Un progetto sperimentale all'interno del soggetto che utilizza un'attività di localizzazione degli oggetti nei ratti

Riepilogo

Questo protocollo fornisce passaggi dettagliati per un'attività di localizzazione dell'oggetto con quattro ripetizioni utilizzando la stessa coorte di ratti. Una codifica debole e forte può produrre memorie a breve e lungo termine. La flessibilità del protocollo con ripetizione può essere utile per gli studi che coinvolgono operazioni chirurgiche risparmiando tempo e lavoro.

Abstract

Il riconoscimento del luogo dell'oggetto è un metodo importante utilizzato per studiare la memoria spaziale nei roditori. Questa memoria di riconoscimento del luogo dell'oggetto costituisce la base dell'attività di posizione dell'oggetto. Questo documento fornisce un ampio protocollo per guidare la creazione di un compito di localizzazione degli oggetti con l'opzione di un massimo di quattro ripetizioni utilizzando la stessa coorte di ratti. Sia i protocolli di codifica deboli che quelli forti possono essere utilizzati per studiare memorie spaziali a breve e lungo termine di diversa forza e per consentire l'implementazione di manipolazioni rilevanti che inibiscono o migliorano la memoria. Inoltre, la ripetizione del test con il controbilanciamento qui presentato consente la combinazione dei risultati di due o più test per il confronto all'interno del soggetto per ridurre la variabilità tra i ratti. Questo metodo aiuta ad aumentare la potenza statistica ed è fortemente raccomandato, in particolare quando si eseguono esperimenti che producono un'elevata variazione nel comportamento individuale. Questo affina direttamente lo studio aumentando i dati ottenuti da ciascun animale e riducendo il numero complessivo di animali necessari. Infine, l'implementazione del compito di localizzazione ripetuta dell'oggetto aumenta l'efficienza degli studi che coinvolgono procedure chirurgiche risparmiando tempo e manodopera.

Introduzione

I compiti di riconoscimento spontaneo(ad esempio, il riconoscimento degli oggetti, il riconoscimento del luogo degli oggetti) sono stati utilizzati in larga misura nello studio della memoria nei roditori. Questi test sono diversi dalla varietà di test utilizzati per valutare la memoria che si basano sul condizionamento della paura o sulla motivazione della ricompensa, in quanto i compiti di riconoscimento spontaneo si basano esclusivamente sul comportamento esplorativo spontaneo verso nuovi stimoli. Questo comportamento, indicato come "preferenza neotica" 1 , è inerente ai^roditoricosì come ad altre specie di mammiferi e ad alcuni non mammiferi come uccelli e pesci². Il riconoscimento del luogo dell'oggetto, che dipende dalla memoria spaziale, può essere osservato utilizzando l'attività di localizzazione dell'oggetto (nota anche come attività di riconoscimento degli oggetti spaziali)³. Studi sulle lesioni hanno dimostrato che il riconoscimento del luogo dell'oggetto richiede un ippocampo intatto^4,5. A causa del protocollo di allenamento relativamente semplice e dell'assenza di qualsiasi rinforzo, questo compito è preferibile in molti studi. L'assenza di rinforzi sia positivi che negativi riduce al minimo i parametri aggiuntivi e le regioni del cervello che potrebbero guidare il comportamento. Quindi, il comportamento qui è neutro e si basa sulla curiosità e sulla memoria spaziale, consentendo l'indagine dei meccanismi coinvolti nella codifica, nel consolidamento e nel recupero della memoria spaziale.

Il protocollo per l'attività di localizzazione degli oggetti consiste in genere in sessioni di assuefazione seguite da una singola sessione di prove di codifica e test, separate da un periodo di ritardo, che varia da diversi minuti a ore. Si raccomanda vivamente che i ratti siano maneggiati in anticipo per ridurre al minimo il livello di stress degli animali e, quindi, il comportamento che potrebbe influenzare la memoria di riconoscimento, come l'avversione verso la novità. Allo stesso modo, un protocollo di assuefazione ben progettato svolge un ruolo essenziale nella prevenzione dello stress che potrebbe ostacolare il comportamento naturale del ratto durante il compito. Tuttavia, l'entità della manipolazione e dell'assuefazione varia in gran parte tra laboratori e sperimentatori, il che può contribuire alla bassa replicabilità^6,7,8. Nella prova di codifica, al ratto viene dato il tempo di esplorare un'arena con due oggetti identici situati in due angoli designati. Nella prova di prova, che viene ritardata di un periodo, al topo viene dato il tempo di esplorare l'arena con la stessa coppia di oggetti, ma questa volta uno di essi è stato spostato in una nuova posizione. La preferenza spontanea esibita dai ratti e il conseguente aumento del tempo trascorso ad esplorare l'oggetto nella nuova posizione sono indicativi del riconoscimento spaziale e della memoria delle posizioni dell'oggetto³. La modifica della prova di codifica (durata e numero di ripetizioni) influenza la forza della memoria.

A seconda dello scopo dello studio, la durata del ritardo tra la codifica e gli studi di prova può essere modificata per modellare la memoria a breve termine indipendente dalla sintesi proteica o la memoria a lungo termine dipendente dalla sintesi proteica. Pertanto, l'attività di localizzazione dell'oggetto può essere utilizzata per un'ampia varietà di studi adattando il protocollo in base alle esigenze. Inoltre, l'implementazione di manipolazioni sperimentali, come interventi farmacologici e optogenetici, sono anche possibili tra questi studi, così come l'imaging in vivo. Esistono diversi studi^9,10 che riportano ripetute iterazioni del compito di localizzazione dell'oggetto all'interno della stessa coorte di ratti. Questo contrasta con l'uso tradizionale in cui un animale ha una sessione senza ripetizioni. Tuttavia, l'efficacia di questi paradigmi non è stata studiata a fondo, né ci sono documenti di metodo che li descrivano. Per quanto ne s knowledge, questa è la prima descrizione riportata di un protocollo che descrive in dettaglio un compito di localizzazione dell'oggetto con un massimo di quattro ripetizioni utilizzando la stessa coorte di ratti, che confronta sistematicamente anche i risultati di ogni ripetizione. Le ripetizioni possono essere utilizzate per controbilanciare le condizioni sperimentali per consentire il confronto all'interno del soggetto con una ridotta variabilità tra i test. La ripetizione affidabile dell'attività consente di mettere in comune i dati, il che significa che è possibile generare una quantità sufficientemente grande di dati utilizzando un numero relativamente piccolo di ratti. Infine, le ripetizioni che utilizzano lo stesso ratto possono essere utili in esperimenti che coinvolgono operazioni chirurgiche e impianti riducendo il numero di ratti richiesti che, di conseguenza, consente di risparmiare tempo e costi di manodopera.

Questo studio presenta un ampio protocollo che descrive in dettaglio come eseguire un compito di localizzazione dell'oggetto nei ratti adulti utilizzando prove di codifica forti e deboli seguite da prove di prova con ritardi di 1 ora e 24 ore. Il protocollo di codifica forte produce memoria di riconoscimento statisticamente significativa quando testato con ritardi di 1 ora e 24 ore e può quindi essere utilizzato per studiare sia le memorie a breve che a lungo termine dopo l'implementazione di manipolazioni per inibire questi ricordi¹¹. Al contrario, il protocollo di codifica debole produce memoria significativa a breve termine solo se testato con un ritardo di 1 ora. L'assenza di memoria a lungo termine può essere utilizzata per studiare manipolazioni per migliorare la conservazione della memoria^11,12. Questo protocollo include anche sessioni dettagliate di gestione e assuefazione, che mirano ad aumentare la replicabilità dell'attività di localizzazione dell'oggetto. Questo documento dimostra anche la ripetizione del compito in quattro contesti distinti con la stessa coorte di ratti utilizzando il protocollo di codifica debole, che è confermato per produrre risultati replicabili e coerenti ogni volta.

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dalle autorità nazionali danesi (numero di licenza: 2018-15-0201-01405) in conformità con le legislazioni danesi e dell'UE sul benessere degli animali.

1. Impostazione sperimentale e preparazione di contesti distinti

1. Arena di posizione degli oggetti con contesto
   NOTA: La configurazione riportata di seguito è dimostrata in una scatola insonorizzata in allegato (Figura 1B) con la sorgente luminosa situata lungo i bordi del soffitto e la telecamera situata al centro del soffitto della scatola. L'arena, 60 cm x 60 cm con pareti alte 100 cm(Figura 1B),è collocata all'interno della scatola ed è completamente isolata dalla stanza circostante. Tutti i segnali spaziali sono all'interno dell'arena. Ciò semplifica il processo di creazione di contesti distinti. Un simile livello di isolamento dalla stanza circostante può essere raggiunto racchiudendo una normale arena a campo aperto con una tenda uniforme attorno alle pareti.
   1. Ottieni un'arena quadrata in plastica dura opaca e non porosa con una larghezza minima di 60 cm e un'altezza minima di 50 cm. Scegli un colore per il pavimento in contrasto con il colore del ratto per registrare con successo i movimenti del ratto dal software automatizzato (se applicabile). Posiziona l'arena all'interno di una scatola (Figura 1B) o su una piattaforma racchiusa da una tenda.
   2. Per creare un contesto, ottenere un secondo strato di pareti inseribili(ad esempio, rivestimento murale realizzato con lo stesso materiale dell'arena o carta da parati in plastica che può essere facilmente pulita) in diversi colori e / o motivi(ad esempio, nero, bianco, strisce o punti). Inserisci il secondo strato di pareti nell'arena in modo che siano distinte l'una dall'altra.
   3. Ottieni segnali spaziali tridimensionali (3D) (1-2 per contesto) con dimensioni variabili tra 10 cm x 10 cm x 5 cm e 20 cm x 15 cm x 15 cm (larghezza x lunghezza x altezza) e hanno (i) forme geometriche distinte e (ii) colori che contrastano il colore della parete. Appenderli alle pareti abbastanza in alto in modo che i ratti non possano raggiungere questi segnali.
   4. Ottieni diverse coppie di oggetti (tanti quanti il numero di contesto) che non sono porosi, non masticabili e facili da pulire. Cerca di avere forme geometriche e trame distinte per ogni nuovo oggetto. Scegli oggetti di larghezza e altezza compresi tra 5 e 15 cm (evita oggetti più alti). Vedere la Figura 1D per esempi di quattro oggetti distinti (coni, palloni da calcio, prismi rettangolari e prismi triangolari).
      NOTA: Ogni oggetto dovrebbe essere di interesse simile ai ratti, in modo che i tempi totali di esplorazione per tutti gli oggetti siano comparabili.
   5. Trova la soluzione migliore per attaccare gli oggetti sul pavimento dell'arena(ad esempio, usando tappetini appiccicosi, nastro biadesivo, attaccando una piastra metallica sotto l'oggetto e un magnete di accoppiamento sotto l'arena ecc.).
   6. Quando crei un altro contesto, ricreare le pareti in modo che contrastino la distribuzione del colore e il motivo delle pareti rispetto ai contesti precedenti. Usa nuovi segnali spaziali 3D che sono diversi e in contrasto con tutti i segnali precedenti. Vedere la Figura 1C per esempi di quattro contesti distinti.
   7. Ottenere una sorgente luminosa che garantisca un'illuminazione diffusa e uguale all'interno dell'arena e che abbia un'opzione dimmer. Regola l'intensità della luce a circa 100-120 lux agli angoli dell'arena dopo aver creato ogni contesto. Procuratevi una macchina fotografica e posizionala al centro del soffitto della scatola.
      NOTA: l'intensità della luce può essere regolata a un livello inferiore se non viene utilizzato un software di punteggio automatico.
2. Bucket di oggetti
   1. Ottenere un secchio (>50 cm di diametro). Non scegliere una forma quadrata per evitare qualsiasi somiglianza con l'arena sperimentale. Riempilo con materiale da letto.
   2. Ottenere 5-10 oggetti di diverse forme e dimensioni (diversi dagli oggetti che verranno utilizzati nell'esperimento) e posizionarli casualmente tutti nel secchio (Figura 1A).

Figura 1: La configurazione sperimentale, inclusi quattro contesti e oggetti distinti. (A) Il bucket di oggetti per l'assuefazione degli oggetti. (B) L'apparato dell'esperimento (a sinistra), che racchiude l'arena di posizione dell'oggetto, la telecamera e la fonte di luce. La casella sperimentale e l'arena prima dell'impostazione del contesto (al centro) e l'arena con l'impostazione del contesto (a destra). (C) Quattro contesti (1-4) con colori e motivi distinti delle pareti, nonché segnali spaziali tridimensionali. (D) Quattro oggetti che vengono utilizzati nei contesti 1-4, rispettivamente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Fotocamera e software di tracciamento (opzionale)
   1. Ottenere un software che può essere utilizzato per controllare a distanza il registratore della telecamera e che può tracciare i nasi dei ratti. Effettuare le regolazioni del software per ogni contesto specifico e ceppo di ratto prima di ogni esperimento.
4. Controbilanciamento delle posizioni degli oggetti e dei gruppi sperimentali
   1. Preparare possibili combinazioni di posizioni di oggetti per la codifica e le prove di test e denominarli come contatori. Creare le combinazioni in modo che coprano tutti gli angoli come posizioni degli oggetti e il movimento degli oggetti da adiacenti agli angoli diagonali e viceversa (Figura 2A).
   2. Preparare un programma per l'esperimento specifico, abbinando ogni ratto in un gruppo sperimentale con un contatore. Utilizzare ogni coppia dei due contatori accoppiati (Figura 2A) all'interno di un gruppo, se ci sono abbastanza ratti. Utilizzare lo stesso set di contatori per entrambi i gruppi sperimentali in una singola sessione di codifica/test (Figura 2B). Riassegnare i contatori per le sessioniseguenti, ovvero ogni nuovo contesto.
      NOTA: eseguire i ratti in un ordine misto durante le sessioni di codifica / test(ad esempio,non eseguire tutti i ratti in una gabbia uno dopo l'altro; invece, ruotare le gabbie per garantire un ambiente calmo all'interno di una gabbia di più di un ratto).
   3. Quando si utilizzano due o più contesti per controbilanciare i gruppi sperimentali(ad esempio, 1-h di memoria contro gruppi di memoria 24-h), assegnare ratti a ciascun gruppo e modificare i gruppi nei seguenti contesti (Figura 2B).

Figura 2: Metodi di controbilanciamento rappresentativi. (A) I possibili orientamenti degli oggetti nell'arena durante le prove di codifica e di prova sono denominati contatori. L'oggetto 1 è sempre l'oggetto in movimento. Ogni due contatori sono controbilanciati in modo tale che la posizione dell'oggetto in movimento cambi. Ogni angolo è occupato due volte e l'oggetto 1 viene spostato dalla diagonale all'adiacente e viceversa per un numero uguale di volte. (B) Esempio di programma di codifica/test per due sessioni controbilanciate(ad esempio, contesti 1 e 2). I ratti sono assegnati a condizioni sperimentali nel contesto 1 (sessione X, a sinistra). Una serie di contro-coppie(cioè 1-2, 3-4, 5-6 e 7-8) vengono selezionate e assegnate a ciascun ratto in un gruppo sperimentale. Lo stesso insieme di contatori è assegnato ai ratti in entrambi i gruppi sperimentali. Nella sessione successiva nel contesto 2 (sessione X+1; a destra), i ratti nei gruppi sperimentali vengono cambiati per il controbilanciamento e viene assegnato un nuovo set di contro-coppie. Va indicato il tempo all'inizio delle prove di codifica e test. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

NOTA: tutte le sessioni di manipolazione, assuefazione e codifica/test in questo protocollo sono state ottimizzate durante la fase di luce di un ciclo luce/buio di 12 ore e, pertanto, si consiglia di eseguire esperimenti durante la fase di luce.

2. Manipolazione e assuefazione

1. Inizia a maneggiare i ratti a partire dallo svezzamento (se i ratti vengono allevati nella struttura di casa) o 2-3 settimane prima dell'inizio degli esperimenti (nel caso in cui i ratti vengano ordinati da una struttura esterna, dopo aver permesso loro di acclimatarsi per una settimana dopo l'arrivo).
2. Trascorri almeno 10-15 minuti su ogni gabbia di 4 ratti per 2 o 3 giorni alla settimana fino a quando i ratti sono a proprio agio nell'essere toccati e raccolti dallo sperimentatore. Regolare il tempo assegnato per gabbia in base al numero di ratti in una gabbia.
   NOTA: È importante che tutti gli sperimentatori che si aspettano di lavorare con i ratti siano presenti durante la manipolazione.
3. Nei casi in cui la manipolazione inizia allo svezzamento, ridurre la manipolazione al minimo (facoltativo) una volta raggiunto questo livello. Se si inizia 2-3 settimane prima degli esperimenti, continuare a maneggiare fino all'inizio delle sessioni di assuefazione.
4. Porta i ratti nelle loro gabbie nella stanza degli esperimenti per abituare i ratti al trasporto e alla stanza sperimentale. Lascia che i ratti si siedano per almeno 30 minuti per dare loro il tempo di calmarsi e abituarsi. Dopo questo tempo, riportare i ratti / gabbie nella stanza di alloggiamento.
   NOTA: il passaggio 2.4 può essere combinato con la manipolazione e ripetuto tutte le volte che è necessario. L'assuefazione aggiuntiva può essere implementata in questa fase se il protocollo include ulteriori manipolazioni(ad esempio, manipolazione per la procedura di iniezioni, ecc.).
5. Eseguire l'assuefazione degli oggetti per abituare i ratti a interagire con gli oggetti e ridurre i livelli di stress generale derivanti dall'esperienza di nuovi ambienti.
   1. Per la sessione 1, porta tutte le gabbie domestiche nella stanza degli esperimenti e lascia che i ratti si abituino alla stanza e si accontentino di almeno 30 minuti. Metti i ratti (2-4 ratti) dalla stessa gabbia insieme nel secchio per 20 minuti. Pulire il secchio rimuovendo qualsiasi materia fecale tra ciascun gruppo di ratti. Ripetere la procedura per tutte le gabbie. Metti tutti i ratti nelle loro gabbie domestiche e torna nella stanza degli alloggi.
   2. Per la sessione 2, in un giorno separato portare tutte le gabbie nella sala esperimenti e lasciare per almeno 30 minuti. Metti ogni topo singolarmente nel secchio per 10 minuti. Rimettete il topo nella gabbia di casa e pulite il secchio dopo ogni ratto. Restituire tutte le gabbie alla stanza di alloggiamento.
   3. Per la sessione 3, ripetere il passaggio 2.5.2 in un giorno separato.
6. Se l'apparato sperimentale è una scatola chiusa (Figura 1B), scegliere di eseguire l'assuefazione a scatola vuota per abituare i ratti al nuovo apparato sperimentale. Nella sessione 4, portare tutte le gabbie nella sala esperimenti e lasciare per almeno 30 minuti. Metti insieme i ratti della stessa gabbia (2-4 ratti) nell'arena vuota senza contesto o segnali spaziali(Figura 1B,al centro) per 20 minuti. Rimetti tutti i ratti nella gabbia di casa e pulisci l'arena con il 70% di etanolo dopo ogni gruppo di ratti.
   NOTA: i passaggi 2.5 e 2.6 devono essere eseguiti in una sola settimana, prima della settimana di assuefazione del contesto (passaggio 2.7; vedere figura 3). Una pausa per un paio di giorni durante questi passaggi è accettabile. Tuttavia, dopo aver iniziato il passaggio 2.7, ogni passaggio deve essere eseguito in giorni consecutivi come specificato, fino alla fine della prova di prova (passaggio 2.9).
7. Eseguire l'assuefazione del contesto per abituare i ratti al contesto e ai segnali 3D, per ridurre i livelli di stress generale e per supportare l'apprendimento spaziale dell'ambiente.
   1. Modificate l'arena vuota per creare il primo contesto come descritto nella sezione 1.1, ma non inserite gli oggetti nell'arena. Preparare l'apparecchiatura di registrazione.
   2. Per la sessione 1, portare tutte le gabbie nella sala esperimenti e lasciare per almeno 30 minuti. Avviare il registratore se lo si esegue manualmente. Posiziona il primo topo al centro dell'arena e consenti al topo di esplorare l'arena per 10 minuti. Quindi, ferma il registratore (se manuale) e rimiponi il topo nella gabbia di casa. Pulire accuratamente l'arena con il 70% di etanolo dopo ogni ratto e riportare tutte le gabbie nella stanza di alloggiamento al termine.
   3. Per le sessioni 2 e 3, ripetere il passaggio 2.7.2 per ciascun ratto per due giorni consecutivi in modo tale che ci siano 3 sessioni di assuefazione al contesto per ratto in totale.
      NOTA: Considera di mescolare l'ordine in cui i ratti entrano nell'arena, specialmente quando si tratta di un grande gruppo. Ciò evita di eseguire ripetutamente ratti specifici alla stessa ora del giorno.

Figura 3: La progettazione dell'esperimento comportamentale, inclusi i protocolli di attività di gestione, assuefazione e localizzazione degli oggetti. I ratti devono essere maneggiati regolarmente a partire da poche settimane prima della settimana di assuefazione. Nella settimana 0, le assuefazione di oggetti e scatole sperimentali vengono eseguite in 4 sessioni con intervalli intermedi di almeno 24 ore. Nella settimana 1, l'assuefazione del contesto viene effettuata su 3 sessioni consecutive con intervalli di 24 ore in mezzo, seguiti da prove di codifica e test. Ci dovrebbe essere un intervallo minimo di 48 ore e fino a 1 settimana prima di procedere con la sessione successiva(ad esempio, iniziare l'assuefazione al contesto successivo nella settimana 2 o 3). Abbreviazione: Hab., habituation. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

8. Versione di prova della codifica (Sessione 4)
   NOTA: In caso di manipolazioni farmacologiche, un tempo ragionevole per somministrare un agente può essere prima o immediatamente dopo la sperimentazione o le prove di codifica e/o prima della prova di prova, a seconda della natura dell'agente farmacologico.
   1. Portare tutte le gabbie nella sala esperimenti e lasciare per almeno 30 minuti. Utilizzando il programma preparato in anticipo(Figura 2B),posizionare la prima coppia identica di oggetti nelle posizioni designate (a 2 angoli e una distanza di >10 cm da ciascuna parete; un pezzo di cartone a forma di L può essere utilizzato per mantenere la stessa distanza ogni volta) utilizzando tappetini appiccicosi o nastro biadesivo.
   2. Avviare il registratore (se manuale). Posiziona il primo topo nell'arena di fronte a un muro o a un angolo che non è occupato da alcun oggetto (uguale distanza a ciascun oggetto).
      NOTA: attenersi alla seguente procedura per la codifica debole o forte.
   3. Per la codifica debole (1 prova),consenti al ratto di esplorare l'arena e gli oggetti per 20 minuti. Quindi, ferma il registratore (se manuale) e rimiponi il topo nella gabbia di casa. Rimuovere gli oggetti e pulire accuratamente sia gli oggetti che l'arena con etanolo al 70%.
   4. Ripetere il passaggio 2.8.3 per tutti i ratti in modo che ogni ratto riceva 1 prova di codifica di 20 minuti.
   5. Per una codifica forte (3 prove),consenti al topo di esplorare l'arena e gli oggetti per 5 minuti. Quindi, ferma il registratore (se manuale) e rimiponi il topo nella gabbia di casa. Non rimuovere gli oggetti. Pulire l'arena e gli oggetti con il 70% di etanolo.
   6. Ripetere il passaggio 2.8.5 altre due volte con lo stesso ratto in modo tale che ci siano 3 prove in totale. Rimettete il topo nella gabbia di casa quando il tempo è finito. Rimuovere gli oggetti per una pulizia accurata e pulire gli oggetti e l'arena con il 70% di etanolo.
      NOTA: L'intervallo tra prove per un ratto deve essere di circa 1-2 minuti.
   7. Ripetere i passaggi 2.8.5-2.8.6 per ogni ratto.
   8. Se il tempo di ritardo è inferiore a 24 ore, tenere le gabbie nella sala esperimenti fino alla prova di prova. In caso contrario, restituire tutte le gabbie alla stanza di alloggiamento una volta completate.
9. Prova di prova (Sessione 4)
   NOTA: il periodo di ritardo deve essere conteggiato dall'inizio della prova di codifica.
   1. In caso di ritardo di 24 ore (o di qualsiasi ritardo che richieda l'esecuzione della prova il giorno successivo), portare tutte le gabbie nella sala esperimenti, lasciando tempo sufficiente prima del primo test in modo che i ratti possano essere lasciati per almeno 30 minuti. In base alla pianificazione, posizionare gli oggetti nelle posizioni designate (uno degli oggetti in una nuova posizione).
   2. Quando è il momento, avvia il registratore (se manuale). Posiziona il primo topo nell'arena di fronte a un muro o a un angolo che non è occupato da alcun oggetto (uguale distanza a ciascun oggetto).
   3. Lascia che il topo esplori l'arena e gli oggetti per 5 minuti. Quindi, arrestare il registratore (se manuale). Rimette il topo nella gabbia di casa. Rimuovere gli oggetti e pulire accuratamente sia gli oggetti che l'arena con etanolo al 70%.
   4. Ripetere i passaggi 2.9.2-2.9.3 per ogni ratto. Riportare tutte le gabbie nella stanza degli alloggi.
      NOTA: in ogni sessione di codifica/test successiva, avviare il protocollo di assuefazione dal passaggio 2.7 (assuefazione del contesto) dopo un intervallo di almeno 48 ore e fino a 1 settimana.

3. Analisi dei dati

1. Per ogni ratto, segna il tempo di esplorazione per ogni oggetto sia nella codifica che nelle prove di test utilizzando un software progettato per questo scopo o utilizzando una configurazione manuale. Prove di codifica dei punteggi per l'intera durata. Prova di punteggio per 2 minuti per le migliori prestazioni di discriminazione³. Se si utilizza il punteggio automatico del software online, esportare i dati di punteggio dal software.
2. Conta il tempo di esplorazione quando il topo è in contatto con l'oggetto, annusando l'oggetto o affrontando l'oggetto a una distanza inferiore a 2 cm. Includi l'arrampicata e la seduta sull'oggetto come esplorazione a meno che l'attenzione del topo non sembri essere da qualche parte diversa dall'oggetto(ad esempio, distogliere lo sconsigliamento dall'oggetto).
3. Calcola il tempo totale di esplorazione per entrambi gli oggetti per ogni ratto. Considera di escludere qualsiasi ratto che abbia un tempo di esplorazione totale inferiore a 10 s nella prova di prova (per un punteggio di 2 minuti) da questo test, in quanto potrebbe riflettere un'esplorazione inaffidabile.
4. Calcola la percentuale di esplorazione per ogni oggetto (equazione 1) o l'indice di discriminazione (DI) per ogni ratto (equazione 2) e calcola i valori medi per i gruppi.
   (1)
   
   NOTA: se % esplorazione è 50% o DI è 0, significa che le prestazioni sono al livello di possibilità e il ratto non ha preferenze per nessuno dei due oggetti. La percentuale media di esplorazione e DI durante le prove di codifica dovrebbe essere rispettivamente ~ 50% o 0. Qualsiasi ratto che mostri una preferenza superiore a [± media (2 × SD)] per uno degli oggetti nella prova di codifica dovrebbe essere escluso dall'analisi del rispettivo test. Ciò consente un'interpretazione affidabile delle preferenze nella prova di prova come memoria della posizione dell'oggetto stabile. Questo valore può essere calcolato per un singolo test o per la codifica combinata dei dati di più test.
5. Analizzare i dati con il metodo che meglio si adatta alla configurazione sperimentale. Utilizzare un t-test acampione per rilevare una preferenza significativa al di sopra del livello di probabilità.
6. Mentre si utilizza più di un contesto con controbilanciamento, combinare i risultati della stessa condizione sperimentale in tutti i contesti.
   NOTA: Ciò si tradurrà in gruppi costituiti dagli stessi ratti, consentendo il confronto all'interno del soggetto utilizzando un t-testaccoppiato per due gruppi e utilizzando l'analisi della varianza a misure ripetute (ANOVA) per più di due gruppi.

Risultati

Di seguito sono riportati i risultati rappresentativi per entrambi i protocolli di codifica forti e deboli descritti utilizzando ratti transgenici maschi tirosina idrossilasi (Th)-Cre¹³ con ceppo Long-Evans retrotrasciato quattro volte al ceppo Lister Hooded e ai ratti Lister Hooded wild-type. I ratti transgenici Th-Cre sono stati utilizzati in quanto questa linea di ratti sarà utilizzata in studi futuri che coinvolgono l'optogenetica. Utilizzando ciascun protocollo, la memoria è stata testata con ritardi di 1 e 24 ore. I test a 1 ora dimostrano la memoria a breve termine, mentre i test a 24 ore dimostrano la memoria a lungo termine. Il valore di esclusione per la preferenza di codifica è stato calcolato come descritto nel protocollo, utilizzando i dati combinati di cinque test (protocolli di codifica forti e deboli) come [50,8% ± (2×10,8%)]. I ratti che avevano una preferenza di codifica al di sopra e al di sotto di questi valori sono stati esclusi dalle analisi dei rispettivi test.

Per esperimenti di codifica forte, sono stati utilizzati 16 ratti e per esperimenti di codifica deboli, sono stati utilizzati 19 ratti. Durante le prove di codifica forte (3 × codifica di 5 minuti; Figura 4A), non c'è stata alcuna preferenza significativa per nessuno dei due oggetti (52,0 ± 1,9%, n = 16, t₁₅ = 1,1, p = 0,29; un campione t-test rispetto al livello di probabilità). Questo forte protocollo di codifica ha portato alla preferenza per l'oggetto nella nuova posizione, come mostrato in termini di percentuale media di esplorazione, che era significativamente superiore al livello di probabilità (50%) nei test con ritardi sia di 1 ora che di 24 ore (memoria di 1 ora, 77,9 ± 2,4%, n = 8, t₇ = 11,8, p < 0,001; memoria di 24 ore, 65,2 ± 5,3%, n = 8, t₇ = 2,8, p = 0,025; un campione t-test rispetto al livello di possibilità). Non c'era alcuna differenza significativa tra 1-h e 24-h di memoria (p = 0,056; spaiato il t-testdi Welch).

Durante le prove di codifica debole (codifica di 20 minuti; risultati raggruppati da quattro contesti; Figura 4B), non c'era alcuna preferenza significativa per nessuno dei due oggetti (51,1 ± 1,0%, n = 66, t₆₅ = 1,2, p = 0,24; un campione t-test rispetto al livello di probabilità). Questo protocollo di codifica debole ha prodotto un aumento significativo della preferenza per l'oggetto nella nuova posizione rispetto al livello di casualità nei test con un ritardo di 1 ora, ma non di 24 ore (dati combinati da tutti e quattro i contesti; memoria da 1 ora, 66,7 ± 2,0%, n = 32, t₃₁ = 8,2, p < 0,001; memoria da 24 ore, 49,6 ± 2,6%, n = 34, t₃₃ = 0,16, p = 0,87; un campione t-test rispetto al livello di possibilità). C'era una differenza significativa tra le prestazioni nei test con ritardi di 1 ora e 24 ore (memoria di 1 ora: n = 32, memoria di 24 ore: n = 34, t_61,5 = 5,2, p < 0,001; t-test di Welch spaiato).

La memoria a livello di gruppo non è stata osservata nel test di ritardo di 24 ore come indicizzato dalle prestazioni a livello casuale, ma ha mostrato variazioni individuali. Questa variazione più elevata per condizioni da deboli a senza memoria(ad esempio,test di 24 ore) è stata comunemente osservata a causa di un'esplorazione più casuale degli oggetti. Quindi, è importante non interpretare le prestazioni dei ratti individualmente. Invece, la distribuzione dei singoli punti dati può essere utilizzata insieme alla media di gruppo come risultato affidabile del test. Più forte è la codifica, più uniforme diventa il comportamento dei ratti e minore è il numero di ratti necessari per raggiungere la significatività statistica, come si può osservare nella Figura 4A per il protocollo di codifica forte. Al contrario, sono necessari gruppi più grandi per ottenere risultati affidabili per condizioni deboli (Figura 4B).

Figura 4: Prestazioni della memoria dopo codifica forte e debole. (A) La prova di codifica forte (codifica 3 × 5 min) seguita da prove di prova di 1 ora o 24 ore. Non c'è stata alcuna preferenza significativa per nessuno dei due oggetti durante le prove di codifica (n = 16). La forte codifica ha prodotto una preferenza significativamente maggiore per l'oggetto nella nuova posizione nei test con ritardi sia di 1 ora che di 24 ore rispetto al livello di casualità (memoria di 1 ora e 24 ore: n = 8 in ciascun gruppo). Non c'era alcuna differenza significativa tra i gruppi. (B) La prova di codifica debole (codifica di 20 minuti) seguita da prove di prova di 1 ora o 24 ore. Non c'era alcuna preferenza significativa per nessuno dei due oggetti come gruppo durante le prove di codifica (n = 66). La codifica debole ha prodotto una preferenza significativamente maggiore per l'oggetto nella nuova posizione nel test con un ritardo di 1 ora, ma non di 24 ore, rispetto al livello di probabilità (memoria di 1 ora: n = 32; memoria di 24 ore: n = 34). C'era una differenza significativa tra le prestazioni nei test con ritardi di 1 ora e 24 ore. I risultati sono stati raggruppati da quattro contesti. I singoli punti dati sono presentati come punti. Tutte le barre mostrano la percentuale di esplorazione dell'oggetto in una nuova posizione come media ± SEM. *p < 0,05, ***p < 0,001; un campione t-testrispetto al livello di probabilità (50%, linea tratteggiata). ^###p < 0,001; ns, non significativi; spaiato il t-test di Welch. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Un vantaggio significativo di questo protocollo stabilito è che può essere eseguito quattro volte utilizzando quattro contesti distinti(Figura 1C)con la stessa coorte di ratti. I risultati mostrati nella Figura 5 dimostrano un possibile modo di utilizzare il controbilanciamento con due gruppi sperimentali (gruppi di memoria 1-h e 24-h). I due gruppi sono stati controbilanciati su due contesti (contesti 1 e 2), e questo è stato ripetuto in due contesti aggiuntivi (contesti 3 e 4; Figura 5A). I risultati dei quattro contesti sono presentati singolarmente in Figura 5B,D,dove la memoria per ciascun gruppo sperimentale è stata valutata confrontando la preferenza al livello di casualità in ciascun contesto (memoria 1-h: Contesto 1, 69,9 ± 3,6%, n = 9, t₈ = 5,5, p < 0,001; Contesto 2, 65,6 ± 3,9%, n = 9, t₈ = 4,0, p = 0,004; Contesto 3, 65,2 ± 3,8%, n = 7, t₆ = 4,0, p = 0,007; Contesto 4, 65,3 ± 5,6%, n = 7, t₆ = 2,7, p = 0,035; Memoria 24 ore: Contesto 1, 45,1 ± 6,4%, n = 9, t₈ = 0,77, p = 0,46; Contesto 2, 49,1 ± 4,9%, n = 9, t₈ = 0,18, p = 0,86; Contesto 3, 57,2 ± 4,1%, n = 8, t₇ = 1,7, p = 0,12; Contesto 4, 47,6 ± 4,7%, n = 8, t₇ = 0,52, p = 0,62; un campione t-test rispetto al livello di possibilità).

Nei contesti 1, 2 e 4, il confronto tra soggetti dei gruppi ha rivelato differenze significative tra memoria 1-h e 24-h (memoria 1-h contro memoria 24-h: Contesto 1, t_12.7 = 3.4, p = 0.005; Contesto 2, t_15.2 = 2.6, p = 0.019; Contesto 3, t_13.0 = 1.4, p = 0.17; Contesto 4, t_12.2 = 2.4, p = 0.032; spaiato diWelch t -test). Per una migliore rappresentazione e confronto all'interno del soggetto dei dati, sono stati combinati i risultati di due contesti controbilanciati (Figura 5C,E). I gruppi sperimentali combinati sono stati nuovamente confrontati individualmente a livello di probabilità (Contesti 1 e 2 combinati: memoria 1-h, 67,8 ± 2,6%, n = 18, t₁₇ = 6,7, p < 0,001; memoria 24 ore, 47,1 ± 3,9%, n = 18, t₁₇ = 0,74, p = 0,47; Contesti 3 e 4 combinati: memoria 1-h, 65,3 ± 3,3%, n = 14, t₁₃ = 4,7, p < 0,001; Memoria 24 ore, 52,4 ± 3,2%, n = 16, t₁₅ = 0,73, p = 0,48; un campione t-test rispetto al livello di possibilità). Quindi, i gruppi sperimentali sono stati confrontati tra loro.

In entrambe le coppie di contesti, c'erano differenze significative tra i gruppi come rivelato dai confronti all'interno del soggetto (memoria 1-h contro memoria 24-h: Contesti 1 e 2 combinati, t₁₆ = 3,5, p = 0,003; Contesti 3 e 4 combinati, t₁₃ = 2,4, p = 0,032; accoppiato t-test). Risultati comparabili sono stati ottenuti anche con ratti selvatici Lister Hooded, nel protocollo di codifica debole utilizzando i contesti 1 e 4 per le due sessioni controbilanciate (dati non mostrati). La replicabilità e l'affidabilità dei risultati sono state convalidate confrontando ciascun set di dati utilizzando ANOVA unidirezionale. Non è stata rilevata alcuna differenza significativa tra i quattro contesti (memoria 1-h: F_3,28 = 0,31, p = 0,81; memoria 24-h: F_3,30 = 0,99, p = 0,41). Pertanto, il test della posizione dell'oggetto può essere ripetuto in modo affidabile con un'influenza minima di ripetizioni, dato che vengono seguite le istruzioni in questo protocollo.

Figura 5: Diversi modi di presentare e analizzare i risultati del protocollo di codifica debole con due gruppi sperimentali controbilanciati in due sessioni. (A) Il disegno sperimentale per il controbilanciamento con due gruppi sperimentali (gruppi di memoria 1-h e 24-h) su due sessioni (contesti 1 e 2). Il controbilanciamento è stato ripetuto in due sessioni aggiuntive (contesti 3 e 4). (B e D) I risultati di ciascun contesto e dei gruppi sperimentali sono stati confrontati individualmente a livello casuale e tra loro. In tutti e quattro i contesti, la preferenza per l'oggetto nella nuova posizione nei test con un ritardo di 1 ora è stata significativamente aumentata rispetto al livello di probabilità [Contesto 1 e 2: n = 9 per gruppo (B); Contesto 3 e 4: n = 7 per gruppo (D)]. Nei test di ritardo di 24 ore, la preferenza per l'oggetto nella nuova posizione non differiva dal caso (Contesto 1 e 2: n = 9 per gruppo; Contesto 3 e 4: n = 8 per gruppo). C'era una differenza significativa tra le preferenze dei gruppi sperimentali nei contesti 1, 2 e 4, ma non nel contesto 3, come rivelato dal confronto tra soggetti. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; un campione t-testrispetto al livello di probabilità (50%, linea tratteggiata). ^#p < 0,05; ^##p < 0,01; ns, non significativi; spaiato il t-test di Welch. (C ed E) I risultati sono presentati dopo aver combinato i gruppi sperimentali dei due contesti controbilanciati [Contesti 1 e 2 combinati, n = 17 per gruppo (C); Contesti 3 e 4 combinati, n = 14 per gruppo (E)]. La preferenza per l'oggetto nella nuova posizione è stata significativamente aumentata rispetto al livello di probabilità nei test con un ritardo di 1 ora, ma non di 24 ore, in entrambe le coppie di contesti. Il confronto all'interno del soggetto dei gruppi sperimentali ha rivelato differenze significative tra le preferenze per l'oggetto nella nuova posizione in test con ritardi di 1 ora e 24 ore in entrambe le coppie di contesti. p < 0,001; un campione t-testrispetto al livello di probabilità (50%, linea tratteggiata). ^#p < 0,05, ^##p < 0,01; accoppiato t-test. I singoli punti dati sono presentati come punti. Tutte le barre mostrano la percentuale di esplorazione dell'oggetto nella nuova posizione come media ± SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

L'attività di localizzazione dell'oggetto può essere utilizzata in una varietà di studi per studiare la memoria spaziale come descritto in precedenza. La flessibilità della configurazione consente la modellazione di memorie a breve e lungo termine di diversi punti di forza e può essere facilmente implementata a basso costo. Tuttavia, poiché ci sono molti parametri nel protocollo che possono influenzare i risultati e diversi studi variano leggermente in questi parametri⁶, si potrebbero incontrare difficoltà nell'implementare con successo l'attività per la prima volta. Il protocollo di cui sopra ha lo scopo di guidare i lettori attraverso questo processo senza intoppi. Ulteriori passaggi cruciali che potrebbero essere significativi per il successo dell'implementazione dell'attività con elevata replicabilità saranno discussi di seguito.

Sebbene la sessione di codifica / test sia spesso al centro dell'attenzione durante l'esecuzione di esperimenti di localizzazione degli oggetti, i protocolli di manipolazione e assuefazione hanno un profondo effetto sull'esito di questo tipo di test comportamentali in cui il risultato dipende dal comportamento naturale indisturbato del ratto^14,15. Pertanto, i passaggi che precedono la sessione di codifica / test devono essere progettati con cautela, in quanto possono influenzare il comportamento e la memoria dei ratti e, di conseguenza, influenzare i risultati finali. Un buon livello di manipolazione e assuefazione in modo tale che i ratti acquisiscano familiarità con lo sperimentatore e il compito ridurrà al minimo l'effetto dei fattori di stress aumentando al contempo la probabilità di esibire un comportamento naturale⁸. Come menzionato nel protocollo, la manipolazione può iniziare già dallo svezzamento dei cuccioli se il ceppo di ratto viene mantenuto nella struttura domestica. Sulla base dell'esperienza precedente (dati non mostrati) e da quella di diversi studi precedenti^16,17,questa gestione precoce si traduce in bassa ansia e maggiore curiosità nei mesi successivi.

Poiché il compito di localizzazione dell'oggetto dipende esclusivamente dalla spinta esplorativa intrinseca dei ratti, il comportamento atteso può essere facilmente ostacolato se i ratti non sono desiderosi di esplorare o riluttanti ad avvicinarsi alla novità, che viene definita "comportamento neofobico"¹. Pertanto, si consiglia vivamente di includere un protocollo di manipolazione e assuefazione approfondito in base alle esigenze specifiche dello studio. Questo protocollo può essere utilizzato come guida minima ai requisiti e possono essere implementati ulteriori passaggi(ad esempio,se lo studio deve includere iniezioni in una fase successiva, è necessaria l'assuefazione alle procedure di iniezione e la posizione di tenuta specifica). Il ceppo e l'età dei ratti sperimentali sono altri due fattori influenti e dovrebbero essere considerati prima di pianificare un esperimento per evitare risultati non ottimali. Diversi ceppi di ratto possono avere comportamenti diversi e livelli di ansia basale^18,19,20 e, pertanto, può essere necessario un aggiustamento specifico al protocollo a seconda del ceppo utilizzato.

Questo protocollo ha confermato di funzionare bene con ratti transgenici Th-Cre con ceppo Long-Evans incrociato quattro volte al ceppo Lister Hooded e ai ratti Lister Hooded wild-type. Un'età di inizio logicamente ideale per i ratti negli esperimenti comportamentali è di circa 12 settimane²⁰, ma la variabilità tra ceppi e i requisiti specifici del compito dovrebbero essere spiegati. Potrebbe anche essere possibile utilizzare ratti in via di sviluppo se è di interesse per lo studio, anche se potrebbero essere necessari adeguamenti al protocollo e non sono trattati qui. Tuttavia, è importante considerare se il ratto a una determinata età ha sviluppato le funzioni cognitive necessarie per svolgere con successo questo compito. Uno studio²¹ che indaga su questo ha riportato che solo i ratti adolescenti al giorno 38 postnatale e non prima, hanno mostrato una memoria spaziale allocentrica riflessa nella preferenza per l'oggetto nella nuova posizione, come osservato nei ratti adulti. Il protocollo qui presentato ha avuto successo utilizzando ratti che avevano 15-16 settimane all'inizio della prima sessione di codifica / test. In precedenza, lo stesso forte protocollo di codifica produceva risultati da subottimali a negativi quando si utilizzavano ratti di 23 settimane che non avevano raggiunto il livello ottimale di assuefazione a causa della mancanza di manipolazione e assuefazione a un'età abbastanza giovane. Questi ratti non sono riusciti a comportarsi in modo diverso dal livello casuale o, di fatto, hanno mostrato avversione verso la novità osservata in termini di preferenza per gli oggetti stabili anziché per gli oggetti spostati (dati non mostrati). Questi risultati forniscono la prova che l'età e i tempi dell'assuefazione di manipolazione possono avere un impatto sull'efficacia dell'assuefazione e, di conseguenza, contribuire all'osservazione del comportamento ansioso e neofobico nei test.

Qui vengono delineati due diversi protocolli, che garantiscono una codifica forte o debole nell'attività di localizzazione dell'oggetto. Durante l'istituzione di questi protocolli, è stato osservato che l'interesse per gli oggetti è diminuito dopo 5-10 minuti di esplorazione durante singole prove lunghe(ad esempio, codifica di 20 minuti) e i ratti alla fine hanno smesso di esplorare. Ciò si traduce in una memoria più debole delle posizioni degli oggetti. Un protocollo di codifica che interlascia le prove di codifica con brevi periodi di riposo(ad esempio, codifica 3 x 5 minuti) supera questo e porta a un'esplorazione elevata durante le prove. Pertanto, il tempo di esplorazione attivo e il diverso layout di questi due protocolli di codifica influenzano la forza della memoria, che è più forte dopo una codifica di 3 x 5 minuti rispetto a dopo i protocolli di codifica di 20 minuti. Risultati simili possono anche essere ottenuti utilizzando durate leggermente diverse con protocolli di prova singola rispetto a protocolli di prova interlacciati e possono essere apportate modifiche per soddisfare le esigenze dello studio e del ceppo di ratto.

A differenza dei protocolli che utilizzano un semplice campo aperto bianco con solo segnali esterni nella stanza, il protocollo presentato qui utilizza un'arena con contesti distinti e segnali intra-labirinto che probabilmente richiedono più tempo per imparare. Pertanto, si raccomanda l'aggiunta di una fase di assuefazione del contesto nel protocollo prima della prova di codifica. Ciò consentirà ai ratti di formare una mappa spaziale di ciascun contesto durante l'assuefazione e ridurre la durata della successiva prova di codifica, poiché i ratti dovranno solo codificare le posizioni degli oggetti in relazione a questa mappa. Inoltre, l'assuefazione del contesto consentirà ai ratti di abituarsi a qualsiasi possibile distrattore all'interno di ciascun contesto, come i segnali spaziali 3D, riducendo al minimo i comportamenti diversi dall'esplorazione degli oggetti nella sessione di codifica / test da seguire. Con l'implementazione di un metodo di controbilanciamento completo composto da diversi livelli(cioè una vasta gamma di combinazioni di posizione degli oggetti (contatori) e direzione dello spostamento dell'oggetto), le preferenze indesiderate che possono aumentare a causa delle variazioni dell'intensità della luce e dei colori / motivi delle pareti agli angoli dell'arena sono ridotte al minimo.

Diversi fattori dovrebbero essere considerati quando si ripete l'attività per aumentare la replicabilità tra le sessioni di codifica / test e ridurre al minimo l'influenza della ripetizione. In primo luogo, i contesti distinti (tanto quanto il numero di ripetizioni di sessioni di codifica / test) devono essere progettati per evitare l'accumulo di memoria spaziale che potrebbe essere causato dall'esecuzione delle sessioni ripetute utilizzando lo stesso contesto. Per raggiungere questo obiettivo, è stato utilizzato un apparecchio con pareti sostituibili di diversi colori e motivi (Figura 1B, C). Le pareti distinte e gli oggetti 3D (come giocattoli o piccoli oggetti di uso quotidiano di colori e forme distinte, vedi protocollo e Figura 1C)appesi alle pareti sono i segnali spaziali e i punti di riferimento che i ratti potenzialmente usano per imparare le posizioni degli oggetti in relazione ai loro contesti. Nel caso in cui un test non riesca a produrre la preferenza per l'oggetto spostato, è possibile prendere in considerazione la modifica di questi parametri del contesto (design della parete e segnali spaziali). In alternativa, un'arena di forma rettangolare o circolare può essere utilizzata per le attività di localizzazione degli oggetti invece di un'arena quadrata come in questo protocollo. Le arene circolari sono segnalate per eliminare le preferenze d'angolo²² che si osservano spesso nelle arene con angoli e, quindi, può essere utile quando si tratta di un ceppo di ratto o topo particolarmente ansioso. Mentre i requisiti per la creazione di quattro contesti distinti in questo protocollo funzionano in modo ottimale con una forma quadrangolare, un'arena circolare può anche essere resa funzionale dopo alcune regolazioni.

In secondo luogo, gli intervalli tra ogni sessione di codifica / test dovrebbero essere determinati in modo tale che i ratti mantengano lo stesso livello di interesse ogni volta, evitando al contempo il rischio di apprendimento cumulativo derivante da un denso programma di ripetizioni. Di solito, è sufficiente un intervallo di almeno il doppio della lunghezza del tempo di ritardo tra la codifica e le prove di prova, con intervalli più lunghi più favorevoli per più di due ripetizioni. Ciò significa che, mentre un intervallo minimo di 48 ore dopo un test di 24 ore è sufficiente per una o due ripetizioni, l'uso di un intervallo di 1 settimana è raccomandato per quattro ripetizioni. Come mostrano i risultati nella Figura 5 e il confronto con ANOVA, l'attività può essere ripetuta con successo quattro volte. Sulla base di questo, il protocollo stabilito può essere utilizzato per controbilanciare fino a quattro condizioni sperimentali. Il numero di gruppi sperimentali determina il numero di ripetizioni di sessioni di codifica/sperimentazione in contesti distinti. I risultati nella Figura 5 rappresentano un possibile modo di utilizzare il protocollo con due gruppi sperimentali. I gruppi sono stati controbilanciati in due sessioni e le stesse condizioni sono state ripetute in due sessioni aggiuntive (a scopo di convalida). La seconda serie di sessioni controbilanciate potrebbe anche essere utilizzata per controbilanciare nuove condizioni. Allo stesso modo, tre o quattro condizioni sperimentali possono essere confrontate utilizzando tre o quattro sessioni controbilanciate, rispettivamente.

In questi casi, i contesti dovrebbero essere progettati per adattarsi alle caratteristiche contrastanti descritte nel protocollo. È interessante notare che il design controbilanciato potrebbe non essere adatto per esperimenti in cui devono essere utilizzate ulteriori manipolazioni, come un intervento farmacologico che potrebbe lasciare un effetto o un danno di lunga durata. Per mantenere l'efficacia e la replicabilità dei test, l'esperimento dovrebbe essere progettato di conseguenza. I dati provenienti da test ripetuti possono essere presentati e analizzati in diversi modi, come dimostrato nella Figura 5. Per un'analisi iniziale, i gruppi sperimentali in ciascun contesto possono essere confrontati individualmente a livello di casualità utilizzando un t-testdi un campione per determinare qualsiasi preferenza significativa (Figura 5B,D). Questo può essere utile per ottenere una rapida comprensione dei dati, ma garantisce solo un confronto indiretto dei gruppi. Quindi, per confrontare due o più gruppi, i dati dovrebbero essere analizzati utilizzando rispettivamente t-test a due campioni (accoppiati o spaiati) o ANOVA. Questo può essere sotto forma di confronto tra soggetti dei gruppi all'interno di una singola sessione di codifica/ test(Figura 4A e Figura 5B,D)o confronto all'interno del soggetto dei gruppi da due (o più) contesti controbilanciati ( Figura5C,E). Quest'ultimo metodo è fortemente raccomandato, soprattutto quando si tratta di condizioni di memoria deboli, che, come spiegato in precedenza, si traduce in un'elevata varianza dovuta alla casualità nel comportamento.

La combinazione dei contesti controbilanciati porta a gruppi più grandi che sono necessari per visualizzare in modo affidabile il comportamento del gruppo con variazioni minime. Utilizzando un protocollo con ripetizioni in sessioni controbilanciate, ci si può aspettare una diminuzione del numero di ratti a circa un terzo del numero che sarebbe richiesto utilizzando un singolo test con la stessa potenza statistica. Di solito, le dimensioni del campione in un intervallo da 7 a 15 ratti (totale) per sessioni controbilanciate e in un intervallo da 20 a 50 ratti (da 10 a 25 per gruppo) per una singola sessione con una dimensione dell'effetto e una potenza entrambe superiori a 0,8 sono sufficienti. La diminuzione del numero di animali necessari e l'aumento delle informazioni che otteniamo da ciascun animale utilizzando questo protocollo affina lo studio e serve i principi 3R degli usi etici degli animali nella ricerca. È importante in questa fase tenere presente che il comportamento casuale del ratto, che non è accompagnato da una memoria forte, può comportare preferenze individuali forti sia al di sotto che al di sopra del caso, ma la media del gruppo dovrebbe produrre una preferenza non significativamente diversa dal caso. I dati individuali devono essere interpretati con attenzione. La distribuzione di singoli punti dati all'interno di un gruppo può anche essere informativa per interpretare i risultati. Come si vede nella Figura 4 e nella Figura 5, la distribuzione cambia a seconda della forza della memoria. Nel complesso, il protocollo qui presentato può essere seguito facilmente per implementare il compito di localizzazione dell'oggetto con ripetizioni per modellare la memoria spaziale a breve e / o lungo termine. Il protocollo di formazione semplice e flessibile e la possibilità di implementare ulteriori manipolazioni rendono questo compito una scelta popolare. Queste modifiche al protocollo consentono l'analisi di passaggi particolari come l'acquisizione della memoria, il consolidamento e il richiamo.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Open-field/experimental box	O'Hara & Co (Japan)	OF-3001	Open-field box for the object location task
Object 1: cones	O'Hara & Co (Japan)	ORO-RR
Object 2: footballs	O'Hara & Co (Japan)	ORO-RB
Object 3: rectangular blocks	O'Hara & Co (Japan)	ORO-RC	Rectangular blocks were modified after purchase
Object location task apparatus	O'Hara & Co (Japan)	SPP-4501	Sound attenuating box that contains the open-field box for the object location task
Tracking software	O'Hara & Co (Japan)	TimeSSI	For movement tracking and automated camera functions
Wild-type Lister Hooded rats	Charles River	603