半翅目腸内における植物ウイルスおよび昆虫ベクタータンパク質の免疫蛍光標識

要約

切除された昆虫の腸における植物ウイルスタンパク質とベクター昆虫タンパク質の両方の免疫蛍光標識のためのこのプロトコルは、ウイルスとベクター昆虫の間の相互作用、昆虫タンパク質の機能、およびウイルス感染の根底にある分子メカニズムを研究するために使用できます。

要約

自然界のほとんどの植物ウイルスは、半翅目の昆虫によってある植物から別の植物に伝染します。ウイルス感染に非常に効率的な媒介昆虫の高い個体群密度は、野外でのウイルス流行において重要な役割を果たします。ウイルスと昆虫のベクター相互作用を研究することで、ウイルスの伝播と流行の理解を深め、植物ウイルスとそのベクター昆虫を制御するための新しい戦略を設計することができます。免疫蛍光標識は、病原体と宿主との相互作用を分析するために広く使用されており、ここでは、ミナミイネクロインジグサドワーフウイルス(SRBSDV、フィジウイルス属、レオウイルス科)を効率的に伝達するシロウンカ(WBPH、Sogatella furcifera)で使用され、中腸上皮細胞内のビリオンと昆虫タンパク質を特定します。レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて、中腸上皮細胞の形態学的特徴、昆虫タンパク質の細胞局在、およびビリオンと昆虫タンパク質の共局在を調べました。このプロトコルは、昆虫のウイルス活動、昆虫タンパク質の機能、およびウイルスとベクター昆虫の相互作用を研究するために使用できます。

概要

記載されているほとんどの植物ウイルスは、アブラムシ、コナジラミ、ヨコバイ、ウンカ、アザミウマを含む半翅目からの昆虫によって伝染します^1,2。半翅目昆虫の穿刺吸引口部は、唾液を摂食および分泌するために植物組織を突き刺し、同時にウイルス²を効率的に伝達する。ベクター昆虫による植物ウイルスの異なる伝播メカニズムが説明されています。これらには、非永続的、半永続的、および永続的が含まれます。永続的なタイプは非繁殖型または繁殖型^{のいずれか}ですが、これらのタイプの両方^{について、感染した}ウイルスは昆虫の体内を移動する必要があります。持続繁殖モードでは、ウイルスは最初に昆虫の腸の上皮細胞に感染して複製し、次にさまざまな組織に拡散し、最終的には唾液腺に播種し、そこから昆虫の摂食中に唾液を介して植物に導入できます^5,6。持続性感染ウイルスは、異なる器官を通って移動し、昆虫媒介物内で複製するため、異なる段階でウイルスとベクター成分間の特異的相互作用が必要である^7,8。

ウイルスタンパク質および昆虫タンパク質は、ベクター昆虫におけるウイルス認識、感染、複製、または播種のための重要なプロセスを促進するために相互作用しなければならない^9,10。光学顕微鏡は昆虫の細胞構造を観察するために使用できますが、ウイルス粒子分布、ウイルスタンパク質と昆虫タンパク質の細胞局在または共局在、または昆虫組織と細胞の超微細構造を示すことはできません。免疫蛍光標識は、Coonsらによってマウスの食細胞において、特異的なフルオレセイン抗体を標識することによって最初に行われ、現在では広く使用されている¹¹。蛍光抗体法としても知られる免疫蛍光法は、開発された最も初期の免疫学的標識技術の1つであり、抗原と抗体との間の特異的結合反応に基づいている^11,12。既知の抗体は、まずフルオレセインで標識され、フルオレセインは、細胞または組織^13、14における対応する抗原を検出するためのプローブとして使用される。フルオレセイン標識抗体が細胞または組織内の対応する抗原に結合した後、励起波長を照射し、蛍光顕微鏡で観察して抗原¹⁵を局在化すると、プローブは明るい蛍光を発します。

植物ウイルスのほとんどの媒介昆虫は半翅目です。植物ウイルスの伝播効率が高い媒介昆虫の個体群密度が高いと、ウイルスの流行につながる可能性があります⁵。イネの最も深刻な病原体の1つであるミナミイネブラックストリークドワーフウイルス(SRBSDV、フィジウイルス属、レオウイルス科)は、東アジアと東南アジアの稲作地域に急速に広がり、2010年以降深刻な収量損失を引き起こしました^16,17。シロウンカ(WBPH、Sogatella furcifera Horváth)の成虫と幼虫は、SRBSDVを持続的繁殖性で高効率でイネに伝達します。現地調査によると、SRBSDV誘発性のイネ黒縞矮性病の発生は、通常、SRBSDVの流行の重要な要因であるWBPHの大量長距離移動と一致することが示されています^7,8,18。小胞関連膜タンパク質7(VAMP7)は、可溶性N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体(SNARE)であり、小胞融合を介した物質の輸送を媒介することができます。VAMP7はインビトロでSRBSDVの外側の主要キャプシドタンパク質と相互作用し、これはVAMP7がウイルス感染と密接に関連している可能性があることを示しています¹⁶。

ここに提示したプロトコールでは、中腸上皮細胞¹⁶においてSRBSDVビリオンおよびVAMP7を標識する例として、ウイルス性WBPHから腸を摘出した。ウイルスの最初の侵入部位として、中腸上皮はウイルスの感染、複製、および伝播において重要な役割を果たします。まず、WBPHのニンフと成体から腸を切除する手順を詳しく説明しました。次に、特異的フルオレセイン標識抗体を使用して、腸上皮細胞のSRBSDVビリオンとVAMP7を標識しました。次に、上皮細胞とビリオンとVAMP7の細胞位置をレーザー走査型共焦点顕微鏡で観察しました。その結果、SRBSDVビリオンとVAMP7が中腸上皮細胞の細胞質に共局在し、VAMP7の特異的な機能が中腸上皮細胞からのビリオンの播種に関連している可能性が示唆された。

プロトコル

1. 非ウイルス性昆虫の飼育

1. 水田からWBPHを収集し、防虫ネットで覆われた1Lガラスビーカーにイネ苗を入れて、28°C、明度16時間、暗8時間で培養器に入れます。SRBSDVは卵を介して伝染しないため、新しく孵化したニンフはウイルス性ではありません。
2. ブラシペンで、WBPHニンフが孵化するまで、毎週、昆虫を飼育しているビーカーから新鮮な米の苗の新しいビーカーに昆虫をそっと磨きます。これらの孵化した非ウイルス性のニンフを2齢または3齢に飼育し続けます。
   注意: ビーカーから飛んだり損傷したりしないように、慎重にブラシをかけてください。

2. ウイルスの獲得とウイルスの収集

1. ガラスビーカーから非ウイルス性昆虫を、植物を食べて2dウイルス獲得アクセス期間(AAP)の間、防虫ネットで覆われた新鮮なSRBSDVに感染したイネに移します。次に、新鮮な米の苗を入れたガラスビーカーに昆虫を集めます。
2. 2 dの後、腸の解剖と切除のために手動吸引器でガラスビーカーから昆虫を集めます。
   注:SRBSDVの最小AAPは、WBPHニンフと成虫の両方で5分ですが、最大80%の獲得効率を達成するために、昆虫は新鮮なSRBSDVに感染したイネを2 d食べさせる必要があります。

3. 試薬の調製

1. 8.5 gのNaCl、3.5 gのNa₂HPO 4・12H 2 O、および0.25 gのNaH₂PO₄を1 mLのddH₂Oに溶解し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の0.01 M溶液を調製します。
2. 4 gのパラホルムアルデヒドを100 mLのPBSに加え、4%(m/v)のパラホルムアルデヒドをPBSで調製します。
3. 2 mLのトリトンX-100を98 mLのPBSに加え、2%(v / v)のトリトンX-100を調製します。

4.成人の解剖と腸の切除

1. ピペッターを使用して、100 μLのPBSをスライドガラス上に置きます。スライドを光学顕微鏡のステージに置きます。
2. 手動吸引器でガラスビーカーからSRBSDVに感染した成人を収集し、1.5 mLチューブに入れます。チューブを氷の上に置き、昆虫を麻痺させ、麻痺した成虫を腹部を上にしてスライド上の100μLのPBSに移します。
   注:昆虫は氷上で5分後に完全に麻痺します。
3. 片方の手でピンセットを使用して体を固定し、もう一方の手で別のピンセットで頭を取り外します。
4. 腹部の側面を1組のピンセットで固定し、産卵管または尾の交尾器官をもう一方のセットで固定します。次に、1つの腹部セグメントのセグメント間膜を注意深く引き離し、腹部の腸をゆっくりと露出させます。
5. 膜を引き裂き続け、腹部から完全な腸を徐々に引き出します。腸の端に接続されている尾をそっと引き抜いて、腸全体を取り除きます。
   注意: 非常に注意深く引っ張ると、腸が損傷します。
6. 切除した腸を200 μLの遠沈管に入れ、200 μLのPBSをチューブに加え、ピペットで溶液を静かに吸引放出して腸を完全に洗浄します。

5.ニンフの解剖と腸の切除

注:ニンフの体は大人の体よりも壊れやすく、尾から引っ張ると腸が簡単に損傷します。したがって、ニンフ腸を切除する最も信頼できる方法は、頭から引っ張ることです。

1. ピペッターを使用して、100 μLのPBSをスライドガラス上に置きます。スライドを光学顕微鏡のステージに置きます。
2. 手動吸引器でガラスビーカーからSRBSDVに感染したニンフを収集し、1.5 mLチューブに入れます。昆虫を麻痺させるために氷の上にチューブを置きます。次に、麻痺したニンフを腹部を上に向けてスライド上の100μLのバッファーに移します。
3. ピンセットを使用してニンフの尾を外します。次に、昆虫の体をクランプして穏やかに固定し、もう一方のセットを使用して頭をクランプします。頭が体から離れるように、腸への付着を維持したまま頭を体からそっと引き離しますが、腸はまだ胸部と腹部に付着しています。
   注:頭部が剥離した後、ニンフの脂肪体が流出し、PBSが濁ります。濁ったPBS溶液を取り除き、100 μLの新鮮なPBSで交換します。
4. ピンセットがまだ体を固定している状態で、もう一方のセットを使用して頭を慎重に動かし、徐々に腸を引き抜きます。
5. ピンセットで腸を頭からそっと外し、最終的にはウンカの体に損傷を与えることなく無傷の腸を取得します。
6. 切除した腸を200 μLの遠沈管に入れ、200 μLのPBSをチューブに加え、ピペットで溶液を静かに吸引放出して腸を完全に洗浄します。
   注:切除された腸は、腹腔から汚染された脂肪体を取り除くためにPBSでよく洗浄する必要があります。それらは染色プロトコルを妨害する可能性があります。

6. SRBSDVビリオンおよび昆虫タンパク質の標識プロトコル

1. 本アッセイに用いる抗体及び封入剤を調製する。抗体は、SRBSDVビリオン18に対するダイライト549(赤)で標識された抗SRBSDV抗体、昆虫タンパク質VAMP7^16,19に対するダイライト⁴⁸⁸(緑)で標識された抗VAMP7抗体、ダイライト633ファロイジン(青)、および^4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、青)を含む封入培地です。
2. 新たに切除してPBS洗浄したWBPHガッツを、200 μLの遠沈管内の100 μLの4%(m/v)パラホルムアルデヒドに直ちに入れ、室温で2時間保持します。
   注:切除したばかりのWBPH腸は、PBSに長時間浸さないと、上皮細胞が損傷します。
3. ピペッターで4%(m/v)パラホルムアルデヒドを除去し、200 μLのPBSを200 μLの遠沈管に加えます。10分後、ピペッターを使用してPBSを除去し、パラホルムアルデヒドを除去します。
4. このPBS洗浄ステップを2回繰り返します。
5. PBSを取り出し、200μLの非イオン界面活性剤Triton X-100(2%、v / v)を加えます。非イオン性界面活性剤中のサンプルを室温で30分間透過処理します。
6. ピペッターで2%(v / v)Triton X-100を取り出し、200 μLのPBSで10分間3回洗浄して、残っている洗剤をすべて洗い流します(手順6.3および6.4を参照)。
7. Dylight 549(赤)で標識した抗SRBSDV抗体およびDylight 488(緑)で標識した抗VAMP7抗体を50 μLの雄牛血清アルブミン(3%、m/v)で1:50に希釈します。
8. 希釈した抗体をチューブに加え、サンプルを4°Cで一晩インキュベートします。
9. 抗体希釈液をピペッターで取り出し、残りの抗体希釈液を200 μLのPBSで10分間3回洗浄して洗い流します。
10. 1 μLのダイライト633ファロイジンを50 μLのPBSで希釈します。
11. 50 μLの希釈ファロイジンをチューブに加え、サンプルを室温で2時間インキュベートします。
12. ピペッターでファロイジン希釈液を取り出し、残りのファロイジンを200 μLのPBSで10分間3回洗浄して洗い流します。
    注:バックグラウンドと非特異的結合を減らすには、徹底的な洗浄が重要です。
13. DAPIを含む封入剤を顕微鏡スライドに一滴置き、内臓を培地に移します。
    注意: ピンセットで各腸をそっと広げ、泡を作らないようにします。スライドごとに約15の内臓があります。
14. 気泡を発生させずにサンプルの上にカバーガラスをそっと置きます。
    注:スライドは、レーザー走査型共焦点顕微鏡で観察する前に、蛍光消光を抑制するために暗所で4°Cに保持する必要があります。
15. レーザー走査型共焦点顕微鏡ですべてのサンプルを表示します。青色光を使用して画像をキャプチャし、ファイルをコンピューターに保存します。

結果

図1は、このプロトコルのすべてのステップを示しています:昆虫の飼育、ウイルスの獲得、腸の切除、免疫蛍光標識、およびスライドの作成。

成人から摘出したWBPH腸を4%(m / v)パラホルムアルデヒドで固定し、2%(v / v)Triton X-100で透過処理した後、Dylight 633ファロイジン^10,18でインキュベートしました。

ディスカッション

最良の結果を得るには、いくつかの重要な点を考慮する必要があります。第一に、総人口に占めるウイルス性昆虫の割合が高いことが必要です。WBPHニンフと成虫によるSRBSDVの最小AAPは5分¹⁷ですが、最大80%の獲得効率を達成するために、昆虫は新鮮なSRBSDVに感染したイネを2 d食べさせる必要があります。SRBSDVビリオンは中腸の80%で検出できるため¹⁸、このプ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3% Bull serum albumin (BSA)	Coolaber	SL1331	Dilute antibodies
Cover glass	Solarbio	YA0771-18*18mm	For slide making
Dissecting microscope	Beitja	XTL-7045B1	For insect dissection
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	Zeiss LSM880	Observe fluorescence signal
Microscope slides	Solarbio	ZBP-7105	For slide making
Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Abcam	AB104139	Label cell necleus
Paraformaldehyde	Sigma	158127	For tissues fixation
Phalloidin	Invitrogen	A22284	Label actin of midgut epithiels
Triton X-100	Amresco	0290C484	For tissues permeation
Tweezers (5-SA)	AsOne	6-7905-40	For insect dissection