תיוג אימונופלואורסצנטי של חלבונים וקטוריים של וירוסים צמחיים וחרקים במעיים המיפטרניים

Summary

פרוטוקול זה לתיוג אימונופלואורסצנטי של חלבוני וירוסים צמחיים וחלבוני חרקים וקטוריים במעי חרקים שנכרתו יכול לשמש לחקר אינטראקציות בין חרקים נגיפים ווקטוריים, פונקציות חלבון חרקים ומנגנונים מולקולריים העומדים בבסיס העברת הנגיף.

Abstract

רוב הנגיפים הצמחיים בטבע מועברים מצמח אחד לאחר על ידי חרקים המיפטרניים. צפיפות אוכלוסין גבוהה של חרקים וקטוריים היעילים מאוד בהעברת וירוסים ממלאת תפקיד מפתח במגיפות וירוסים בשדות. חקר אינטראקציות וקטוריות בין וירוסים לחרקים יכול לקדם את הבנתנו של העברת וירוסים ומגיפות במטרה לעצב אסטרטגיות חדשניות לשליטה בנגיפים צמחיים ובחרקים הווקטוריים שלהם. תיוג אימונופלואורסנציה נמצא בשימוש נרחב לניתוח אינטראקציות בין פתוגנים ופונדקאים, והוא משמש כאן בפלנטהופר לבן הגב (WBPH, Sogatella furcifera), אשר מעביר ביעילות את נגיף הננס השחור של האורז הדרומי (SRBSDV, סוג פיג'יוירוס, משפחה Reoviridae), כדי לאתר את הנגיפים וחלבוני החרקים בתאי האפיתל של אמצע המעי. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר חקרנו את המאפיינים המורפולוגיים של תאי אפיתל במרכז המעי, לוקליזציה תאית של חלבוני חרקים וקולוקליזציה של נגיפים וחלבון חרקים. פרוטוקול זה יכול לשמש לחקר פעילות וירוסים בחרקים, תפקודים של חלבוני חרקים ואינטראקציות בין וירוס וחרק וקטורי.

Introduction

רוב הנגיפים הצמחיים המתוארים מועברים על ידי חרקים מסדר Hemiptera הכולל כנימות, זבובים לבנים, עלים, planthoppers, ו thrips ^1,2. חלקי הפה המוצצים של חרקים המיפטרניים מנקבים את רקמת הצמח לצורך הזנה והפרשת רוק, ובמקביל מעבירים ביעילות את הנגיף². תוארו מנגנוני העברה שונים של וירוסים צמחיים על ידי חרקים וקטוריים. אלה כוללים לא מתמיד, מתמיד למחצה ומתמיד. הסוג המתמיד אינו מתפשט או מתפשט^3,4, אך עבור שני סוגים אלה^, הנגיף המועבר חייב לנוע בכל גופו של החרק. במצב התפשטות מתמשך, נגיפים מדביקים ומשתכפלים בתחילה בתאי האפיתל של מעי החרק, לאחר מכן מפיצים לרקמות שונות, ובסופו של דבר לבלוטות הרוק, משם הם יכולים להיות מוחדרים לצמח דרך הרוק במהלך הזנת חרקים ^5,6. וירוסים עקשניים המועברים עוברים דרך איברים שונים ומשתכפלים בווקטורי החרקים שלהם, מה שדורש אינטראקציות ספציפיות בין רכיבי הנגיף והווקטור בשלבים שונים ^7,8.

חלבונים נגיפיים וחלבוני חרקים חייבים לקיים אינטראקציה כדי להקל על תהליכים קריטיים לזיהוי וירוסים, זיהום, שכפול או הפצה בחרקים הווקטוריים ^9,10. למרות שמיקרוסקופ אופטי יכול לשמש לצפייה במבנים תאיים בחרקים, הוא אינו יכול להראות התפלגות נגיפים, לוקליזציה תאית או קו-לוקליזציה של חלבונים נגיפיים וחלבון חרקים, או את מבנה העל של רקמות ותאים של חרקים. תיוג Immunofluorescence בוצע לראשונה על ידי Coons et al. בתאים phagocytic של העכבר באמצעות תיוג נוגדנים פלואורסצאין ספציפיים, ועכשיו זה נמצא בשימוש נרחב¹¹. טכניקת האימונופלואורסצנטיות, הידועה גם בשם טכניקת הנוגדנים הפלואורסצנטיים, היא אחת מטכניקות הסימון האימונולוגיות המוקדמות ביותר שפותחו והיא מבוססת על תגובת הקישור הספציפית בין האנטיגן לנוגדן^11,12. הנוגדן הידוע מסומן לראשונה עם פלואורסצאין, המשמש כבדיקה כדי לזהות את האנטיגנים המתאימים בתאים או ברקמות^13,14. לאחר שהנוגדן המסומן בפלואורסצאין נקשר לאנטיגן המתאים בתאים או ברקמות, הגשושית תפלוט פלואורסצנטיות בהירה כאשר היא מוקרנת באורכי גל עירור ונצפית במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי למקם את האנטיגן¹⁵.

רוב החרקים הווקטוריים של וירוסים צמחיים הם המיפטרנים. צפיפות אוכלוסייה גבוהה יותר של חרקים וקטוריים בעלי יעילות העברה גבוהה לנגיף הצמח עלולה להוביל למגיפות וירוסים⁵. וירוס ננסי שחור פסים של אורז דרומי (SRBSDV, סוג פיג'יוירוס, משפחה Reoviridae), אחד הפתוגנים החמורים ביותר של אורז, התפשט במהירות באזורי גידול האורז במזרח ובדרום מזרח אסיה, וגרם להפסדי יבול חמורים מאז 2010^16,17. בוגרים ונימפות של הפלנטהופר לבן הגב (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) מעבירים SRBSDV לאורז באופן מתמיד-מתפשט עם יעילות גבוהה. מחקרי שדה הראו כי התפרצויות של מחלת ננס שחור פסים אורז המושרה על ידי SRBSDV בדרך כלל חופפות להגירה המונית למרחקים ארוכים של WBPHs, גורם מכריע במגיפות SRBSDV ^7,8,18. חלבון קרום הקשור לשלפוחית 7 (VAMP7) הוא קולטן חלבון חיבור לגורם רגיש N-ethylmaleimide-sensitive (SNARE), אשר יכול לתווך את הובלת החומרים באמצעות איחוי שלפוחית. VAMP7 מקיים אינטראקציה עם חלבון הקפסיד העיקרי החיצוני של SRBSDV במבחנה, מה שמצביע על כך ש- VAMP7 עשוי להיות קשור קשר הדוק עם העברת וירוסים¹⁶.

בפרוטוקול המוצג כאן, הוצאנו את המעי מ-WBPH אלים כדוגמה כדי לתייג נגיפים SRBSDV ו-VAMP7 בתאי אפיתל באמצע המעי¹⁶. כאתר הפלישה הראשוני של הנגיף, אפיתל המעי התיכון ממלא תפקידים חיוניים בזיהום, שכפול והעברה של הנגיף. ראשית, פירטנו את השלבים לכריתת המעיים מנימפות ומבוגרים של WBPHs. שנית, השתמשנו בנוגדנים ספציפיים עם תווית פלואורסצאין כדי לתייג נגיפים של SRBSDV ו-VAMP7 בתאי אפיתל של המעי. לאחר מכן צפינו בתאי אפיתל ובמיקום התאי של הנגיפים ושל VAMP7 באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר. התוצאות הראו כי נגיפים של SRBSDV ו-VAMP7 יכולים לבצע לוקליזציה בציטופלסמה של תאי האפיתל של המעי, מה שמרמז על כך שהפונקציה הספציפית של VAMP7 עשויה להיות קשורה להפצת נגיפים מתאי אפיתל של אמצע המעי.

Protocol

1. גידול חרקים לא אלימים

1. אספו WBPHs משדות אורז ומאחור עם שתילי אורז בכוסות זכוכית 1 L המכוסות ברשת חסינת חרקים באינקובטור ב 28 ° C עם 16 שעות אור ו 8 שעות כהה. מכיוון ש- SRBSDV אינו מועבר באמצעות ביצים, נימפות שזה עתה בקעו אינן ארסיות.
2. בעזרת עט מברשת, הברישו בעדינות חרקים מהכד שמגדל חרקים לכוס חדשה של שתילי אורז טריים בכל שבוע עד שנימפות WBPH בקעו. המשיכו לגדל את הנימפות הלא-וירוסיות שבקעו ל-2 או 3 אינץ'.
   הערה: יש לצחצח בזהירות כדי למנוע מ-WBPHs לעוף מהכוס או לפגוע בה.

2. רכישת וירוסים ואיסוף חרקים אלימים

1. העבירו חרקים לא אלימים מכוסות הזכוכית לצמחי אורז טריים נגועים ב-SRBSDV המכוסים ברשת חסינת חרקים לתקופת גישה דו-ממדית לרכישת וירוסים (AAP) על ידי הזנה מצמחים. לאחר מכן, לאסוף את החרקים כוסות זכוכית המכילים שתילי אורז טריים.
2. לאחר 2 ד', לאסוף את החרקים מכוסות זכוכית עם שאיפה ידנית לנתיחה וכריתה של המעיים.
   הערה: AAP המינימלי של SRBSDV הוא 5 דקות הן עבור נימפות WBPH והן עבור מבוגרים, אך יש לאפשר לחרקים להיזון מצמחי אורז טריים נגועים ב- SRBSDV במשך 2 D כדי להשיג יעילות רכישה של עד 80%.

3. הכנת מגיב

1. להמיס 8.5 גרם של NaCl, 3.5 גרם של Na 2 HPO 4·12H 2 O, ו-0.25 גרם של NaH 2 PO₄ ב-1 מ"ל של ddH₂O כדי להכין תמיסת 0.01 M של מלח חוצץ פוספט (PBS).
2. הוסף 4 גרם של paraformaldehyde ל 100 מ"ל של PBS כדי להכין 4% (m/v) paraformaldehyde ב PBS.
3. הוסף 2 מ"ל של Triton X-100 לתוך 98 מ"ל של PBS כדי להכין 2% (v/v) Triton X-100.

4. דיסקציה של מבוגרים וכריתה של מעיים

1. השתמש פיפטור כדי להניח 100 μL של PBS על מגלשת זכוכית. הניחו את השקופית על במה של מיקרוסקופ אופטי.
2. אספו את המבוגרים הנגועים ב-SRBSDV מכוסות זכוכית עם שואב ידני והניחו אותם בצינורות של 1.5 מ"ל. הניחו את הצינורות על קרח כדי לשתק חרקים, ולאחר מכן העבירו מבוגר משותק לתוך 100 μL של PBS על המגלשה עם הבטן למעלה.
   הערה: החרקים יהיו משותקים לחלוטין לאחר 5 דקות על קרח.
3. השתמש פינצטה ביד אחת כדי להדק את הגוף, ולאחר מכן להסיר את הראש עם קבוצה אחרת של פינצטה ביד השנייה.
4. מהדקים את צידי הבטן עם קבוצה אחת של פינצטה ומהדקים את ovipositor או את האיבר copulatory של הזנב עם קבוצה אחרת. לאחר מכן משכו בזהירות את הקרום הבין-סגמנטלי של מקטע בטן אחד וחשפו לאט לאט את המעיים בבטן.
5. ממשיכים לקרוע את הקרום ולשלוף בהדרגה את כל המעיים מהבטן. משכו בעדינות את הזנב, המחובר לקצה המעיים, כדי להסיר את המעי כולו.
   הערה: משכו בזהירות רבה אחרת המעיים יינזקו.
6. הכניסו מעיים שנכרתו לתוך צינור צנטריפוגה של 200 μL, הוסיפו 200 μL של PBS לצינור, ומצצו בעדינות את התמיסה עם פיפטה כדי לשטוף את המעיים ביסודיות.

5. דיסקציה של נימפות וכריתה של מעיים

הערה: גופי נימפה שבריריים יותר מגופים בוגרים, והמעיים ניזוקים בקלות כאשר מושכים אותם מהזנב. לכן, השיטה האמינה ביותר לבלו את מעי הנימפה היא על ידי משיכה מהראש.

1. השתמש פיפטור כדי להניח 100 μL של PBS על מגלשת זכוכית. הניחו את השקופית על במה של מיקרוסקופ אופטי.
2. אסוף את הנימפות הנגועות ב- SRBSDV מכוסות זכוכית עם שואב ידני והכנס אותן לצינורות של 1.5 מ"ל. הניחו את הצינורות על קרח כדי לשתק חרקים. לאחר מכן, להעביר נימפה משותקת לתוך 100 μL של חיץ על המגלשה עם הבטן פונה כלפי מעלה.
3. השתמש בפינצטה כדי לנתק את זנב הנימפה. לאחר מכן הדקו את גוף החרק כדי לתקן בעדינות והשתמשו בסט השני כדי להדק את הראש. משכו בעדינות את הראש הרחק מהגוף תוך שמירה על חיבורו למעיים כך שהראש מנותק מהגוף, אך המעיים עדיין מחוברים לבית החזה ולבטן.
   הערה: לאחר ניתוק הראש, כפיס האדיפוס של הנימפה יזרום החוצה, מה שהופך את PBS עכור. הסר את תמיסת PBS העכור והחלף עם 100 μL של PBS טרי.
4. כאשר הפינצטה עדיין מהדקת את הגוף, השתמש בסט השני כדי להזיז את הראש בזהירות, ולשלוף בהדרגה את המעיים.
5. נתקו בעדינות את המעיים מהראש בעזרת פינצטה, ובסופו של דבר השיגו מעי שלם מבלי לפגוע בגוף הפלנטהופר.
6. הכניסו מעיים שנכרתו לתוך צינור צנטריפוגה של 200 μL, הוסיפו 200 μL של PBS לצינור, ומצצו בעדינות את התמיסה עם פיפטה כדי לשטוף את המעיים ביסודיות.
   הערה: יש לנקות היטב את המעיים שנכרתו עם PBS כדי להסיר גופי שומן מזהמים מחלל הבטן; הם יכולים להפריע לפרוטוקול הצביעה.

6. פרוטוקולי תיוג לנגיפים SRBSDV וחלבון חרקים

1. הכן את הנוגדנים ואת אמצעי הרכבה בשימוש בבדיקה זו. נוגדנים הם נוגדן נגד SRBSDV המסומן עם Dylight 549 (אדום) נגד נגיפים SRBSDV 18, נוגדן anti-VAMP7 המסומן עם Dylight 488 (ירוק) נגד חלבון החרק VAMP7^16,19, Dylight 633 phalloidin (כחול), ואמצעי הרכבה המכיל 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI^, כחול).
2. הניחו מיד את מעי ה-WBPH שזה עתה נכרת ונשטף על-ידי PBS ב-100 μL של 4% (m/v) paraformaldehyde בצינור צנטריפוגה של 200 μL והחזיקו למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
   הערה: אין להשרות את מעי ה-WBPH שזה עתה נכרת ב-PBS למשך זמן ארוך יותר, אחרת תאי האפיתל ייפגעו.
3. הסר 4% (m/v) paraformaldehyde עם pipettor, ולאחר מכן להוסיף 200 μL של PBS לתוך צינור צנטריפוגה 200 μL. לאחר 10 דקות, הסר PBS באמצעות פיפטור כדי לחסל כל paraformaldehyde.
4. חזור על שלב שטיפת PBS זה פעמיים.
5. הסר את PBS והוסף 200 μL של חומר ניקוי לא יוני Triton X-100 (2%, v/v). יש לחדור את הדגימות בחומר הניקוי הלא יוני למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
6. הסר 2% (v/v) Triton X-100 עם פיפטור, ולאחר מכן שטוף את שאריות חומר הניקוי בשלוש שטיפות של 10 דקות עם 200 μL של PBS (ראה שלבים 6.3 ו- 6.4).
7. נוגדן מדולל נגד SRBSDV המסומן על ידי Dylight 549 (אדום) ונוגדן anti-VAMP7 המסומן על ידי Dylight 488 (ירוק) 1:50 עם 50 μL של אלבומין בסרום שור (3%, m/v).
8. הוסף את הנוגדנים המדוללים לצינור ודגר דגימות לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
9. הסר את מדלל הנוגדנים עם pipettor, ולאחר מכן לשטוף את שאר דילול נוגדנים עם שלוש שטיפות 10 דקות עם 200 μL של PBS.
10. לדלל 1 μL של Dylight 633 phalloidin עם 50 μL של PBS.
11. הוסף 50 μL של phalloidin מדולל לצינור לדגור דגימות במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר.
12. הסר את מדלל phalloidin עם pipettor, ולאחר מכן לשטוף את phalloidin הנותרים עם שלוש שטיפות 10 דקות עם 200 μL של PBS.
    הערה: שטיפות יסודיות הן קריטיות כדי להפחית את הרקע ואת הכריכה הלא ספציפית.
13. מניחים טיפה של מדיום הרכבה המכיל DAPI על מגלשת מיקרוסקופ ומעבירים את המעיים למדיום.
    הערה: פתחו בעדינות כל מעי עם פינצטה והימנעו מיצירת בועות. יש בערך 15 מעיים לכל מגלשה.
14. הניחו בעדינות כיסוי מעל הדגימות מבלי ליצור בועות.
    הערה: יש להחזיק את המגלשה ב -4 מעלות צלזיוס בחושך כדי לעכב מרווה פלואורסצנטית לפני התצפית עם מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר.
15. הצג את כל הדגימות במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר. צלם את התמונות באמצעות אור כחול ושמור את הקבצים במחשב.

תוצאות

איור 1 מדגים את כל השלבים בפרוטוקול הזה: גידול חרקים, רכישת וירוסים, כריתה של המעי, תיוג אימונופלואורסצנטי ויצירת השקופית.

מעי WBPH שנכרת ממבוגרים היה קבוע ב-4% (m/v) paraformaldehyde, חדור עם 2% (v/v) Triton X-100, ולאחר מכן הודגר עם Dylight 633 phalloidin^10,18. ה...

Discussion

לקבלת התוצאות הטובות ביותר, יש לקחת בחשבון מספר נקודות מפתח. ראשית, יש צורך ביחס גבוה של חרקים אלימים בקרב כלל האוכלוסייה. למרות AAP המינימלי עבור SRBSDV על ידי נימפות WBPH ומבוגרים הוא 5 דקות¹⁷, חרקים צריך להיות מותר להאכיל על צמחי אורז טריים נגועים SRBSDV עבור 2 D כדי להשיג יעילות רכישה ש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3% Bull serum albumin (BSA)	Coolaber	SL1331	Dilute antibodies
Cover glass	Solarbio	YA0771-18*18mm	For slide making
Dissecting microscope	Beitja	XTL-7045B1	For insect dissection
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	Zeiss LSM880	Observe fluorescence signal
Microscope slides	Solarbio	ZBP-7105	For slide making
Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Abcam	AB104139	Label cell necleus
Paraformaldehyde	Sigma	158127	For tissues fixation
Phalloidin	Invitrogen	A22284	Label actin of midgut epithiels
Triton X-100	Amresco	0290C484	For tissues permeation
Tweezers (5-SA)	AsOne	6-7905-40	For insect dissection