* Эти авторы внесли равный вклад
Этот протокол предоставляет подробные шаги для задачи определения местоположения объекта с четырьмя повторениями с использованием одной и той же когорты крыс. Слабое и сильное кодирование может привести к краткосрочным и долгосрочным воспоминаниям. Гибкость протокола с повторением может быть полезна для исследований, связанных с хирургическими операциями, экономя время и труд.
Распознавание места объекта является выдающимся методом, используемым для исследования пространственной памяти у грызунов. Эта память распознавания места объекта составляет основу задачи определения местоположения объекта. В этой статье представлен обширный протокол для руководства созданием задачи определения местоположения объекта с возможностью до четырех повторений с использованием одной и той же когорты крыс. Как слабые, так и сильные протоколы кодирования могут использоваться для изучения краткосрочных и долгосрочных пространственных воспоминаний различной силы и для реализации соответствующих манипуляций, ингибирующих или улучшающих память. Кроме того, повторение теста с представленным здесь противовесом позволяет комбинировать результаты двух или более тестов для сравнения внутри субъекта для снижения изменчивости между крысами. Этот метод помогает увеличить статистическую мощность и настоятельно рекомендуется, особенно при проведении экспериментов, которые приводят к высоким вариациям в индивидуальном поведении. Это напрямую уточняет исследование, увеличивая данные, полученные от каждого животного, и уменьшая общее количество необходимых животных. Наконец, выполнение задачи повторного определения местоположения объекта повышает эффективность исследований, связанных с хирургическими процедурами, за счет экономии времени и труда.
Задачи спонтанного распознавания(например, распознавание объектов, распознавание места объекта) в значительной степени использовались при исследовании памяти у грызунов. Эти тесты отличаются от множества тестов, используемых для оценки памяти, которые основаны либо на обусловливания страха, либо на мотивации вознаграждения, в том, что спонтанные задачи распознавания основаны исключительно на спонтанном исследовательском поведении по отношению к новым стимулам. Это поведение, называемое «неотическим предпочтением»1,присуще грызунам, а также другим видам млекопитающих и некоторым не млекопитающим, таким как птицы и рыбы2. Распознавание места объекта, которое зависит от пространственной памяти, можно наблюдать с помощью задачи определения местоположения объекта (также известной как задача распознавания пространственных объектов)3. Исследования поражений показали, что для распознавания места объекта требуется неповрежденный гиппокамп4,5. Из-за относительно простого протокола обучения и отсутствия какого-либо подкрепления эта задача предпочтительнее во многих исследованиях. Отсутствие как положительного, так и отрицательного подкрепления сводит к минимуму дополнительные параметры и области мозга, которые могут управлять поведением. Следовательно, поведение здесь нейтрально и основано на любопытстве и пространственной памяти, что позволяет исследуть механизмы, которые участвуют в кодировании, консолидации и извлечении пространственной памяти.
Протокол для задачи определения местоположения объекта обычно состоит из сеансов привыкания, за которыми следует один сеанс кодирования и тестовых испытаний, разделенных периодом задержки, который варьируется от нескольких минут до часов. Настоятельно рекомендуется, чтобы крысы обрабатывались заранее, чтобы свести к минимуму уровень стресса животных и, следовательно, поведение, которое может повлиять на память распознавания, такое как отвращение к новизне. Точно так же хорошо разработанный протокол привыкания играет важную роль в предотвращении стресса, который может помешать естественному поведению крысы во время выполнения задачи. Однако степень обработки и привыкания в значительной степени варьируется между лабораториями и экспериментаторами, что может способствовать низкой воспроизводимости6,7,8. В испытании кодирования крысе дается время для исследования арены с двумя идентичными объектами, расположенными в двух обозначенных углах. В тестовом испытании, которое задерживается на период, крысе дается время для изучения арены с той же парой объектов, но на этот раз один из них был перемещен в новое место. Спонтанное предпочтение, проявляемое крысами, и, как следствие, увеличение времени, затрачиваемого на изучение объекта в новом месте, свидетельствуют о пространственном распознавании и памяти местоположений объекта3. Модификация пробы кодирования (продолжительность и количество повторений) влияет на прочность памяти.
В зависимости от цели исследования продолжительность задержки между кодированием и тестовыми испытаниями может быть изменена для моделирования белково-синтез-независимой кратковременной памяти или белково-синтез-зависимой долговременной памяти. Следовательно, задача определения местоположения объекта может быть использована для широкого спектра исследований путем адаптации протокола по мере необходимости. Кроме того, между этими испытаниями также возможно осуществление экспериментальных манипуляций, таких как фармакологические и оптогенетические вмешательства, как и визуализация in vivo. Есть несколько исследований9,10, которые сообщают о повторных итерациях задачи определения местоположения объекта в одной и той же когорте крыс. Это контрастирует с традиционным использованием, в котором одно животное имеет один сеанс без повторений. Тем не менее, эффективность этих парадигм не была тщательно исследована, и нет никаких методических работ, описывающих их. Насколько нам известно, это первое описание протокола, который подробно описывает задачу определения местоположения объекта с использованием одной и той же когорты крыс, которая также систематически сравнивает результаты каждого повторения. Повторения могут быть использованы для уравновешивания экспериментальных условий, чтобы обеспечить сравнение внутри субъекта с уменьшенной изменчивостью между тестами. Надежное повторение задачи позволяет объединять данные, а это означает, что достаточно большой объем данных может быть сгенерирован с использованием относительно небольшого числа крыс. Наконец, повторения с использованием одной и той же крысы могут быть полезны в экспериментах, связанных с хирургическими операциями и имплантацией, за счет снижения количества необходимых крыс, что, следовательно, экономит время и затраты на рабочую силу.
В этом исследовании представлен обширный протокол, подробно описывающий, как выполнить задачу определения местоположения объекта у взрослых крыс с использованием сильных и слабых испытаний кодирования, за которыми следуют тестовые испытания с задержками 1 и 24 ч. Сильный протокол кодирования создает статистически значимую память распознавания при тестировании с задержками 1-ч и 24-ч и, таким образом, может быть использован для изучения как краткосрочных, так и долгосрочных воспоминаний при осуществлении манипуляций для ингибирования этих воспоминаний11. Напротив, слабый протокол кодирования создает значительную кратковременную память только при тестировании с задержкой 1 ч. Отсутствие долговременной памяти может быть использовано для изучения манипуляций по усилению удержания памяти11,12. Этот протокол также включает в себя подробные сеансы обработки и привыкания, которые направлены на повышение воспроизводимости задачи определения местоположения объекта. Эта статья также демонстрирует повторение задачи в четырех различных контекстах с одной и той же когортой крыс, использующих протокол слабого кодирования, который, как подтверждается, каждый раз дает воспроизводимые и последовательные результаты.
Все методы, описанные здесь, были одобрены датскими национальными властями (номер лицензии: 2018-15-0201-01405) в соответствии с законодательством Дании и ЕС о защите животных.
1. Экспериментальная установка и подготовка различных контекстов
Рисунок 1:Экспериментальная установка, включаемая четыре различных контекста и объекта. (A) Корзина объектов для привыкания объектов. (B) Экспериментальный аппарат (слева), охватывающий арену местоположения объекта, камеру и источник света. Экспериментальная коробка и арена перед настройкой контекста (посередине) и арена с настройкой контекста (справа). (C) Четыре контекста (1-4) с различными цветами и узорами стен, а также трехмерными пространственными сигналами. (D) Четыре объекта, которые используются в контекстах 1-4 соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Репрезентативные методы уравновешивания. (A) Возможные ориентации объектов на арене при кодировании и тестовых испытаниях называются счетчиками. Объект 1 всегда является движущимся объектом. Каждые два счетчика уравновешиваются таким образом, что местоположение движущегося объекта изменяется. Каждый угол занят дважды, а объект 1 перемещается от диагонали к соседней и наоборот на равное количество раз. (B)Пример расписания кодирования/тестирования для двух уравновешенных сессий(например, контексты 1 и 2). Крысы назначаются к экспериментальным условиям в контексте 1 (сеанс X, слева). Набор встречных пар(т.е. 1-2, 3-4, 5-6 и 7-8) отбирается и назначается каждой крысе в одной экспериментальной группе. Один и тот же набор счетчиков назначается крысам в обеих экспериментальных группах. В следующем сеансе в контексте 2 (сессия X+1; справа) крысы в экспериментальных группах меняются для уравновешивания, и назначается новый набор пар счетчиков. Следует отметить время начала кодирования и тестовых испытаний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все сеансы обработки, привыкания и кодирования/тестирования в этом протоколе были оптимизированы во время световой фазы 12-ч светового/темного цикла, и, следовательно, рекомендуется проводить эксперименты во время фазы света.
2. Обращение и привыкание
Рисунок 3:Дизайн поведенческого эксперимента, включая протоколы обработки, привыкания и определения местоположения объекта. С крысами следует обращаться регулярно, начиная с нескольких недель до недели привыкания. На 0-й неделе объектные и экспериментальные боксовые привычки проводятся в течение 4 сеансов с интервалами не менее 24 ч между ними. На 1-й неделе привыкание контекста проводится в течение 3 последовательных сеансов с 24-h интервалами между ними, за которыми следуют кодирование и тестовые испытания. Должно быть минимум 48 ч и интервал до 1 недели, прежде чем приступить к следующему сеансу(например, начать привыкание к следующему контексту на 2 или 3 неделе). Аббревиатура: Хаб., привыкание. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
3. Анализ данных
Здесь показаны репрезентативные результаты как для сильных, так и для слабых протоколов кодирования, описанных с использованием самцов тирозингидрилазы (Th)-Cre трансгенных крыс13 с штаммом Long-Evans, четыре раза скрещенными с штаммом Lister Hooded и крысами с капюшоном дикого типа. Трансгенные крысы Th-Cre использовались, поскольку эта крысиная линия будет использоваться в будущих исследованиях, связанных с оптогенетикой. Используя каждый протокол, память тестировалась с задержками 1 и 24 ч. Тесты через 1 ч демонстрируют кратковременную память, в то время как 24-ч тесты демонстрируют долговременную память. Значение исключения для предпочтения кодирования было рассчитано, как описано в протоколе, с использованием объединенных данных пяти тестов (сильных и слабых протоколов кодирования) как [50,8% ± (2×10,8%)]. Крысы, которые имели предпочтение кодирования выше и ниже этих значений, были исключены из анализа соответствующих тестов.
Для экспериментов с сильным кодированием использовались 16 крыс, а для экспериментов со слабым кодированием — 19 крыс. Во время испытаний сильного кодирования (3 × 5 минут кодирования; Рисунок 4А),не было существенного предпочтения ни одному из объектов (52,0 ± 1,9%, n = 16, t15 = 1,1, p = 0,29; один образец t-тест против уровня шанса). Этот сильный протокол кодирования привел к предпочтению объекта в новом месте, как показано с точки зрения среднего процента исследования, которое было значительно выше уровня шанса (50%) в тестах с задержками 1-h и 24-h (1-h memory, 77,9 ± 2,4%, n = 8, t7 = 11,8, p < 0,001; 24-h память, 65,2 ± 5,3%, n = 8, t7 = 2,8, p = 0,025; один образец t-тест против уровня шанса). Не было существенной разницы между 1-часовой и 24-часовой памятью (p = 0,056; непарный t-тестУэлча).
Во время испытаний слабого кодирования (20-минутное кодирование; результаты объединены из четырех контекстов; Рисунок 4В),не было отмечено существенного предпочтения ни одному из объектов (51,1 ± 1,0%, n = 66, t65 = 1,2, p = 0,24; тест на одну выборку tпротив уровня шанса). Этот слабый протокол кодирования привел к значительному увеличению предпочтения объекта в новом месте по сравнению с уровнем случайности в тестах с задержкой 1-ч, но не 24-ч задержкой (объединенные данные из всех четырех контекстов; 1-ч памяти, 66,7 ± 2,0%, n = 32, t31 = 8,2, p < 0,001; 24-ч памяти, 49,6 ± 2,6%, n = 34, t33 = 0,16, p = 0,87; один образец t-тест против уровня шанса). Наблюдалась существенная разница между производительностью в тестах с 1-ч и 24-ч задержками (1-ч памяти: n = 32, 24-ч памяти: n = 34, t61,5 = 5,2, p < 0,001; непарный t-тестУэлча).
Память на групповом уровне не наблюдалась в тесте на 24-ч задержку, индексируемом производительностью на уровне случайности, но показала индивидуальные вариации. Это более высокое изменение для слабых условий и условий отсутствия памяти(например,24-h тест) обычно наблюдалось из-за более случайного исследования объектов. Следовательно, важно не интерпретировать производительность крыс индивидуально. Вместо этого распределение отдельных точек данных может использоваться вместе со средним значением группы в качестве надежного результата теста. Чем сильнее кодирование, тем более однородным становится поведение крыс и тем меньше количество крыс необходимо для достижения статистической значимости, как это можно наблюдать на рисунке 4A для строгого протокола кодирования. Напротив, для получения достоверных результатов для слабых условий необходимы более крупные группы(рисунок 4В).
Рисунок 4:Производительность памяти после сильного и слабого кодирования. (A) Испытание строгого кодирования (3 × 5 мин кодирования), за которым следуют 1-h или 24-h тестовые испытания. Во время испытаний кодирования не было выявлено существенного предпочтения ни одному из объектов (n = 16). Сильное кодирование привело к значительному увеличению предпочтения объекта в новом месте в тестах с задержками 1 и 24 ч по сравнению с уровнем случайности (1-ч и 24-ч памяти: n = 8 в каждой группе). Существенной разницы между группами не было. (B) Испытание слабого кодирования (20-минутное кодирование), за которым следуют либо 1-h, либо 24-h тестовые испытания. Во время испытаний кодирования не было выявлено существенного предпочтения ни одному из объектов как группе (n = 66). Слабое кодирование привело к значительному увеличению предпочтения объекта в новом месте в тесте с задержкой 1 ч, но не 24 ч, по сравнению с уровнем случайности (1-ч памяти: n = 32; 24-ч памяти: n = 34). Наблюдалась существенная разница между показателями в тестах с 1-ч и 24-ч задержками. Результаты были объединены из четырех контекстов. Отдельные точки данных представлены в виде точек. Все бары показывают процент исследования объекта в новом месте как среднее ± SEM. *p < 0,05, ***p < 0,001; один образец t-тест против уровня шанса (50%, пунктирная линия). ###p < 0,001; ns, не значимые; непарный t-тестУэлча. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Существенным преимуществом этого установленного протокола является то, что он может быть выполнен четыре раза с использованием четырех различных контекстов(рисунок 1C)с одной и той же когортой крыс. Результаты, показанные на рисунке 5, демонстрируют один из возможных способов использования уравновешивания с двумя экспериментальными группами (1-h и 24-h группы памяти). Эти две группы были уравновешены в двух контекстах (контексты 1 и 2), и это было повторено в двух дополнительных контекстах (контексты 3 и 4; Рисунок 5А). Результаты из четырех контекстов представлены индивидуально на рисунке 5B,D,где память для каждой экспериментальной группы оценивалась путем сравнения предпочтения случайному уровню в каждом контексте (1-h память: контекст 1, 69,9 ± 3,6%, n = 9, t8 = 5,5, p < 0,001; Контекст 2, 65,6 ± 3,9%, n = 9, t8 = 4,0, p = 0,004; Контекст 3, 65,2 ± 3,8%, n = 7, t6 = 4,0, p = 0,007; Контекст 4, 65,3 ± 5,6%, n = 7, t6 = 2,7, p = 0,035; 24-часовая память: контекст 1, 45,1 ± 6,4%, n = 9, t8 = 0,77, p = 0,46; Контекст 2, 49,1 ± 4,9%, n = 9, t8 = 0,18, p = 0,86; Контекст 3, 57,2 ± 4,1%, n = 8, t7 = 1,7, p = 0,12; Контекст 4, 47,6 ± 4,7%, n = 8, t7 = 0,52, p = 0,62; один образец t-тест против уровня шанса).
В контекстах 1, 2 и 4 сравнение групп между субъектами выявило значительные различия между 1-часовой и 24-часовой памятью (1-часовая память против 24-часовой памяти: контекст 1, t12,7 = 3,4, p = 0,005; Контекст 2, t15,2 = 2,6, p = 0,019; Контекст 3, t13,0 = 1,4, p = 0,17; Контекст 4, t12,2 = 2,4, p = 0,032; непарный t-тестУэлча). Для лучшего представления и сравнения данных внутри субъекта результаты из двух уравновешенных контекстов были объединены(рисунок 5C,E). Объединенные экспериментальные группы снова сравнивали с уровнем шансов индивидуально (контексты 1 и 2 вместе взятые: 1-ч памяти, 67,8 ± 2,6%, n = 18, t17 = 6,7, p < 0,001; 24-ч памяти, 47,1 ± 3,9%, n = 18, t17 = 0,74, p = 0,47; Контексты 3 и 4 комбинированные: 1-часовая память, 65,3 ± 3,3%, n = 14, t13 = 4,7, p < 0,001; 24-часовая память, 52,4 ± 3,2%, n = 16, t15 = 0,73, p = 0,48; один образец t-тест против уровня шанса). Затем экспериментальные группы сравнивали друг с другом.
В обеих парах контекста наблюдались значительные различия между группами, выявленные в результате сравнения внутри субъекта (1-часовая память против 24-часовой памяти: контексты 1 и 2 вместе взятые, t16 = 3,5, p = 0,003; Контексты 3 и 4 вместе взятые, t13 = 2,4, p = 0,032; парный t-тест). Сопоставимые результаты были получены и с крысами с капюшоном дикого типа в слабом протоколе кодирования с использованием контекстов 1 и 4 для двух уравновешенных сеансов (данные не показаны). Воспроизводимость и надежность результатов были подтверждены путем сравнения каждого набора данных с использованием одностороннего ANOVA. Между четырьмя контекстами не было обнаружено существенной разницы (1-часовая память: F3,28 = 0,31, p = 0,81; 24-ч памяти: F3,30 = 0,99, p = 0,41). Таким образом, тест на местоположение объекта может быть повторен надежно с минимальным влиянием повторений, учитывая, что инструкции в этом протоколе соблюдаются.
Рисунок 5:Различные способы представления и анализа результатов слабого протокола кодирования с двумя экспериментальными группами, уравновешенными в течение двух сеансов. (A) Экспериментальная конструкция уравновешивания с двумя экспериментальными группами (1-h и 24-h группы памяти) в течение двух сеансов (контексты 1 и 2). Уравновешивание было повторено в двух дополнительных сессиях (контексты 3 и 4). (B и D) Результаты из каждого контекста и экспериментальных групп сравнивались индивидуально с уровнем случайности и друг с другом. Во всех четырех контекстах предпочтение объекта в новом месте в тестах с задержкой 1 ч было значительно увеличено по сравнению с уровнем вероятности [Контекст 1 и 2: n = 9 на группу(B); Контекст 3 и 4: n = 7 на группу(D)]. В тестах на 24-ч задержку предпочтение объекта в новом месте не отличалось от случайности (контекст 1 и 2: n = 9 на группу; Контекст 3 и 4: n = 8 на группу). Наблюдалась существенная разница между предпочтениями экспериментальных групп в контекстах 1, 2 и 4, но не в контексте 3, как было выявлено при сравнении между субъектами. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; один образец t-тест против уровня шанса (50%, пунктирная линия). #p < 0,05; ##p < 0,01; ns, не значимые; непарный t-тестУэлча. (C и E) Результаты представлены после объединения экспериментальных групп из двух уравновешенных контекстов [Контексты 1 и 2 вместе взятые, n = 17 на группу(C); Контексты 3 и 4 вместе взятые, n = 14 на группу(E)]. Предпочтение объекта в новом месте было значительно увеличено по сравнению с уровнем случайности в тестах с задержкой 1 ч, но не 24 ч, в обеих парах контекста. Внутритеспытуемое сравнение экспериментальных групп выявило существенные различия между предпочтениями объекта в новом месте в тестах с задержками 1-h и 24-h в обеих парах контекста. p < 0,001; один образец t-тест против уровня шанса (50%, пунктирная линия). #p < 0,05, ##p < 0,01; парный t-тест. Отдельные точки данных представлены в виде точек. Все столбцы показывают процент исследования объекта в новом месте как среднее ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Задача определения местоположения объекта может быть использована в различных исследованиях для исследования пространственной памяти, как описано ранее. Гибкость установки позволяет моделировать кратковременную и долговременную память различной силы, и это может быть легко реализовано при низких затратах. Однако, поскольку в протоколе много параметров, которые могут влиять на результаты, и различные исследования немного различаются по этим параметрам6,можно столкнуться с трудностями при успешной реализации задачи в первый раз. Приведенный выше протокол предназначен для того, чтобы плавно направлять читателей через этот процесс. Ниже будут рассмотрены дальнейшие важнейшие шаги, которые могут оказаться важными для успешного выполнения задачи с высокой воспроизводимостью.
Хотя сеанс кодирования / тестирования часто находится в центре внимания при проведении экспериментов с местоположением объектов, протоколы обработки и привыкания оказывают глубокое влияние на результаты такого рода поведенческих тестов, где результат зависит от ненарушенного естественного поведения крыс14,15. Таким образом, шаги, предшествующие сеансу кодирования / тестирования, должны быть разработаны с осторожностью, поскольку они могут влиять на поведение и память крыс и, следовательно, влиять на конечные результаты. Хороший уровень управляемости и привыкания такой, чтобы крысы познакомились с экспериментатором и задание минимизировали влияние стрессовых факторов, одновременно увеличивая вероятность демонстрации естественного поведения8. Как упоминалось в протоколе, обращение может начаться уже после отлучения детенышей, если штамм крысы поддерживается в домашнем учреждении. Основываясь на предыдущем опыте (данные не показаны) и на нескольких предыдущих исследованиях16,17,это раннее лечение приводит к низкой тревожности и усилению любопытства в последующие месяцы.
Поскольку задача определения местоположения объекта зависит исключительно от внутреннего исследовательского драйва крыс, ожидаемое поведение может быть легко затруднено, если крысы не стремятся исследовать или неохотно приближаются к новизне, которая называется «неофобным поведением»1. Таким образом, настоятельно рекомендуется включить тщательный протокол обработки и привыкания в соответствии с конкретными потребностями исследования. Этот протокол может быть использован в качестве руководства по минимальным требованиям, и могут быть реализованы дальнейшие шаги(например,если исследование должно включать инъекции на более поздней стадии, требуется привыкание к процедурам инъекций и конкретное положение удержания). Штамм и возраст экспериментальных крыс являются двумя другими влиятельными факторами, и их следует учитывать перед планированием эксперимента, чтобы избежать неоптимальных результатов. Различные штаммы крыс могут иметь различное поведение и базовые уровни тревоги18,19,20 и, следовательно, может потребоваться специальная корректировка протокола в зависимости от используемого штамма.
Подтверждено, что этот протокол хорошо работает с трансгенными крысами Th-Cre со штаммом Long-Evans, четыре раза скрещенным с штаммом Lister Hooded и крысами с капюшоном дикого типа. Логически идеальный начальный возраст для крыс в поведенческих экспериментах составляет около 12 недель20,но следует учитывать межстовую изменчивость и конкретные требования задачи. Также можно было бы использовать развивающихся крыс, если это представляет интерес для исследования, хотя могут потребоваться корректировки протокола, которые здесь не рассматриваются. Тем не менее, важно учитывать, развила ли крыса в данном возрасте когнитивные функции, необходимые для успешного выполнения этой задачи. Исследование21, изучающее это, показало, что только крысы-подростки на 38-й день, а не раньше, показали аллоцентрическую пространственную память, отраженную в предпочтении объекта в новом месте, как это наблюдалось у взрослых крыс. Представленный здесь протокол был успешным с использованием крыс, которым было 15-16 недель в начале первого сеанса кодирования / тестирования. Ранее тот же строгий протокол кодирования производил неоптимальные или отрицательные результаты при использовании 23-недельных крыс, которые не достигли оптимального уровня привыкания из-за отсутствия обработки и привыкания в достаточно молодом возрасте. Эти крысы либо не смогли выступить иначе, чем случайный уровень, либо на самом деле проявили отвращение к новизне, наблюдаемое с точки зрения предпочтения стабильных объектов вместо смещенных объектов (данные не показаны). Эти результаты свидетельствуют о том, что возраст и сроки привыкания к обращению могут влиять на эффективность привыкания и, как следствие, способствовать наблюдению тревожного и неофобного поведения в тестах.
Здесь описаны два разных протокола, обеспечивающих сильное или слабое кодирование в задаче определения местоположения объекта. Во время создания этих протоколов было замечено, что интерес к объектам снизился после 5-10 минут разведки во время одиночных длительных испытаний(например, 20 минут кодирования), и крысы в конечном итоге прекратили исследования. Это приводит к ослаблению памяти местоположений объектов. Протокол кодирования, который чередует испытания кодирования с короткими периодами покоя(например, кодирование 3 x 5 минут), преодолевает это и приводит к высокой исследовательской работе на протяжении всех испытаний. Таким образом, время активного исследования и различная компоновка этих двух протоколов кодирования влияет на силу памяти, которая сильнее после кодирования 3 х 5 минут, чем после 20-минутных протоколов кодирования. Аналогичные результаты также могут быть достигнуты с использованием несколько отличающихся продолжительностей с одним испытанием по сравнению с протоколами испытаний с чередованием, и могут быть внесены коррективы в соответствии с потребностями исследования и штаммом крыс.
В отличие от протоколов, использующих простое белое открытое поле с только внешними сигналами в комнате, протокол, представленный здесь, использует арену с различными контекстами и внутримозными сигналами, что, вероятно, требует больше времени для изучения. Следовательно, рекомендуется добавить в протокол этап привыкания контекста до испытания кодирования. Это позволит крысам формировать пространственную карту каждого контекста во время привыкания и уменьшит продолжительность следующего испытания кодирования, так как крысам нужно будет только кодировать местоположение объектов по отношению к этой карте. Кроме того, привыкание к контексту позволит крысам привыкнуть к любому возможному отвлекающе в каждом контексте, такому как 3D-пространственные сигналы, сводя к минимуму поведение, отличное от исследования объектов в сеансе кодирования / тестирования. При реализации метода тщательного уравновешивания, состоящего из нескольких уровней(т.е. широкого диапазона комбинаций расположения объекта (счетчиков) и направления смещения объекта), нежелательные предпочтения, которые могут возникнуть из-за изменения интенсивности света и цветов/узоров стен в углах арены, сводятся к минимуму.
При повторении задачи следует учитывать несколько факторов, чтобы повысить воспроизводимость между сеансами кодирования/тестирования и свести к минимуму влияние повторения. Во-первых, необходимо спроектировать различные контексты (столько же, сколько повторений сеансов кодирования/тестирования) должны быть спроектированы таким образом, чтобы избежать накопления пространственной памяти, которое может быть вызвано выполнением повторяющихся сеансов с использованием одного и того же контекста. Для этого был использован аппарат со сменными стенками разных цветов и узоров(рис. 1В,С). Отдельные стены и 3D-объекты (такие как игрушки или небольшие предметы повседневной жизни различных цветов и форм, см. протокол и рисунок 1C),подвешенные на стенах, являются пространственными сигналами и ориентирами, которые крысы потенциально используют для изучения местоположения объектов по отношению к их контекстам. В случае, если тест не может создать предпочтение для перемещенного объекта, может быть рассмотрено изменение этих параметров контекста (дизайн стены и пространственные сигналы). В качестве альтернативы, арена прямоугольной или круглой формы может использоваться для задач определения местоположения объекта вместо квадратной арены, как в этом протоколе. Сообщается, что круговые арены устраняют угловые предпочтения22, которые часто наблюдаются на аренах с углами, и, следовательно, это может быть полезно при работе с особенно тревожным штаммом крыс или мышей. В то время как требования создания четырех различных контекстов в этом протоколе наиболее оптимально работают с четырехугольной формой, круглая арена также может быть функциональной после некоторых корректировок.
Во-вторых, интервалы между каждым сеансом кодирования/тестирования должны быть определены таким образом, чтобы крысы каждый раз сохраняли один и тот же уровень интереса, избегая при этом риска кумулятивного обучения в результате плотного графика повторений. Обычно интервал, по крайней мере, в два раза превышающий продолжительность времени задержки между кодированием и тестовыми испытаниями, является достаточным, причем более длинные интервалы более благоприятны для более чем двух повторений. Это означает, что в то время как минимального 48-ч интервала после 24-ч теста достаточно для одного или двух повторений, для четырех повторений рекомендуется использовать 1-недельный интервал. Как показывают результаты на рисунке 5 и сравнение с использованием ANOVA, задача может быть успешно повторена четыре раза. Исходя из этого, установленный протокол может быть использован для уравновешивания до четырех экспериментальных условий. Количество экспериментальных групп определяет количество повторений сеансов кодирования/пробы в различных контекстах. Результаты на рисунке 5 представляют собой один из возможных способов использования протокола с двумя экспериментальными группами. Группы были уравновешены в ходе двух сессий, и те же условия были повторены в двух дополнительных сессиях (для целей проверки). Второй набор уравновешенных сессий также может быть использован для уравновешивания новых условий. Аналогичным образом, три или четыре экспериментальных условия могут быть сопоставлены с использованием трех или четырех уравновешенных сеансов соответственно.
В этих случаях контексты должны быть спроектированы таким образом, чтобы учитывать контрастные характеристики, описанные в протоколе. Примечательно, что уравновешенная конструкция может не подходить для экспериментов, в которых должны использоваться дополнительные манипуляции, такие как фармакологическое вмешательство, которое может оставить длительный эффект или повреждение. Для поддержания эффективности и воспроизводимости тестов эксперимент должен быть разработан соответствующим образом. Данные повторных тестов могут быть представлены и проанализированы несколькими способами, как показано на рисунке 5. Для первоначального анализа экспериментальные группы в каждом контексте могут быть индивидуально сопоставлены с уровнем случайности с использованием t-теста с одной выборкойдля определения любого значимого предпочтения(рисунок 5B,D). Это может быть полезно для быстрого понимания данных, но это обеспечивает только косвенное сравнение групп. Так, для сравнения двух и более групп данные следует анализировать с помощью двухвыборочных t-тестов(парных или непарных) или ANOVA соответственно. Это может быть в форме сравнения групп между субъектами в рамках одного сеанса кодирования/теста(рисунок 4A и рисунок 5B,D)или внутрисубпонятного сравнения групп из двух (или более) уравновешенных контекстов(рисунок 5C,E). Последний метод настоятельно рекомендуется, особенно при работе со слабыми состояниями памяти, которые, как объяснялось ранее, приводят к высокой дисперсии из-за случайности в поведении.
Объединение уравновешенных контекстов приводит к более крупным группам, которые должны надежно визуализировать поведение группы с минимальными вариациями. Используя протокол с повторениями в уравновешенных сеансах, можно ожидать уменьшения числа крыс примерно до одной трети от числа, которое потребовалось бы при использовании одного теста с той же статистической мощностью. Обычно размер выборки в диапазоне от 7 до 15 крыс (всего) для уравновешенных сеансов и в диапазоне от 20 до 50 крыс (от 10 до 25 на группу) для одного сеанса с размером эффекта и мощностью более 0,8. Уменьшение количества необходимых животных и увеличение информации, которую мы получаем от каждого животного с использованием этого протокола, совершенствуют исследование и служат принципам этического использования животных в исследованиях 3R. На этом этапе важно иметь в виду, что случайное поведение крыс, которое не сопровождается сильной памятью, может привести к индивидуальным сильным предпочтениям как ниже, так и выше шанса, но среднее значение группы должно давать предпочтение, существенно не отличающееся от случайности. Индивидуальные данные следует интерпретировать осторожно. Распределение отдельных точек данных внутри группы также может быть информативным для интерпретации результатов. Как видно на рисунках 4 и 5,распределение изменяется в зависимости от прочности памяти. В целом, протокол, представленный здесь, можно легко использовать для реализации задачи определения местоположения объекта с повторениями для моделирования кратковременной и/или долгосрочной пространственной памяти. Простой и гибкий протокол обучения и возможность реализации дальнейших манипуляций делают эту задачу популярным выбором. Эти изменения протокола позволяют иследовать конкретные этапы, такие как получение, консолидация и отзыв памяти.
Авторам нечего раскрывать.
Мы хотели бы поблагодарить Антониоса Асиминаса, Дороти Це, Киичи О'Хару и Дэвида Бетта за проницательные комментарии и предложения. Это исследование было поддержано Erasmus+ (К G.B. и L.N.); Высшая школа здравоохранения Орхусского университета (к К.Х.); Премия Фонда Ново Нордиск «Молодой исследователь» 2017 года (NNF17OC0026774), Lundbeckfonden (DANDRITE-R248-2016-2518) и PROMEMO - Центр белков в памяти, Центр передового опыта, финансируемый Датским национальным исследовательским фондом (DNRF133) (для T.T.).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Open-field/experimental box | O'Hara & Co (Japan) | OF-3001 | Open-field box for the object location task |
Object 1: cones | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RR | |
Object 2: footballs | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RB | |
Object 3: rectangular blocks | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RC | Rectangular blocks were modified after purchase |
Object location task apparatus | O'Hara & Co (Japan) | SPP-4501 | Sound attenuating box that contains the open-field box for the object location task |
Tracking software | O'Hara & Co (Japan) | TimeSSI | For movement tracking and automated camera functions |
Wild-type Lister Hooded rats | Charles River | 603 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены