוסים שונים (איור 1B, C). הקירות הייחודיים והאובייקטים התלת-ממדיים (כגון צעצועים או פריטים יומיומיים קטנים בצבעים וצורות נפרדים, ראו פרוטוקול ואיור 1C) התלויים על הקירות הם הרמזים המרחביים וציוני הדרך שהחולדות עשויות להשתמש בהם כדי ללמוד מיקומי אובייקטים ביחס להקשרים שלהם. במקרה שבו בדיקה אינה מצליחה לייצר העדפה לאובייקט שהועבר, ניתן לשקול שינוי פרמטרים אלה של ההקשר (עיצוב קיר ורמזים מרחביים). לחלופין, ניתן להשתמש בזירה מלבנית או עגולה עבור משימות מיקום אובייקטים במקום זירה מרובעת כמו בפרוטוקול זה. זירות מעגליות מדווחים כדי לחסל העדפות פינה²² כי הוא נצפה לעתים קרובות בזירות עם פינות, ולכן, זה יכול להיות מועיל בעת התמודדות עם חולדה חרדה גבוהה במיוחד או זן עכבר. בעוד הדרישות של יצירת ארבעה הקשרים נפרדים בפרוטוקול זה פועל בצורה אופטימלית ביותר עם צורה מרובעת, זירה מעגלית יכולה גם להיות פונקציונלית לאחר כמה התאמות.

שנית, יש לקבוע את המרווחים בין כל מפגש קידוד/מבחן כך שחולדות שומרות על אותה רמת עניין בכל פעם, תוך הימנעות מהסיכון ללמידה מצטברת הנובעת מלוח זמנים צפוף של חזרות. בדרך כלל, מרווח של לפחות כפול מאורך זמן ההשהיה בין קידוד לניסויים במבחן מספיק, עם מרווחי זמן ארוכים יותר להיות נוח יותר עבור יותר משתי חזרות. משמעות הדבר היא, בעוד מרווח מינימלי של 48 שעות לאחר בדיקה של 24 שעות מספיק עבור החזרה אחת או שתיים, באמצעות מרווח של שבוע אחד מומלץ לארבע חזרות. כפי שהתוצאות באיור 5 וההשוואה באמצעות ANOVA מראות, ניתן לחזור על המשימה בהצלחה ארבע פעמים. בהתבסס על כך, הפרוטוקול שנקבע יכול לשמש כדי לאזן עד ארבעה תנאים ניסיוניים. מספר קבוצות הניסוי קובע את מספר החזרות של מפגשי קידוד/ניסוי בהקשרים שונים. התוצאות באיור 5 מייצגות דרך אפשרית אחת להשתמש בפרוטוקול עם שתי קבוצות ניסוי. הקבוצות אוזן בשני מפגשים, ואותם תנאים חזרו על עצמם בשתי הפעלות נוספות (למטרות אימות). ניתן להשתמש בערכה השנייה של הפעלות מאוזנות גם כדי לאזן תנאים חדשים. באופן דומה, ניתן להשוות שלושה או ארבעה תנאים ניסיוניים באמצעות שלושה או ארבעה מפגשים מאוזנים, בהתאמה.

במקרים אלה, יש לתכנן את ההקשרים כך שיתאימו למאפיינים מנוגדים המתוארים בפרוטוקול. ראוי לציין כי העיצוב המאוזן עשוי שלא להתאים לניסויים שבהם יש להשתמש במניפולציות נוספות, כגון התערבות פרמקולוגית שעלולה להשאיר אפקט או נזק לאורך זמן. כדי לשמור על האפקטיביות והשכפול של הבדיקות, הניסוי צריך להיות מתוכנן בהתאם. ניתן להציג ולנתח את הנתונים מבדיקות חוזרות במספר דרכים, כפי שניתן להוכיח באיור 5. עבור ניתוח ראשוני, ניתן להשוות את קבוצות הניסוי בכל הקשר בנפרד לרמת הסיכוי באמצעות t-testמדגם אחד כדי לקבוע העדפה משמעותית (איור 5B,D). זה יכול להיות מועיל כדי לקבל הבנה מהירה של הנתונים, אבל זה מבטיח רק השוואה עקיפה של הקבוצות. לכן, עבור השוואת שתי קבוצות או יותר, יש לנתח את הנתונים באמצעות שתי בדיקות t-דגימות (מזווגות או לא משויפות) או ANOVA, בהתאמה. זה יכול להיות בצורה של השוואת בין נושאים של הקבוצות בתוך קידוד יחיד / מפגש בדיקה (איור 4A ואיור 5B, D) או בתוך נושאים השוואה של הקבוצות משני הקשרים (או יותר) מאוזן ( איור5C, E). השיטה השנייה מומלצת בחום, במיוחד כאשר מתמודדים עם תנאי זיכרון חלשים, אשר, כפי שהוסבר קודם לכן, גורם שונות גבוהה עקב אקראיות בהתנהגות.

שילוב ההקשרים המאוזנים מוביל לקבוצות גדולות יותר הנדרשות כדי לדמיין באופן מהימן את אופן הפעולה של הקבוצה עם שונות מינימלית. באמצעות פרוטוקול עם חזרות בפגישות מאוזנות, ניתן לצפות לירידה במספר החולדות לשליש מהמספר שיידרש באמצעות בדיקה אחת עם אותו כוח סטטיסטי. בדרך כלל, גדלי מדגם בטווח של 7 עד 15 חולדות (סה"כ) עבור מפגשים מאוזנים ובטווח של 20 עד 50 חולדות (10 עד 25 לכל קבוצה) עבור מושב אחד עם גודל אפקט וכוח שניהם גדולים מ 0.8 מספיקים. הירידה במספר בעלי החיים הדרושים והעלייה במידע שאנו מקבלים מכל בעל חיים באמצעות פרוטוקול זה הן מזקקות את המחקר והן משרתות את עקרונות 3R של שימושים אתיים בבעלי חיים במחקר. חשוב בשלב זה לזכור כי התנהגות חולדה אקראית, אשר אינו מלווה זיכרון חזק, עלול לגרום העדפות חזקות בודדות הן מתחת סיכוי, אבל הממוצע הקבוצתי צריך להניב העדפה לא שונה באופן משמעותי מההזדמנות. יש לפרש נתונים בודדים בקפידה. הפצת נקודות נתונים בודדות בתוך קבוצה יכולה גם להיות אינפורמטיבית לפרשנות תוצאות. כפי שניתן לראות באיור 4 ובאיור 5, ההתפלגות משתנה בהתאם לעוצמת הזיכרון. בסך הכל, הפרוטוקול המוצג כאן ניתן לעקוב בקלות כדי ליישם את משימת מיקום האובייקט עם חזרות למודל זיכרון מרחבי לטווח קצר ו / או לטווח ארוך. פרוטוקול האימון הפשוט והגמישות והאפשרות ליישם מניפולציות נוספות הופכים משימה זו לבחירה פופולרית. שינויים אלה בפרוטוקול מאפשרים חקירה של שלבים מסוימים כגון רכישת זיכרון, איחוד ואחזור.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Open-field/experimental box	O'Hara & Co (Japan)	OF-3001	Open-field box for the object location task
Object 1: cones	O'Hara & Co (Japan)	ORO-RR
Object 2: footballs	O'Hara & Co (Japan)	ORO-RB
Object 3: rectangular blocks	O'Hara & Co (Japan)	ORO-RC	Rectangular blocks were modified after purchase
Object location task apparatus	O'Hara & Co (Japan)	SPP-4501	Sound attenuating box that contains the open-field box for the object location task
Tracking software	O'Hara & Co (Japan)	TimeSSI	For movement tracking and automated camera functions
Wild-type Lister Hooded rats	Charles River	603