Etiquetado inmunofluorescente de virus vegetales y proteínas vectoras de insectos en intestinos hemípteros

Resumen

Este protocolo para el etiquetado inmunofluorescente de proteínas de virus vegetales y proteínas de insectos vectores en intestinos de insectos extirpados se puede utilizar para estudiar las interacciones entre virus e insectos vectores, las funciones de las proteínas de insectos y los mecanismos moleculares subyacentes a la transmisión del virus.

Resumen

La mayoría de los virus vegetales en la naturaleza se transmiten de una planta a otra por insectos hemípteros. Una alta densidad de población de insectos vectores que son altamente eficientes en la transmisión de virus juega un papel clave en las epidemias de virus en los campos. El estudio de las interacciones entre vectores virus-insectos puede avanzar en nuestra comprensión de la transmisión de virus y las epidemias con el objetivo de diseñar nuevas estrategias para controlar los virus de las plantas y sus insectos vectores. El etiquetado de inmunofluorescencia se ha utilizado ampliamente para analizar las interacciones entre patógenos y huéspedes y se usa aquí en el saltamontes de lomo blanco (WBPH, Sogatella furcifera), que transmite eficientemente el virus enano rayado negro del arroz del sur (SRBSDV, género Fijivirus, familia Reoviridae), para localizar los viriones y las proteínas de insectos en las células epiteliales del intestino medio. Usando microscopía confocal de barrido láser, estudiamos las características morfológicas de las células epiteliales del intestino medio, la localización celular de proteínas de insectos y la colocalización de viriones y una proteína de insecto. Este protocolo se puede utilizar para estudiar las actividades virales en insectos, las funciones de las proteínas de los insectos y las interacciones entre el virus y el insecto vector.

Introducción

La mayoría de los virus vegetales descritos son transmitidos por insectos del orden Hemíptera que incluye pulgones, moscas blancas, saltahojas, saltamontes y trips ^1,2. Las piezas bucales perforadoras y chupadoras de los insectos hemípteros perforan el tejido vegetal para alimentar y secretar saliva, transmitiendo el virus de manera concomitantemente eficiente². Se han descrito diferentes mecanismos de transmisión de virus vegetales por insectos vectores. Estos incluyen no persistente, semipersistente y persistente. El tipo persistente es no propagativo o propagativo^3,4, pero para ambos tipos^, el virus transmitido debe moverse por todo el cuerpo del insecto. En el modo persistente-propagativo, los virus inicialmente infectan y se replican en las células epiteliales del intestino del insecto, luego se diseminan en diferentes tejidos y, finalmente, en las glándulas salivales, desde donde pueden introducirse en una planta a través de la saliva durante la alimentación de insectos ^5,6. Los virus de transmisión persistente se mueven a través de diferentes órganos y se replican en sus insectos vectores, lo que requiere interacciones específicas entre el virus y los componentes del vector en diferentes etapas ^7,8.

Las proteínas virales y las proteínas de insectos deben interactuar para facilitar procesos críticos para el reconocimiento, infección, replicación o diseminación del virus en los insectos vectores ^9,10. Aunque la microscopía óptica se puede utilizar para observar estructuras celulares en insectos, no puede mostrar la distribución del virión, la localización celular o la colocalización de proteínas virales y proteínas de insectos, o la ultraestructura de los tejidos y células de insectos. El marcado de inmunofluorescencia fue realizado por primera vez por Coons et al. en las células fagocíticas del ratón mediante el etiquetado de anticuerpos específicos contra la fluoresceína, y ahora se usa ampliamente¹¹. La técnica de inmunofluorescencia, también conocida como técnica de anticuerpos de fluorescencia, es una de las primeras técnicas de marcaje inmunológico desarrolladas y se basa en la reacción de unión específica entre el antígeno y el anticuerpo^11,12. El anticuerpo conocido se marca primero con fluoresceína, que se utiliza como sonda para detectar los antígenos correspondientes en las células o tejidos^13,14. Después de que el anticuerpo marcado con fluoresceína se une al antígeno correspondiente en células o tejidos, la sonda emitirá fluorescencia brillante cuando se irradie con longitudes de onda de excitación y se vea con un microscopio de fluorescencia para localizar el antígeno¹⁵.

La mayoría de los insectos vectores de virus de plantas son hemípteros. Una mayor densidad de población de insectos vectores que tienen una alta eficiencia de transmisión para el virus de la planta puede conducir a epidemias de virus⁵. El virus enano rayado negro del arroz del sur (SRBSDV, género Fijivirus, familia Reoviridae), uno de los patógenos más graves del arroz, se ha extendido rápidamente por las zonas productoras de arroz en Asia oriental y sudoriental, y ha causado graves pérdidas de rendimiento desde 2010^16,17. Los adultos y las ninfas del saltamontes dorsiblanco (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) transmiten el SRBSDV al arroz de manera persistente-propagativa con alta eficiencia. Los estudios de campo han demostrado que los brotes de enfermedad enana rayada negra inducida por SRBSDV suelen coincidir con la migración masiva a larga distancia de WBPH, un factor crucial en las epidemias de SRBSDV ^7,8,18. La proteína de membrana 7 asociada a vesicle (VAMP7) es un receptor soluble de proteína de unión al factor sensible a N-etilmaleimida (SNARE), que puede mediar el transporte de sustancias a través de la fusión de vesículas. VAMP7 interactúa con la proteína de la cápside principal externa del SRBSDV in vitro, lo que indica que VAMP7 podría estar estrechamente asociada con la transmisión del virus¹⁶.

En el protocolo presentado aquí, extirpamos el intestino de WBPH virulifero como ejemplo para etiquetar viriones SRBSDV y VAMP7 en células epiteliales del intestino medio¹⁶. Como el sitio de invasión inicial del virus, el epitelio del intestino medio juega un papel vital en la infección, replicación y transmisión del virus. Primero, detallamos los pasos para extirpar el intestino de las ninfas y adultos de WBPH. En segundo lugar, utilizamos anticuerpos específicos marcados con fluoresceína para marcar los viriones SRBSDV y VAMP7 en células epiteliales intestinales. Luego observamos las células epiteliales y la ubicación celular de los viriones y VAMP7 a través de un microscopio confocal de barrido láser. Los resultados mostraron que los viriones SRBSDV y VAMP7 podrían colocalizarse en el citoplasma de las células epiteliales del intestino medio, lo que sugiere que la función específica de VAMP7 podría estar relacionada con la diseminación de viriones de las células epiteliales del intestino medio.

Protocolo

1. Cría de insectos no virulíferos

1. Recolectar WBPH de los campos de arroz y criar con plántulas de arroz en vasos de vidrio de 1 L cubiertos con una red a prueba de insectos en una incubadora a 28 °C con 16 h de luz y 8 h de oscuridad. Debido a que el SRBSDV no se transmite a través de los huevos, las ninfas recién nacidas no son viruliferas.
2. Con un bolígrafo, cepille suavemente los insectos de los insectos que crían vasos de precipitados en un nuevo vaso de precipitados de plántulas de arroz fresco cada semana hasta que las ninfas WBPH hayan eclosionado. Continúe criando estas ninfas no virúferas eclosionadas a 2 o 3 estrellas.
   NOTA: Cepíllese con cuidado para evitar que los WBPH salgan volando del vaso de precipitados o los dañen.

2. Adquisición de virus y recolección de insectos virulíferos

1. Transfiera insectos no virulíferos de los vasos de vidrio a plantas de arroz frescas infectadas con SRBSDV cubiertas con una red a prueba de insectos durante un período de acceso a la adquisición de virus (AAP) de 2 d alimentándose de plantas. Luego, recoja los insectos en vasos de vidrio que contengan plántulas de arroz fresco.
2. Después de 2 d, recoja los insectos de vasos de vidrio con un aspirador manual para la disección y escisión del intestino.
   NOTA: El AAP mínimo de SRBSDV es de 5 minutos tanto para ninfas WBPH como para adultos, pero se debe permitir que los insectos se alimenten de plantas de arroz frescas infectadas con SRBSDV durante 2 días para lograr la eficiencia de adquisición de hasta el 80%.

3. Preparación del reactivo

1. Disolver 8,5 g de NaCl, 3,5 g_{de Na2}HPO 4·12H2O, y 0,25 g de NaH₂PO₄ en 1 ml de ddH2O para preparar una solución 0,01 M de solución salinatamponada con fosfato (PBS).
2. Agregue 4 g de paraformaldehído a 100 ml de PBS para preparar paraformaldehído al 4% (m/v) en PBS.
3. Agregue 2 ml de Triton X-100 en 98 ml de PBS para preparar 2% (v/v) Triton X-100.

4. Disección de adultos y escisión de tripas

1. Use una pipeta para colocar 100 μL de PBS en un portaobjetos de vidrio. Coloque el portaobjetos en el escenario de un microscopio óptico.
2. Recoja a los adultos infectados con SRBSDV de vasos de vidrio con un aspirador manual y colóquelos en tubos de 1.5 ml. Coloque los tubos sobre hielo para paralizar a los insectos y luego transfiera a un adulto paralizado a los 100 μL de PBS en el portaobjetos con el abdomen hacia arriba.
   NOTA: Los insectos estarán completamente paralizados después de 5 minutos en hielo.
3. Use pinzas en una mano para sujetar el cuerpo y luego retire la cabeza con otro juego de pinzas en la otra mano.
4. Sujete los lados del abdomen con un juego de pinzas y sujete el ovipositor o el órgano copulatorio de la cola con el otro conjunto. Luego retire la membrana intersegmentaria de un segmento abdominal con cuidado y exponga lentamente el intestino en el abdomen.
5. Continúe arrancando la membrana y gradualmente saque el intestino completo del abdomen. Tire suavemente de la cola, que está conectada al extremo del intestino, para eliminar el intestino completo.
   NOTA: Tire con mucho cuidado o el intestino se dañará.
6. Coloque las tripas extirpadas en un tubo de centrífuga de 200 μL, agregue 200 μL de PBS al tubo y succione suavemente la solución con una pipeta para lavar bien las tripas.

5. Disección de ninfas y escisión de tripas

NOTA: Los cuerpos de las ninfas son más frágiles que los cuerpos adultos, y el intestino se daña fácilmente cuando se tira de la cola. Por lo tanto, el método más confiable para extirpar el intestino de la ninfa es tirando de la cabeza.

1. Use una pipeta para colocar 100 μL de PBS en un portaobjetos de vidrio. Coloque el portaobjetos en el escenario de un microscopio óptico.
2. Recoja las ninfas infectadas con SRBSDV de vasos de vidrio con un aspirador manual y colóquelas en tubos de 1,5 ml. Coloque los tubos sobre hielo para paralizar a los insectos. Luego, transfiera una ninfa paralizada a los 100 μL de tampón en el portaobjetos con el abdomen hacia arriba.
3. Usa pinzas para separar la cola de la ninfa. Luego sujete el cuerpo del insecto para fijarlo suavemente y use el otro conjunto para sujetar la cabeza. Tire suavemente de la cabeza lejos del cuerpo mientras mantiene su unión al intestino para que la cabeza se separe del cuerpo, pero el intestino todavía está unido al tórax y al abdomen.
   NOTA: Después de que la cabeza se desprende, el cuerpo adiposo de la ninfa fluirá hacia afuera, haciendo que el PBS sea turbio. Retire la solución turbia de PBS y cambie con 100 μL de PBS fresco.
4. Con las pinzas todavía sujetando el cuerpo, use el otro juego para mover la cabeza con cuidado y retire gradualmente el intestino.
5. Separe suavemente el intestino de la cabeza con pinzas y, finalmente, obtenga un intestino intacto sin dañar el cuerpo del saltaplantas.
6. Coloque las tripas extirpadas en un tubo de centrífuga de 200 μL, agregue 200 μL de PBS al tubo y succione suavemente la solución con una pipeta para lavar bien las tripas.
   NOTA: Las tripas extirpadas deben limpiarse bien con PBS para eliminar cualquier cuerpo graso contaminante de la cavidad abdominal; Pueden interferir con el protocolo de tinción.

6. Protocolos de etiquetado para viriones SRBSDV y una proteína de insecto

1. Preparar los anticuerpos y el medio de montaje utilizado en este ensayo. Los anticuerpos son anticuerpos anti-SRBSDV marcados con Dylight 549 (rojo) contra viriones SRBSDV 18, anticuerpo anti-VAMP7 marcado con Dylight 488 (verde) contra la proteína del insecto VAMP7^16,19, faloidina Dylight 633 (azul) y medio de montaje que contiene 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI^, azul).
2. Colocar inmediatamente las tripas de WBPH recién extirpadas y lavadas con PBS en 100 μL de paraformaldehído al 4% (m/v) en un tubo de centrífuga de 200 μL y mantener durante 2 h a temperatura ambiente.
   NOTA: Las tripas de WBPH recién extirpadas no deben empaparse en PBS durante más tiempo, o las células epiteliales se dañarán.
3. Retire el paraformaldehído al 4% (m/v) con un pipetor y luego agregue 200 μL de PBS en el tubo de centrífuga de 200 μL. Después de 10 minutos, retire el PBS con una pipeta para eliminar cualquier paraformaldehído.
4. Repita este paso de lavado PBS dos veces.
5. Retire el PBS y agregue 200 μL de detergente no iónico Triton X-100 (2%, v/v). Permeabilizar las muestras en el detergente no iónico durante 30 min a temperatura ambiente.
6. Retire el Triton X-100 al 2% (v/v) con una pipeta y, a continuación, lave el detergente restante con tres lavados de 10 minutos con 200 μL de PBS (ver pasos 6.3 y 6.4).
7. Anticuerpo anti-SRBSDV diluido marcado por Dylight 549 (rojo) y anticuerpo anti-VAMP7 marcado por Dylight 488 (verde) 1:50 con 50 μL de albúmina sérica de toro (3%, m/v).
8. Añadir los anticuerpos diluidos al tubo e incubar las muestras durante la noche a 4 °C.
9. Retire el diluyente de anticuerpos con un pipetor y luego lave el diluyente de anticuerpos restante con tres lavados de 10 minutos con 200 μL de PBS.
10. Diluir 1 μL de faloidina Dylight 633 con 50 μL de PBS.
11. Añadir 50 μL de faloidina diluida al tubo e incubar las muestras durante 2 h a temperatura ambiente.
12. Retire el diluyente de faloidina con una pipeta y luego lave la faloidina restante con tres lavados de 10 minutos con 200 μL de PBS.
    NOTA: Los lavados minuciosos son fundamentales para reducir el fondo y la encuadernación no específica.
13. Coloque una gota de medio de montaje que contenga DAPI en un portaobjetos de microscopio y transfiera las tripas al medio.
    NOTA: Despliega suavemente cada tripa con pinzas y evita crear burbujas. Hay alrededor de 15 agallas por diapositiva.
14. Coloque suavemente una cubierta de vidrio sobre las muestras sin crear burbujas.
    NOTA: El portaobjetos debe mantenerse a 4 °C en la oscuridad para inhibir la extinción de la fluorescencia antes de la observación con un microscopio confocal de barrido láser.
15. Ver todas las muestras con un microscopio confocal de barrido láser. Capture las imágenes con luz azul y guarde los archivos en una computadora.

Resultados

La Figura 1 ilustra todos los pasos de este protocolo: cría de insectos, adquisición de virus, escisión del intestino, etiquetado inmunofluorescente y realización del portaobjetos.

Las tripas de WBPH extirpadas de adultos se fijaron en paraformaldehído al 4% (m/v), se permeabilizaron con Triton X-100 al 2% (v/v) y luego se incubaron con Dylight 633 faloidina^10,18. La micrografía confocal de escaneo l...

Discusión

Para obtener los mejores resultados, se deben considerar algunos puntos clave. En primer lugar, es necesaria una alta proporción de insectos virulíferos entre la población total. Aunque el AAP mínimo para SRBSDV por ninfas y adultos de WBPH es de 5 min¹⁷, se debe permitir que los insectos se alimenten de plantas de arroz frescas infectadas con SRBSDV durante 2 d para lograr una eficiencia de adquisición de hasta el 80%. Dado que los viriones SRBSDV se pueden detectar en el 80% de los intestin...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3% Bull serum albumin (BSA)	Coolaber	SL1331	Dilute antibodies
Cover glass	Solarbio	YA0771-18*18mm	For slide making
Dissecting microscope	Beitja	XTL-7045B1	For insect dissection
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	Zeiss LSM880	Observe fluorescence signal
Microscope slides	Solarbio	ZBP-7105	For slide making
Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Abcam	AB104139	Label cell necleus
Paraformaldehyde	Sigma	158127	For tissues fixation
Phalloidin	Invitrogen	A22284	Label actin of midgut epithiels
Triton X-100	Amresco	0290C484	For tissues permeation
Tweezers (5-SA)	AsOne	6-7905-40	For insect dissection