Внутритемисный экспериментальный проект с использованием задачи определения местоположения объекта у крыс

Резюме

Этот протокол предоставляет подробные шаги для задачи определения местоположения объекта с четырьмя повторениями с использованием одной и той же когорты крыс. Слабое и сильное кодирование может привести к краткосрочным и долгосрочным воспоминаниям. Гибкость протокола с повторением может быть полезна для исследований, связанных с хирургическими операциями, экономя время и труд.

Аннотация

Распознавание места объекта является выдающимся методом, используемым для исследования пространственной памяти у грызунов. Эта память распознавания места объекта составляет основу задачи определения местоположения объекта. В этой статье представлен обширный протокол для руководства созданием задачи определения местоположения объекта с возможностью до четырех повторений с использованием одной и той же когорты крыс. Как слабые, так и сильные протоколы кодирования могут использоваться для изучения краткосрочных и долгосрочных пространственных воспоминаний различной силы и для реализации соответствующих манипуляций, ингибирующих или улучшающих память. Кроме того, повторение теста с представленным здесь противовесом позволяет комбинировать результаты двух или более тестов для сравнения внутри субъекта для снижения изменчивости между крысами. Этот метод помогает увеличить статистическую мощность и настоятельно рекомендуется, особенно при проведении экспериментов, которые приводят к высоким вариациям в индивидуальном поведении. Это напрямую уточняет исследование, увеличивая данные, полученные от каждого животного, и уменьшая общее количество необходимых животных. Наконец, выполнение задачи повторного определения местоположения объекта повышает эффективность исследований, связанных с хирургическими процедурами, за счет экономии времени и труда.

Введение

Задачи спонтанного распознавания(например, распознавание объектов, распознавание места объекта) в значительной степени использовались при исследовании памяти у грызунов. Эти тесты отличаются от множества тестов, используемых для оценки памяти, которые основаны либо на обусловливания страха, либо на мотивации вознаграждения, в том, что спонтанные задачи распознавания основаны исключительно на спонтанном исследовательском поведении по отношению к новым стимулам. Это поведение, называемое «неотическим предпочтением»^1,присуще грызунам, а также другим видам млекопитающих и некоторым не млекопитающим, таким как птицы и рыбы^2. Распознавание места объекта, которое зависит от пространственной памяти, можно наблюдать с помощью задачи определения местоположения объекта (также известной как задача распознавания пространственных объектов)³. Исследования поражений показали, что для распознавания места объекта требуется неповрежденный гиппокамп^4,5. Из-за относительно простого протокола обучения и отсутствия какого-либо подкрепления эта задача предпочтительнее во многих исследованиях. Отсутствие как положительного, так и отрицательного подкрепления сводит к минимуму дополнительные параметры и области мозга, которые могут управлять поведением. Следовательно, поведение здесь нейтрально и основано на любопытстве и пространственной памяти, что позволяет исследуть механизмы, которые участвуют в кодировании, консолидации и извлечении пространственной памяти.

Протокол для задачи определения местоположения объекта обычно состоит из сеансов привыкания, за которыми следует один сеанс кодирования и тестовых испытаний, разделенных периодом задержки, который варьируется от нескольких минут до часов. Настоятельно рекомендуется, чтобы крысы обрабатывались заранее, чтобы свести к минимуму уровень стресса животных и, следовательно, поведение, которое может повлиять на память распознавания, такое как отвращение к новизне. Точно так же хорошо разработанный протокол привыкания играет важную роль в предотвращении стресса, который может помешать естественному поведению крысы во время выполнения задачи. Однако степень обработки и привыкания в значительной степени варьируется между лабораториями и экспериментаторами, что может способствовать низкой воспроизводимости^6,7,8. В испытании кодирования крысе дается время для исследования арены с двумя идентичными объектами, расположенными в двух обозначенных углах. В тестовом испытании, которое задерживается на период, крысе дается время для изучения арены с той же парой объектов, но на этот раз один из них был перемещен в новое место. Спонтанное предпочтение, проявляемое крысами, и, как следствие, увеличение времени, затрачиваемого на изучение объекта в новом месте, свидетельствуют о пространственном распознавании и памяти местоположений объекта^3. Модификация пробы кодирования (продолжительность и количество повторений) влияет на прочность памяти.

В зависимости от цели исследования продолжительность задержки между кодированием и тестовыми испытаниями может быть изменена для моделирования белково-синтез-независимой кратковременной памяти или белково-синтез-зависимой долговременной памяти. Следовательно, задача определения местоположения объекта может быть использована для широкого спектра исследований путем адаптации протокола по мере необходимости. Кроме того, между этими испытаниями также возможно осуществление экспериментальных манипуляций, таких как фармакологические и оптогенетические вмешательства, как и визуализация in vivo. Есть несколько исследований^9,10, которые сообщают о повторных итерациях задачи определения местоположения объекта в одной и той же когорте крыс. Это контрастирует с традиционным использованием, в котором одно животное имеет один сеанс без повторений. Тем не менее, эффективность этих парадигм не была тщательно исследована, и нет никаких методических работ, описывающих их. Насколько нам известно, это первое описание протокола, который подробно описывает задачу определения местоположения объекта с использованием одной и той же когорты крыс, которая также систематически сравнивает результаты каждого повторения. Повторения могут быть использованы для уравновешивания экспериментальных условий, чтобы обеспечить сравнение внутри субъекта с уменьшенной изменчивостью между тестами. Надежное повторение задачи позволяет объединять данные, а это означает, что достаточно большой объем данных может быть сгенерирован с использованием относительно небольшого числа крыс. Наконец, повторения с использованием одной и той же крысы могут быть полезны в экспериментах, связанных с хирургическими операциями и имплантацией, за счет снижения количества необходимых крыс, что, следовательно, экономит время и затраты на рабочую силу.

В этом исследовании представлен обширный протокол, подробно описывающий, как выполнить задачу определения местоположения объекта у взрослых крыс с использованием сильных и слабых испытаний кодирования, за которыми следуют тестовые испытания с задержками 1 и 24 ч. Сильный протокол кодирования создает статистически значимую память распознавания при тестировании с задержками 1-ч и 24-ч и, таким образом, может быть использован для изучения как краткосрочных, так и долгосрочных воспоминаний при осуществлении манипуляций для ингибирования этих воспоминаний^11. Напротив, слабый протокол кодирования создает значительную кратковременную память только при тестировании с задержкой 1 ч. Отсутствие долговременной памяти может быть использовано для изучения манипуляций по усилению удержания памяти^11,12. Этот протокол также включает в себя подробные сеансы обработки и привыкания, которые направлены на повышение воспроизводимости задачи определения местоположения объекта. Эта статья также демонстрирует повторение задачи в четырех различных контекстах с одной и той же когортой крыс, использующих протокол слабого кодирования, который, как подтверждается, каждый раз дает воспроизводимые и последовательные результаты.

протокол

Все методы, описанные здесь, были одобрены датскими национальными властями (номер лицензии: 2018-15-0201-01405) в соответствии с законодательством Дании и ЕС о защите животных.

1. Экспериментальная установка и подготовка различных контекстов

1. Арена расположения объекта с контекстом
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенная ниже установка демонстрируется в закрытой звуконепроницаемойкоробке (рисунок 1B)с источником света, расположенным по краям потолка, и камерой, расположенной в центре потолка коробки. Арена, 60 см х 60 см со стенами высотой 100 см(рисунок 1B),размещена внутри коробки и полностью изолирована от окружающего помещения. Все пространственные сигналы находятся внутри арены. Это упрощает процесс создания различных контекстов. Аналогичного уровня изоляции от окружающего помещения можно добиться, оградив обычную арену открытого поля равномерной занавеской вокруг стен.
   1. Получите квадратную арену из непрозрачного, непористого твердого пластика с шириной не менее 60 см и высотой не менее 50 см. Выберите цвет пола, контрастирующий с цветом крысы для успешной записи движений крысы автоматизированным программным обеспечением (если применимо). Поместите арену либо внутри коробки(рисунок 1B),либо на платформу, которая закрыта занавеской.
   2. Чтобы создать контекст, получите второй слой вставляемых стен(например, настенное покрытие из того же материала, что и арена, или пластиковые обои, которые можно легко очистить) в разных цветах и / или узорах(например, черный, белый, полосы или точки). Вставьте второй слой стен в манеже так, чтобы они отличались друг от друга.
   3. Получите трехмерные (3D) пространственные подсказки (1-2 в контексте) с размерами, варьирующимися между 10 см x 10 см x 5 см и 20 см x 15 см x 15 см (ширина x длина x высота) и имеющие (i) различные геометрические формы и (ii) цвета, которые контрастируют с цветом стены. Повесьте их на стены достаточно высоко, чтобы крысы не могли добраться до этих сигналов.
   4. Получите различные пары объектов (столько же, сколько контекстного номера), которые являются непористыми, непережеваемыми и легко очищаемыми. Стремитесь иметь различные геометрические формы и текстуры для каждого нового объекта. Выбирайте объекты шириной и высотой от 5 до 15 см (избегайте более высоких объектов). Примеры четырех различных объектов (конусы, футбольные мячи, прямоугольные призмы и треугольные призмы) см. на рисунке 1D.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый объект должен представлять схожий интерес для крыс, чтобы общее время исследования для всех объектов было сопоставимым.
   5. Найдите лучшее решение для крепления объектов на полу арены(например, с помощью липких ковриков, двусторонней ленты, прикрепления металлической пластины под объектом и спаривного магнита под ареной и т. Д.).
   6. При создании другого контекста воссоздайте стены таким образом, чтобы они контрастируют с распределением цвета и рисунка стен от предыдущего контекста (контекстов). Используйте новые 3D-пространственные подсказки, которые отличаются от всех предыдущих сигналов и контрастируют с другими. См. рисунок 1С для примеров четырех различных контекстов.
   7. Получите источник света, который обеспечит рассеянное и равное освещение на арене и который имеет опцию диммера. Отрегулируйте интенсивность света примерно до 100-120 люкс в углах арены после создания каждого контекста. Достать фотоаппарат и поместить его в центр потолка коробки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность света может быть отрегулирована до более низкого уровня, если не используется автоматизированное программное обеспечение для оценки.
2. Корзина объектов
   1. Получите ведро (диаметром >50 см). Не выбирайте квадратную форму, чтобы избежать какого-либо сходства с экспериментальной ареной. Заполните его постельным материалом.
   2. Получите 5-10 объектов разных форм и размеров (отличных от объектов, которые будут использоваться в эксперименте) и случайным образом поместите их все в корзину(рисунок 1А).

Рисунок 1:Экспериментальная установка, включаемая четыре различных контекста и объекта. (A) Корзина объектов для привыкания объектов. (B) Экспериментальный аппарат (слева), охватывающий арену местоположения объекта, камеру и источник света. Экспериментальная коробка и арена перед настройкой контекста (посередине) и арена с настройкой контекста (справа). (C) Четыре контекста (1-4) с различными цветами и узорами стен, а также трехмерными пространственными сигналами. (D) Четыре объекта, которые используются в контекстах 1-4 соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Камера и программное обеспечение для отслеживания (опционально)
   1. Получите программное обеспечение, которое можно использовать для удаленного управления регистратором камеры и которое может отслеживать крысиные носы. Внесите программные коррективы для каждого конкретного контекста и штамма крыс перед каждым экспериментом.
4. Уравновешивание местоположений объектов и экспериментальных групп
   1. Подготовьте возможные комбинации местоположений объектов для кодирования и тестовых испытаний и назовите их счетчиками. Создайте комбинации таким образом, чтобы они охватывали все углы как расположения объектов, так и перемещение объекта от смежных к диагональным углам и наоборот (рисунок 2А).
   2. Подготовьте расписание для конкретного эксперимента, сопоставив каждую крысу в одной экспериментальной группе со счетчиком. Используйте каждую пару из двух парных счетчиков(рисунок 2A)в пределах одной группы, если крыс достаточно. Используйте один и тот же набор счетчиков для обеих экспериментальных групп в одном сеансе кодирования/тестирования(рисунок 2B). Переназначьте счетчики для следующих сеансов(т. е. для каждого нового контекста).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Запускайте крыс в смешанном порядке во время сеансов кодирования / тестирования(например,не запускайте всех крыс в одной клетке одну за другой; вместо этого вращайте клетки, чтобы обеспечить спокойную обстановку в клетке более чем одной крысы).
   3. При использовании двух или более контекстов для уравновешиния экспериментальных групп(например, 1-h памяти против 24-h групп памяти), назначьте крыс каждой группе и измените группы в следующих контекстах(рисунок 2B).

Рисунок 2:Репрезентативные методы уравновешивания. (A) Возможные ориентации объектов на арене при кодировании и тестовых испытаниях называются счетчиками. Объект 1 всегда является движущимся объектом. Каждые два счетчика уравновешиваются таким образом, что местоположение движущегося объекта изменяется. Каждый угол занят дважды, а объект 1 перемещается от диагонали к соседней и наоборот на равное количество раз. (B)Пример расписания кодирования/тестирования для двух уравновешенных сессий(например, контексты 1 и 2). Крысы назначаются к экспериментальным условиям в контексте 1 (сеанс X, слева). Набор встречных пар(т.е. 1-2, 3-4, 5-6 и 7-8) отбирается и назначается каждой крысе в одной экспериментальной группе. Один и тот же набор счетчиков назначается крысам в обеих экспериментальных группах. В следующем сеансе в контексте 2 (сессия X+1; справа) крысы в экспериментальных группах меняются для уравновешивания, и назначается новый набор пар счетчиков. Следует отметить время начала кодирования и тестовых испытаний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все сеансы обработки, привыкания и кодирования/тестирования в этом протоколе были оптимизированы во время световой фазы 12-ч светового/темного цикла, и, следовательно, рекомендуется проводить эксперименты во время фазы света.

2. Обращение и привыкание

1. Начинать обращение с крысами начинают либо с отлучения от отлучения от производства (если крысы выведены в домашнем помещении), либо за 2-3 недели до начала экспериментов (в том случае, если крысы заказывают с внешнего объекта, после того, как они могут акклиматизироваться в течение одной недели после прибытия).
2. Проводите не менее 10-15 минут в каждой клетке из 4 крыс в течение 2 или 3 дней в неделю, пока крысы не будут чувствовать себя комфортно, когда их трогает и подбирает экспериментатор. Отрегулируйте время, выделенное на клетку, в зависимости от количества крыс в клетке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы все экспериментаторы, ожидающие работать с крысами, присутствовали во время обработки.
3. В тех случаях, когда обработка начинается с отлучения от отлучения, сократите обработку до минимума (необязательно) после достижения этого уровня. Если начинают за 2-3 недели до экспериментов, продолжают обработку до начала сеансов привыкания.
4. Приведите крыс в их клетках в экспериментальную комнату, чтобы приужить крыс к транспорту, а также в экспериментальную комнату. Дайте крысам посидеть не менее 30 минут, чтобы дать им время успокоиться и привыкнуть. По истечении этого времени верните крыс/клетки в жилищную комнату.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 2.4 может быть объединен с обработкой и повторен столько раз, сколько необходимо. Дополнительное привыкание может быть реализовано на этом этапе, если протокол включает любые дальнейшие манипуляции(например, обращение с процедурой инъекций и т. Д.).
5. Выполняйте привыкание к объектам, чтобы приучать крыс к взаимодействию с объектами и снизить общий уровень стресса, вытекающий из опыта новой среды.
   1. Для сеанса 1 принесите все домашние клетки в экспериментальную комнату, и дайте крысам привыкнуть в комнату и поселиться не менее 30 минут. Поместите крыс (2-4 крысы) из одной клетки вместе в ведро на 20 минут. Очистите ведро, удалив все фекалии между каждой группой крыс. Повторите процедуру для всех клеток. Поместите всех крыс в их домашние клетки и вернитесь в жилищную комнату.
   2. Для сеанса 2 в отдельный день принесите все клетки в экспериментальную комнату и оставьте не менее чем на 30 минут. Положите каждую крысу по отдельности в ведро на 10 минут. Поместите крысу обратно в домашнюю клетку и очистите ведро после каждой крысы. Верните все клетки в жилище.
   3. Для сеанса 3 повторите шаг 2.5.2 в отдельный день.
6. Если экспериментальный аппарат представляет собой закрытую коробку(рисунок 1В),то решите выполнить привыкание пустой коробки, чтобы приужить крыс к новому экспериментальному аппарату. В сеансе 4 принесите все клетки в экспериментальную комнату и оставьте не менее чем на 30 минут. Поместите крыс из одной клетки вместе (2-4 крысы) на пустую арену без контекста или пространственных сигналов(рисунок 1B,середина) на 20 минут. Поместите всех крыс обратно в домашнюю клетку и протрите арену 70% этанолом после каждой группы крыс.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2.5 и 2.6 должны быть выполнены в течение одной недели, предшествующей неделе привыкания контекста (шаг 2.7; см. рисунок 3). Перерыв на пару дней во время этих шагов допустим. Однако после начала шага 2.7 каждый шаг должен выполняться в течение последовательных дней, как указано, до окончания тестовой пробы (шаг 2.9).
7. Выполняйте привыкание к контексту, чтобы приучить крыс к контексту и 3D-сигналам, снизить общий уровень стресса и поддержать пространственное обучение окружающей среды.
   1. Измените пустую арену, чтобы создать первый контекст, как описано в разделе 1.1, но не помещайте объекты в арену. Подготовьте записывающее оборудование.
   2. Для сеанса 1 принесите все клетки в экспериментальную комнату и оставьте не менее чем на 30 минут. Запустите рекордер, если это делается вручную. Поместите первую крысу в центр арены и позвольте крысе исследовать арену в течение 10 минут. Затем остановите диктофон (если вручную) и поместите крысу обратно в домашнюю клетку. Тщательно протрите арену 70% этанолом после каждой крысы и верните все клетки в жилище, когда закончите.
   3. Для сеансов 2 и 3 повторите шаг 2.7.2 для каждой крысы в течение двух последовательных дней таким образом, чтобы в общей сложности на крысу было 3 сеанса привыкания контекста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подумайте о том, чтобы перетасовывание порядка, в котором крысы выходят на арену, особенно при работе с большой группой. Это позволяет избежать повторного запуска конкретных крыс в одно и то же время суток.

Рисунок 3:Дизайн поведенческого эксперимента, включая протоколы обработки, привыкания и определения местоположения объекта. С крысами следует обращаться регулярно, начиная с нескольких недель до недели привыкания. На 0-й неделе объектные и экспериментальные боксовые привычки проводятся в течение 4 сеансов с интервалами не менее 24 ч между ними. На 1-й неделе привыкание контекста проводится в течение 3 последовательных сеансов с 24-h интервалами между ними, за которыми следуют кодирование и тестовые испытания. Должно быть минимум 48 ч и интервал до 1 недели, прежде чем приступить к следующему сеансу(например, начать привыкание к следующему контексту на 2 или 3 неделе). Аббревиатура: Хаб., привыкание. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

8. Пробная версия кодирования (сессия 4)
   ПРИМЕЧАНИЕ: В случае фармакологических манипуляций разумное время для введения агента может быть либо до, либо сразу после кодирования испытания (испытаний) и/или до испытания в зависимости от природы фармакологического агента.
   1. Принесите все клетки в экспериментальную комнату и оставьте не менее чем на 30 минут. Используя заранее подготовленный график(рисунок 2В),поместите первую идентичную пару объектов в обозначенные места (на расстоянии 2 углов и расстоянии >10 см от каждой соответствующей стены; L-образный кусок картона может быть использован для поддержания одинакового расстояния каждый раз) с помощью липких ковриков или двусторонней ленты.
   2. Запустите диктофон (если вручную). Поместите первую крысу на арену лицом к стене или углу, который не занят никаким объектом (равное расстояние до каждого объекта).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие действия для слабого или сильного кодирования.
   3. Для слабого кодирования (1 испытание), позвольте крысе исследовать арену и объекты в течение 20 минут. Затем остановите диктофон (если вручную) и поместите крысу обратно в домашнюю клетку. Удалите предметы и тщательно протрите предметы и арену 70% этанолом.
   4. Повторите шаг 2.8.3 для всех крыс, чтобы каждая крыса получила 1 пробу кодирования 20 минут.
   5. Для сильного кодирования (3 испытания), позвольте крысе исследовать арену и объекты в течение 5 минут. Затем остановите диктофон (если вручную) и поместите крысу обратно в домашнюю клетку. Не удаляйте объекты. Протрите арену и предметы 70% этанолом.
   6. Повторите шаг 2.8.5 еще два раза с той же крысой, чтобы было проведено 3 испытания. Поместите крысу обратно в домашнюю клетку, когда время издят. Удалите предметы для тщательной очистки, и протрите предметы и арену 70% этанолом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Межитровый интервал для крысы должен составлять приблизительно 1-2 мин.
   7. Повторите шаги 2.8.5-2.8.6 для каждой крысы.
   8. Если время задержки короче 24 ч, держите клетки в экспериментальной комнате до тестового испытания. Если нет, верните все клетки в жилищную комнату, когда они будут завершены.
9. Тестовая пробная версия (Сессия 4)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Период задержки должен отсчитываться с начала пробной версии кодирования.
   1. В случае 24-часовой задержки (или любой задержки, которая требует проведения тестового испытания на следующий день), принесите все клетки в экспериментальную комнату, оставив достаточно времени до первого теста, чтобы крыс можно было оставить не менее чем на 30 минут. Согласно графику, размещайте объекты в обозначенных местах (один из объектов на новом месте).
   2. Когда наймутся время, запустите диктофон (если вручную). Поместите первую крысу на арену лицом к стене или углу, который не занят никаким объектом (равное расстояние до каждого объекта).
   3. Позвольте крысе исследовать арену и объекты в течение 5 минут. Затем остановите рекордер (если вручную). Поместите крысу обратно в домашнюю клетку. Удалите предметы и тщательно протрите предметы и арену 70% этанолом.
   4. Повторите шаги 2.9.2-2.9.3 для каждой крысы. Верните все клетки обратно в жилую комнату.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В каждом следующем сеансе кодирования/тестирования запускайте протокол привыкания с шага 2.7 (контекстное привыкание) через интервал не менее 48 ч и до 1 недели.

3. Анализ данных

1. Для каждой крысы оценйте время исследования для каждого объекта как в кодировании, так и в тестовых испытаниях, используя программное обеспечение, разработанное для этой цели, или с помощью ручной настройки. Оценка испытаний кодирования на весь срок. Оценка тестовых испытаний в течение 2 минут для лучшей производительности дискриминации³. При использовании автоматизированного онлайн-скоринга программного обеспечения экспортируйте данные оценки из программного обеспечения.
2. Подсчитывайте время исследования, когда крыса находится в контакте с объектом, обнюхивая объект или сталкиваясь с объектом на расстоянии менее 2 см. Включите восхождение и сидение на объекте в качестве исследования, если внимание крысы не кажется где-то другим, кроме объекта(например, взгляд в сторону от объекта).
3. Рассчитайте общее время исследования для обоих объектов для каждой крысы. Рассмотрите возможность исключения любой крысы, которая имеет общее время разведки менее 10 с в тестовом испытании (для оценки 2 минуты) из этого теста, поскольку это может отражать ненадежную разведку.
4. Рассчитайте процент исследования для каждого объекта (уравнение 1) или индекс дискриминации (DI) для каждой крысы (уравнение 2) и рассчитайте средние значения для групп.
   (1)
   
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если % исследования составляет 50% или DI равны 0, это означает, что производительность находится на уровне шансов, и крыса не отдает предпочтения ни одному из объектов. Средний процент исследования и DI во время испытаний кодирования должен составлять ~50% или 0 соответственно. Любая крыса, показающая предпочтение выше [среднего ± (2 × SD)] для любого объекта в исследовании кодирования, должна быть исключена из анализа соответствующего теста. Это позволяет достоверно интерпретировать предпочтение в тестовом испытании как память о стабильном местоположении объекта. Это значение может быть рассчитано для отдельного теста или для комбинированного кодирования данных из нескольких тестов.
5. Анализируйте данные методом, наилучшим образом подходящим для экспериментальной установки. Используйте t-тест содной выборкой для обнаружения значительного предпочтения выше уровня вероятности.
6. Используя более одного контекста с уравновешивающим, объедините результаты одного и того же экспериментального условия в разных контекстах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это приведет к группам, состоящим из одних и тех же крыс, что позволит сравнивать внутри субъекта с использованием парного t-тестадля двух групп и с использованием анализа дисперсии повторных мер (ANOVA) для более чем двух групп.

Результаты

Здесь показаны репрезентативные результаты как для сильных, так и для слабых протоколов кодирования, описанных с использованием самцов тирозингидрилазы (Th)-Cre трансгенных крыс¹³ с штаммом Long-Evans, четыре раза скрещенными с штаммом Lister Hooded и крысами с капюшоном дикого типа. Трансгенные крысы Th-Cre использовались, поскольку эта крысиная линия будет использоваться в будущих исследованиях, связанных с оптогенетикой. Используя каждый протокол, память тестировалась с задержками 1 и 24 ч. Тесты через 1 ч демонстрируют кратковременную память, в то время как 24-ч тесты демонстрируют долговременную память. Значение исключения для предпочтения кодирования было рассчитано, как описано в протоколе, с использованием объединенных данных пяти тестов (сильных и слабых протоколов кодирования) как [50,8% ± (2×10,8%)]. Крысы, которые имели предпочтение кодирования выше и ниже этих значений, были исключены из анализа соответствующих тестов.

Для экспериментов с сильным кодированием использовались 16 крыс, а для экспериментов со слабым кодированием — 19 крыс. Во время испытаний сильного кодирования (3 × 5 минут кодирования; Рисунок 4А),не было существенного предпочтения ни одному из объектов (52,0 ± 1,9%, n = 16, t₁₅ = 1,1, p = 0,29; один образец t-тест против уровня шанса). Этот сильный протокол кодирования привел к предпочтению объекта в новом месте, как показано с точки зрения среднего процента исследования, которое было значительно выше уровня шанса (50%) в тестах с задержками 1-h и 24-h (1-h memory, 77,9 ± 2,4%, n = 8, t₇ = 11,8, p < 0,001; 24-h память, 65,2 ± 5,3%, n = 8, t₇ = 2,8, p = 0,025; один образец t-тест против уровня шанса). Не было существенной разницы между 1-часовой и 24-часовой памятью (p = 0,056; непарный t-тестУэлча).

Во время испытаний слабого кодирования (20-минутное кодирование; результаты объединены из четырех контекстов; Рисунок 4В),не было отмечено существенного предпочтения ни одному из объектов (51,1 ± 1,0%, n = 66, t₆₅ = 1,2, p = 0,24; тест на одну выборку tпротив уровня шанса). Этот слабый протокол кодирования привел к значительному увеличению предпочтения объекта в новом месте по сравнению с уровнем случайности в тестах с задержкой 1-ч, но не 24-ч задержкой (объединенные данные из всех четырех контекстов; 1-ч памяти, 66,7 ± 2,0%, n = 32, t₃₁ = 8,2, p < 0,001; 24-ч памяти, 49,6 ± 2,6%, n = 34, t₃₃ = 0,16, p = 0,87; один образец t-тест против уровня шанса). Наблюдалась существенная разница между производительностью в тестах с 1-ч и 24-ч задержками (1-ч памяти: n = 32, 24-ч памяти: n = 34, t_61,5 = 5,2, p < 0,001; непарный t-тестУэлча).

Память на групповом уровне не наблюдалась в тесте на 24-ч задержку, индексируемом производительностью на уровне случайности, но показала индивидуальные вариации. Это более высокое изменение для слабых условий и условий отсутствия памяти(например,24-h тест) обычно наблюдалось из-за более случайного исследования объектов. Следовательно, важно не интерпретировать производительность крыс индивидуально. Вместо этого распределение отдельных точек данных может использоваться вместе со средним значением группы в качестве надежного результата теста. Чем сильнее кодирование, тем более однородным становится поведение крыс и тем меньше количество крыс необходимо для достижения статистической значимости, как это можно наблюдать на рисунке 4A для строгого протокола кодирования. Напротив, для получения достоверных результатов для слабых условий необходимы более крупные группы(рисунок 4В).

Рисунок 4:Производительность памяти после сильного и слабого кодирования. (A) Испытание строгого кодирования (3 × 5 мин кодирования), за которым следуют 1-h или 24-h тестовые испытания. Во время испытаний кодирования не было выявлено существенного предпочтения ни одному из объектов (n = 16). Сильное кодирование привело к значительному увеличению предпочтения объекта в новом месте в тестах с задержками 1 и 24 ч по сравнению с уровнем случайности (1-ч и 24-ч памяти: n = 8 в каждой группе). Существенной разницы между группами не было. (B) Испытание слабого кодирования (20-минутное кодирование), за которым следуют либо 1-h, либо 24-h тестовые испытания. Во время испытаний кодирования не было выявлено существенного предпочтения ни одному из объектов как группе (n = 66). Слабое кодирование привело к значительному увеличению предпочтения объекта в новом месте в тесте с задержкой 1 ч, но не 24 ч, по сравнению с уровнем случайности (1-ч памяти: n = 32; 24-ч памяти: n = 34). Наблюдалась существенная разница между показателями в тестах с 1-ч и 24-ч задержками. Результаты были объединены из четырех контекстов. Отдельные точки данных представлены в виде точек. Все бары показывают процент исследования объекта в новом месте как среднее ± SEM. *p < 0,05, ***p < 0,001; один образец t-тест против уровня шанса (50%, пунктирная линия). ^###p < 0,001; ns, не значимые; непарный t-тестУэлча. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Существенным преимуществом этого установленного протокола является то, что он может быть выполнен четыре раза с использованием четырех различных контекстов(рисунок 1C)с одной и той же когортой крыс. Результаты, показанные на рисунке 5, демонстрируют один из возможных способов использования уравновешивания с двумя экспериментальными группами (1-h и 24-h группы памяти). Эти две группы были уравновешены в двух контекстах (контексты 1 и 2), и это было повторено в двух дополнительных контекстах (контексты 3 и 4; Рисунок 5А). Результаты из четырех контекстов представлены индивидуально на рисунке 5B,D,где память для каждой экспериментальной группы оценивалась путем сравнения предпочтения случайному уровню в каждом контексте (1-h память: контекст 1, 69,9 ± 3,6%, n = 9, t₈ = 5,5, p < 0,001; Контекст 2, 65,6 ± 3,9%, n = 9, t₈ = 4,0, p = 0,004; Контекст 3, 65,2 ± 3,8%, n = 7, t₆ = 4,0, p = 0,007; Контекст 4, 65,3 ± 5,6%, n = 7, t₆ = 2,7, p = 0,035; 24-часовая память: контекст 1, 45,1 ± 6,4%, n = 9, t₈ = 0,77, p = 0,46; Контекст 2, 49,1 ± 4,9%, n = 9, t₈ = 0,18, p = 0,86; Контекст 3, 57,2 ± 4,1%, n = 8, t₇ = 1,7, p = 0,12; Контекст 4, 47,6 ± 4,7%, n = 8, t₇ = 0,52, p = 0,62; один образец t-тест против уровня шанса).

В контекстах 1, 2 и 4 сравнение групп между субъектами выявило значительные различия между 1-часовой и 24-часовой памятью (1-часовая память против 24-часовой памяти: контекст 1, t_12,7 = 3,4, p = 0,005; Контекст 2, t_15,2 = 2,6, p = 0,019; Контекст 3, t_13,0 = 1,4, p = 0,17; Контекст 4, t_12,2 = 2,4, p = 0,032; непарный t-тестУэлча). Для лучшего представления и сравнения данных внутри субъекта результаты из двух уравновешенных контекстов были объединены(рисунок 5C,E). Объединенные экспериментальные группы снова сравнивали с уровнем шансов индивидуально (контексты 1 и 2 вместе взятые: 1-ч памяти, 67,8 ± 2,6%, n = 18, t₁₇ = 6,7, p < 0,001; 24-ч памяти, 47,1 ± 3,9%, n = 18, t₁₇ = 0,74, p = 0,47; Контексты 3 и 4 комбинированные: 1-часовая память, 65,3 ± 3,3%, n = 14, t₁₃ = 4,7, p < 0,001; 24-часовая память, 52,4 ± 3,2%, n = 16, t₁₅ = 0,73, p = 0,48; один образец t-тест против уровня шанса). Затем экспериментальные группы сравнивали друг с другом.

В обеих парах контекста наблюдались значительные различия между группами, выявленные в результате сравнения внутри субъекта (1-часовая память против 24-часовой памяти: контексты 1 и 2 вместе взятые, t₁₆ = 3,5, p = 0,003; Контексты 3 и 4 вместе взятые, t₁₃ = 2,4, p = 0,032; парный t-тест). Сопоставимые результаты были получены и с крысами с капюшоном дикого типа в слабом протоколе кодирования с использованием контекстов 1 и 4 для двух уравновешенных сеансов (данные не показаны). Воспроизводимость и надежность результатов были подтверждены путем сравнения каждого набора данных с использованием одностороннего ANOVA. Между четырьмя контекстами не было обнаружено существенной разницы (1-часовая память: F_3,28 = 0,31, p = 0,81; 24-ч памяти: F_3,30 = 0,99, p = 0,41). Таким образом, тест на местоположение объекта может быть повторен надежно с минимальным влиянием повторений, учитывая, что инструкции в этом протоколе соблюдаются.

Рисунок 5:Различные способы представления и анализа результатов слабого протокола кодирования с двумя экспериментальными группами, уравновешенными в течение двух сеансов. (A) Экспериментальная конструкция уравновешивания с двумя экспериментальными группами (1-h и 24-h группы памяти) в течение двух сеансов (контексты 1 и 2). Уравновешивание было повторено в двух дополнительных сессиях (контексты 3 и 4). (B и D) Результаты из каждого контекста и экспериментальных групп сравнивались индивидуально с уровнем случайности и друг с другом. Во всех четырех контекстах предпочтение объекта в новом месте в тестах с задержкой 1 ч было значительно увеличено по сравнению с уровнем вероятности [Контекст 1 и 2: n = 9 на группу(B); Контекст 3 и 4: n = 7 на группу(D)]. В тестах на 24-ч задержку предпочтение объекта в новом месте не отличалось от случайности (контекст 1 и 2: n = 9 на группу; Контекст 3 и 4: n = 8 на группу). Наблюдалась существенная разница между предпочтениями экспериментальных групп в контекстах 1, 2 и 4, но не в контексте 3, как было выявлено при сравнении между субъектами. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; один образец t-тест против уровня шанса (50%, пунктирная линия). ^#p < 0,05; ^##p < 0,01; ns, не значимые; непарный t-тестУэлча. (C и E) Результаты представлены после объединения экспериментальных групп из двух уравновешенных контекстов [Контексты 1 и 2 вместе взятые, n = 17 на группу(C); Контексты 3 и 4 вместе взятые, n = 14 на группу(E)]. Предпочтение объекта в новом месте было значительно увеличено по сравнению с уровнем случайности в тестах с задержкой 1 ч, но не 24 ч, в обеих парах контекста. Внутритеспытуемое сравнение экспериментальных групп выявило существенные различия между предпочтениями объекта в новом месте в тестах с задержками 1-h и 24-h в обеих парах контекста. p < 0,001; один образец t-тест против уровня шанса (50%, пунктирная линия). ^#p < 0,05, ^##p < 0,01; парный t-тест. Отдельные точки данных представлены в виде точек. Все столбцы показывают процент исследования объекта в новом месте как среднее ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Задача определения местоположения объекта может быть использована в различных исследованиях для исследования пространственной памяти, как описано ранее. Гибкость установки позволяет моделировать кратковременную и долговременную память различной силы, и это может быть легко реализовано при низких затратах. Однако, поскольку в протоколе много параметров, которые могут влиять на результаты, и различные исследования немного различаются по этим параметрам^6,можно столкнуться с трудностями при успешной реализации задачи в первый раз. Приведенный выше протокол предназначен для того, чтобы плавно направлять читателей через этот процесс. Ниже будут рассмотрены дальнейшие важнейшие шаги, которые могут оказаться важными для успешного выполнения задачи с высокой воспроизводимостью.

Хотя сеанс кодирования / тестирования часто находится в центре внимания при проведении экспериментов с местоположением объектов, протоколы обработки и привыкания оказывают глубокое влияние на результаты такого рода поведенческих тестов, где результат зависит от ненарушенного естественного поведения крыс^14,15. Таким образом, шаги, предшествующие сеансу кодирования / тестирования, должны быть разработаны с осторожностью, поскольку они могут влиять на поведение и память крыс и, следовательно, влиять на конечные результаты. Хороший уровень управляемости и привыкания такой, чтобы крысы познакомились с экспериментатором и задание минимизировали влияние стрессовых факторов, одновременно увеличивая вероятность демонстрации естественного поведения^8. Как упоминалось в протоколе, обращение может начаться уже после отлучения детенышей, если штамм крысы поддерживается в домашнем учреждении. Основываясь на предыдущем опыте (данные не показаны) и на нескольких предыдущих исследованиях^16,17,это раннее лечение приводит к низкой тревожности и усилению любопытства в последующие месяцы.

Поскольку задача определения местоположения объекта зависит исключительно от внутреннего исследовательского драйва крыс, ожидаемое поведение может быть легко затруднено, если крысы не стремятся исследовать или неохотно приближаются к новизне, которая называется «неофобным поведением»^1. Таким образом, настоятельно рекомендуется включить тщательный протокол обработки и привыкания в соответствии с конкретными потребностями исследования. Этот протокол может быть использован в качестве руководства по минимальным требованиям, и могут быть реализованы дальнейшие шаги(например,если исследование должно включать инъекции на более поздней стадии, требуется привыкание к процедурам инъекций и конкретное положение удержания). Штамм и возраст экспериментальных крыс являются двумя другими влиятельными факторами, и их следует учитывать перед планированием эксперимента, чтобы избежать неоптимальных результатов. Различные штаммы крыс могут иметь различное поведение и базовые уровни тревоги^18,19,20 и, следовательно, может потребоваться специальная корректировка протокола в зависимости от используемого штамма.

Подтверждено, что этот протокол хорошо работает с трансгенными крысами Th-Cre со штаммом Long-Evans, четыре раза скрещенным с штаммом Lister Hooded и крысами с капюшоном дикого типа. Логически идеальный начальный возраст для крыс в поведенческих экспериментах составляет около 12 недель^20,но следует учитывать межстовую изменчивость и конкретные требования задачи. Также можно было бы использовать развивающихся крыс, если это представляет интерес для исследования, хотя могут потребоваться корректировки протокола, которые здесь не рассматриваются. Тем не менее, важно учитывать, развила ли крыса в данном возрасте когнитивные функции, необходимые для успешного выполнения этой задачи. Исследование^21, изучающее это, показало, что только крысы-подростки на 38-й день, а не раньше, показали аллоцентрическую пространственную память, отраженную в предпочтении объекта в новом месте, как это наблюдалось у взрослых крыс. Представленный здесь протокол был успешным с использованием крыс, которым было 15-16 недель в начале первого сеанса кодирования / тестирования. Ранее тот же строгий протокол кодирования производил неоптимальные или отрицательные результаты при использовании 23-недельных крыс, которые не достигли оптимального уровня привыкания из-за отсутствия обработки и привыкания в достаточно молодом возрасте. Эти крысы либо не смогли выступить иначе, чем случайный уровень, либо на самом деле проявили отвращение к новизне, наблюдаемое с точки зрения предпочтения стабильных объектов вместо смещенных объектов (данные не показаны). Эти результаты свидетельствуют о том, что возраст и сроки привыкания к обращению могут влиять на эффективность привыкания и, как следствие, способствовать наблюдению тревожного и неофобного поведения в тестах.

Здесь описаны два разных протокола, обеспечивающих сильное или слабое кодирование в задаче определения местоположения объекта. Во время создания этих протоколов было замечено, что интерес к объектам снизился после 5-10 минут разведки во время одиночных длительных испытаний(например, 20 минут кодирования), и крысы в конечном итоге прекратили исследования. Это приводит к ослаблению памяти местоположений объектов. Протокол кодирования, который чередует испытания кодирования с короткими периодами покоя(например, кодирование 3 x 5 минут), преодолевает это и приводит к высокой исследовательской работе на протяжении всех испытаний. Таким образом, время активного исследования и различная компоновка этих двух протоколов кодирования влияет на силу памяти, которая сильнее после кодирования 3 х 5 минут, чем после 20-минутных протоколов кодирования. Аналогичные результаты также могут быть достигнуты с использованием несколько отличающихся продолжительностей с одним испытанием по сравнению с протоколами испытаний с чередованием, и могут быть внесены коррективы в соответствии с потребностями исследования и штаммом крыс.

В отличие от протоколов, использующих простое белое открытое поле с только внешними сигналами в комнате, протокол, представленный здесь, использует арену с различными контекстами и внутримозными сигналами, что, вероятно, требует больше времени для изучения. Следовательно, рекомендуется добавить в протокол этап привыкания контекста до испытания кодирования. Это позволит крысам формировать пространственную карту каждого контекста во время привыкания и уменьшит продолжительность следующего испытания кодирования, так как крысам нужно будет только кодировать местоположение объектов по отношению к этой карте. Кроме того, привыкание к контексту позволит крысам привыкнуть к любому возможному отвлекающе в каждом контексте, такому как 3D-пространственные сигналы, сводя к минимуму поведение, отличное от исследования объектов в сеансе кодирования / тестирования. При реализации метода тщательного уравновешивания, состоящего из нескольких уровней(т.е. широкого диапазона комбинаций расположения объекта (счетчиков) и направления смещения объекта), нежелательные предпочтения, которые могут возникнуть из-за изменения интенсивности света и цветов/узоров стен в углах арены, сводятся к минимуму.

При повторении задачи следует учитывать несколько факторов, чтобы повысить воспроизводимость между сеансами кодирования/тестирования и свести к минимуму влияние повторения. Во-первых, необходимо спроектировать различные контексты (столько же, сколько повторений сеансов кодирования/тестирования) должны быть спроектированы таким образом, чтобы избежать накопления пространственной памяти, которое может быть вызвано выполнением повторяющихся сеансов с использованием одного и того же контекста. Для этого был использован аппарат со сменными стенками разных цветов и узоров(рис. 1В,С). Отдельные стены и 3D-объекты (такие как игрушки или небольшие предметы повседневной жизни различных цветов и форм, см. протокол и рисунок 1C),подвешенные на стенах, являются пространственными сигналами и ориентирами, которые крысы потенциально используют для изучения местоположения объектов по отношению к их контекстам. В случае, если тест не может создать предпочтение для перемещенного объекта, может быть рассмотрено изменение этих параметров контекста (дизайн стены и пространственные сигналы). В качестве альтернативы, арена прямоугольной или круглой формы может использоваться для задач определения местоположения объекта вместо квадратной арены, как в этом протоколе. Сообщается, что круговые арены устраняют угловые предпочтения^22, которые часто наблюдаются на аренах с углами, и, следовательно, это может быть полезно при работе с особенно тревожным штаммом крыс или мышей. В то время как требования создания четырех различных контекстов в этом протоколе наиболее оптимально работают с четырехугольной формой, круглая арена также может быть функциональной после некоторых корректировок.

Во-вторых, интервалы между каждым сеансом кодирования/тестирования должны быть определены таким образом, чтобы крысы каждый раз сохраняли один и тот же уровень интереса, избегая при этом риска кумулятивного обучения в результате плотного графика повторений. Обычно интервал, по крайней мере, в два раза превышающий продолжительность времени задержки между кодированием и тестовыми испытаниями, является достаточным, причем более длинные интервалы более благоприятны для более чем двух повторений. Это означает, что в то время как минимального 48-ч интервала после 24-ч теста достаточно для одного или двух повторений, для четырех повторений рекомендуется использовать 1-недельный интервал. Как показывают результаты на рисунке 5 и сравнение с использованием ANOVA, задача может быть успешно повторена четыре раза. Исходя из этого, установленный протокол может быть использован для уравновешивания до четырех экспериментальных условий. Количество экспериментальных групп определяет количество повторений сеансов кодирования/пробы в различных контекстах. Результаты на рисунке 5 представляют собой один из возможных способов использования протокола с двумя экспериментальными группами. Группы были уравновешены в ходе двух сессий, и те же условия были повторены в двух дополнительных сессиях (для целей проверки). Второй набор уравновешенных сессий также может быть использован для уравновешивания новых условий. Аналогичным образом, три или четыре экспериментальных условия могут быть сопоставлены с использованием трех или четырех уравновешенных сеансов соответственно.

В этих случаях контексты должны быть спроектированы таким образом, чтобы учитывать контрастные характеристики, описанные в протоколе. Примечательно, что уравновешенная конструкция может не подходить для экспериментов, в которых должны использоваться дополнительные манипуляции, такие как фармакологическое вмешательство, которое может оставить длительный эффект или повреждение. Для поддержания эффективности и воспроизводимости тестов эксперимент должен быть разработан соответствующим образом. Данные повторных тестов могут быть представлены и проанализированы несколькими способами, как показано на рисунке 5. Для первоначального анализа экспериментальные группы в каждом контексте могут быть индивидуально сопоставлены с уровнем случайности с использованием t-теста с одной выборкойдля определения любого значимого предпочтения(рисунок 5B,D). Это может быть полезно для быстрого понимания данных, но это обеспечивает только косвенное сравнение групп. Так, для сравнения двух и более групп данные следует анализировать с помощью двухвыборочных t-тестов(парных или непарных) или ANOVA соответственно. Это может быть в форме сравнения групп между субъектами в рамках одного сеанса кодирования/теста(рисунок 4A и рисунок 5B,D)или внутрисубпонятного сравнения групп из двух (или более) уравновешенных контекстов(рисунок 5C,E). Последний метод настоятельно рекомендуется, особенно при работе со слабыми состояниями памяти, которые, как объяснялось ранее, приводят к высокой дисперсии из-за случайности в поведении.

Объединение уравновешенных контекстов приводит к более крупным группам, которые должны надежно визуализировать поведение группы с минимальными вариациями. Используя протокол с повторениями в уравновешенных сеансах, можно ожидать уменьшения числа крыс примерно до одной трети от числа, которое потребовалось бы при использовании одного теста с той же статистической мощностью. Обычно размер выборки в диапазоне от 7 до 15 крыс (всего) для уравновешенных сеансов и в диапазоне от 20 до 50 крыс (от 10 до 25 на группу) для одного сеанса с размером эффекта и мощностью более 0,8. Уменьшение количества необходимых животных и увеличение информации, которую мы получаем от каждого животного с использованием этого протокола, совершенствуют исследование и служат принципам этического использования животных в исследованиях 3R. На этом этапе важно иметь в виду, что случайное поведение крыс, которое не сопровождается сильной памятью, может привести к индивидуальным сильным предпочтениям как ниже, так и выше шанса, но среднее значение группы должно давать предпочтение, существенно не отличающееся от случайности. Индивидуальные данные следует интерпретировать осторожно. Распределение отдельных точек данных внутри группы также может быть информативным для интерпретации результатов. Как видно на рисунках 4 и 5,распределение изменяется в зависимости от прочности памяти. В целом, протокол, представленный здесь, можно легко использовать для реализации задачи определения местоположения объекта с повторениями для моделирования кратковременной и/или долгосрочной пространственной памяти. Простой и гибкий протокол обучения и возможность реализации дальнейших манипуляций делают эту задачу популярным выбором. Эти изменения протокола позволяют иследовать конкретные этапы, такие как получение, консолидация и отзыв памяти.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Open-field/experimental box	O'Hara & Co (Japan)	OF-3001	Open-field box for the object location task
Object 1: cones	O'Hara & Co (Japan)	ORO-RR
Object 2: footballs	O'Hara & Co (Japan)	ORO-RB
Object 3: rectangular blocks	O'Hara & Co (Japan)	ORO-RC	Rectangular blocks were modified after purchase
Object location task apparatus	O'Hara & Co (Japan)	SPP-4501	Sound attenuating box that contains the open-field box for the object location task
Tracking software	O'Hara & Co (Japan)	TimeSSI	For movement tracking and automated camera functions
Wild-type Lister Hooded rats	Charles River	603