Marcação por imunofluorescência de vírus de plantas e proteínas de insetos vetores em intestinos de Hemiptera

Resumo

Este protocolo para marcação imunofluorescente de proteínas de vírus de plantas e proteínas de insetos vetores em intestinos de insetos excisados pode ser usado para estudar interações entre vírus e insetos vetores, funções de proteínas de insetos e mecanismos moleculares subjacentes à transmissão de vírus.

Resumo

A maioria dos vírus de plantas na natureza é transmitida de uma planta para outra por insetos hemípteros. Uma alta densidade populacional de insetos vetores, que são altamente eficientes na transmissão do vírus, desempenha um papel fundamental nas epidemias de vírus nos campos. O estudo das interações vírus-insetos vetoriais pode avançar na compreensão da transmissão de vírus e epidemias com o objetivo de desenhar novas estratégias para controlar vírus de plantas e seus insetos vetores. A marcação por imunofluorescência tem sido amplamente utilizada para analisar interações entre patógenos e hospedeiros e é usada aqui na cigarrinha-de-dorso-branco (WBPH, Sogatella furcifera), que transmite eficientemente o vírus anão estriado do arroz do sul (SRBSDV, gênero Fijivirus, família Reoviridae), para localizar os virions e proteínas de insetos nas células epiteliais do intestino médio. Usando microscopia confocal de varredura a laser, estudamos as características morfológicas de células epiteliais do intestino médio, a localização celular de proteínas de insetos e a colocalização de virions e uma proteína de inseto. Este protocolo pode ser usado para estudar atividades virais em insetos, funções de proteínas de insetos e interações entre vírus e inseto vetor.

Introdução

A maioria dos vírus de plantas descritos é transmitida por insetos da ordem Hemiptera que inclui pulgões, moscas-brancas, cigarrinhas, cigarrinhas e tripes ^1,2. As partes bucais sugadoras de insetos hemípteros perfuram o tecido vegetal para alimentação e secreção de saliva, concomitantemente transmitindo eficientemente o vírus². Diferentes mecanismos de transmissão de vírus de plantas por insetos vetores têm sido descritos. Estes incluem não persistente, semipersistente e persistente. O tipo persistente é não propagativo ou propagativo^3,4, mas para ambos os tipos^, o vírus transmitido deve se mover por todo o corpo do inseto. No modo persistente-propagativo, os vírus inicialmente infectam e se replicam nas células epiteliais do intestino do inseto, depois se disseminam em diferentes tecidos e, finalmente, nas glândulas salivares, de onde podem ser introduzidos em uma planta através da saliva durante a alimentação do inseto ^5,6. Os vírus transmitidos persistentemente movem-se através de diferentes órgãos e se replicam em seus insetos vetores, o que requer interações específicas entre o vírus e os componentes do vetor em diferentes estágios ^7,8.

Proteínas virais e proteínas de insetos devem interagir para facilitar processos críticos de reconhecimento, infecção, replicação ou disseminação do vírus nos insetos vetores ^9,10. Embora a microscopia óptica possa ser usada para observar estruturas celulares em insetos, ela não pode mostrar a distribuição do virion, a localização celular ou colocalização de proteínas virais e proteínas de insetos, ou a ultraestrutura de tecidos e células de insetos. A marcação por imunofluorescência foi realizada inicialmente por Coons e col. em células fagocíticas de camundongos por meio da marcação de anticorpos específicos contra a fluoresceína, e atualmente é amplamente utilizada¹¹. A técnica de imunofluorescência, também conhecida como técnica de fluorescência de anticorpos, é uma das primeiras técnicas de marcação imunológica desenvolvidas e baseia-se na reação de ligação específica entre o antígeno e o anticorpo^11,12. O anticorpo conhecido é primeiramente marcado com fluoresceína, que é usada como sonda para detectar os antígenos correspondentes nas células ou tecidos^13,14. Após o anticorpo marcado com fluoresceína se ligar ao antígeno correspondente em células ou tecidos, a sonda emitirá fluorescência brilhante quando irradiada com comprimentos de onda de excitação e visualizada com um microscópio de fluorescência para localizar o antígeno¹⁵.

A maioria dos insetos vetores de vírus de plantas são hemípteros. Uma maior densidade populacional de insetos vetores que apresentam alta eficiência de transmissão do vírus vegetal pode levar a epidemias virais⁵. O Southern rice black srakeed dwarf virus (SRBSDV, gênero Fijivirus, família Reoviridae), um dos patógenos mais graves do arroz, tem se espalhado rapidamente por áreas de cultivo de arroz no leste e sudeste da Ásia e causado sérias perdas de rendimento desde 2010^16,17. Adultos e ninfas da cigarrinha-de-dorso-branco (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) transmitem SRBSDV ao arroz de forma persistente-propagativa com alta eficiência. Estudos de campo têm mostrado que surtos da doença anã estriada do arroz induzida pelo SRBSDV geralmente coincidem com a migração em massa de HPBHs, um fator crucial em epidemias de SRBSDV ^7,8,18. A proteína de membrana associada à vesícula 7 (VAMP7) é um receptor solúvel da proteína de ligação ao fator sensível à N-etilmaleimida (SNARE), que pode mediar o transporte de substâncias via fusão vesicular. O VAMP7 interage com a proteína do capsídeo principal externo do SRBSDV in vitro, o que indica que o VAMP7 pode estar intimamente associado à transmissão do vírus¹⁶.

No protocolo aqui apresentado, extirpamos o intestino de WBPH virulífera como exemplo para marcar virions SRBSDV e VAMP7 em células epiteliais do intestino^médio16. Como local inicial de invasão do vírus, o epitélio do intestino médio desempenha papéis vitais na infecção, replicação e transmissão do vírus. Primeiramente, detalhamos os passos para excisar o intestino de ninfas e adultos de WBPHs. Em segundo lugar, usamos anticorpos específicos marcados com fluoresceína para marcar os virions SRBSDV e VAMP7 em células epiteliais intestinais. Em seguida, observamos as células epiteliais e a localização celular dos virions e VAMP7 através de um microscópio confocal de varredura a laser. Os resultados mostraram que os virions SRBSDV e VAMP7 podem colocalizar no citoplasma das células epiteliais do intestino médio, sugerindo que a função específica do VAMP7 pode estar relacionada à disseminação de vírions a partir de células epiteliais do intestino médio.

Protocolo

1. Criação de insetos não virulíferos

1. Coletar WBPHs de campos de arroz e traseira com mudas de arroz em copos de vidro de 1 L cobertos com rede à prova de insetos em uma incubadora a 28 °C com 16 h de luz e 8 h de escuridão. Como o SRBSDV não é transmitido através de ovos, as ninfas recém-eclodidas não são virulíferas.
2. Com uma caneta de escova, escove suavemente os insetos do copo que cria insetos em um novo copo de mudas de arroz fresco a cada semana até que as ninfas WBPH tenham eclodido. Continue criando essas ninfas não virulíferas eclodidas até 2 ou 3 ínstares.
   NOTA: Escove com cuidado para evitar que os WBPHs voem do copo ou os danifiquem.

2. Aquisição e coleta de vírus de insetos virulíferos

1. Transfira insetos não virulíferos dos copos de vidro para plantas de arroz frescas infectadas com SRBSDV cobertas com uma rede à prova de insetos por um período de acesso de aquisição de vírus (AAP) de 2 d alimentando-se de plantas. Em seguida, colete os insetos em copos de vidro contendo mudas frescas de arroz.
2. Após 2 dias, coletar os insetos de copos de vidro com um aspirador manual para dissecção e excisão do intestino.
   NOTA:O AAP mínimo de SRBSDV é de 5 min para ninfas WBPH e adultos, mas os insetos devem ser autorizados a se alimentar de plantas de arroz frescas infectadas com SRBSDV por 2 d para atingir a eficiência de aquisição de até 80%.

3. Preparação dos reagentes

1. Dissolver 8,5 g de NaCl, 3,5 g de Na 2 HPO 4·12H 2 O e 0,25 g de NaH 2 PO₄ em 1 mLde ddH₂O para preparar solução 0,01 M de soluçãosalina tamponada com fosfato (PBS).
2. Adicionar 4 g de paraformaldeído a 100 mL de PBS para preparar paraformaldeído a 4% (m/v) em PBS.
3. Adicionar 2 mL de Triton X-100 em 98 mL de PBS para preparar 2% (v/v) de Triton X-100.

4. Dissecção de adultos e excisão de vísceras

1. Use um pipettor para colocar 100 μL de PBS em uma lâmina de vidro. Coloque a lâmina no palco de um microscópio óptico.
2. Coletar os adultos infectados pelo SRBSDV de copos de vidro com um aspirador manual e colocá-los em tubos de 1,5 mL. Coloque os tubos no gelo para paralisar os insetos e, em seguida, transfira um adulto paralisado para os 100 μL de PBS na lâmina com o abdômen para cima.
   NOTA: Os insetos serão completamente paralisados após 5 minutos no gelo.
3. Use uma pinça em uma mão para prender o corpo e, em seguida, remova a cabeça com outro conjunto de pinças na outra mão.
4. Aperte os lados do abdome com uma pinça e prenda o ovipositor ou o órgão copulatório da cauda com o outro conjunto. Em seguida, afaste a membrana intersegmentar de um segmento abdominal cuidadosamente e exponha lentamente o intestino no abdômen.
5. Continue rasgando a membrana e gradualmente retire o intestino completo do abdômen. Puxe suavemente a cauda, que está conectada ao final do intestino, para remover o intestino completo.
   NOTA: Puxe com muito cuidado ou o intestino será danificado.
6. Coloque as vísceras excisadas num tubo de centrifugação de 200 μL, adicione 200 μL de PBS ao tubo e solte suavemente a solução com uma pipeta para lavar bem as vísceras.

5. Dissecção de ninfas e excisão de vísceras

NOTA: Os corpos das ninfas são mais frágeis do que os corpos adultos, e o intestino é facilmente danificado quando puxado da cauda. Portanto, o método mais confiável para excisar o intestino da ninfa é puxando da cabeça.

1. Use um pipettor para colocar 100 μL de PBS em uma lâmina de vidro. Coloque a lâmina no palco de um microscópio óptico.
2. Coletar as ninfas infectadas pelo SRBSDV de copos de vidro com um aspirador manual e colocá-las em tubos de 1,5 mL. Coloque os tubos no gelo para paralisar os insetos. Em seguida, transfira uma ninfa paralisada para os 100 μL de tampão na lâmina com o abdome voltado para cima.
3. Use uma pinça para desprender a cauda da ninfa. Em seguida, prenda o corpo do inseto para fixar suavemente e use o outro conjunto para prender a cabeça. Puxe suavemente a cabeça para longe do corpo, mantendo sua fixação ao intestino para que a cabeça esteja desprendida do corpo, mas o intestino ainda está preso ao tórax e ao abdômen.
   OBS: Após o desprendimento da cabeça, o corpo adiposo da ninfa irá fluir, tornando a PBS turva. Retire a solução turva de PBS e troque com 100 μL de PBS fresco.
4. Com a pinça ainda apertando o corpo, use o outro conjunto para mover a cabeça com cuidado e, gradualmente, puxe o intestino.
5. Desapegue suavemente o intestino da cabeça com uma pinça e, eventualmente, obtenha um intestino intacto sem danificar o corpo da cigarrinha.
6. Coloque as vísceras excisadas num tubo de centrifugação de 200 μL, adicione 200 μL de PBS ao tubo e solte suavemente a solução com uma pipeta para lavar bem as vísceras.
   NOTA: As vísceras excisadas devem ser bem limpas com PBS para remover quaisquer corpos gordurosos contaminantes da cavidade abdominal; podem interferir no protocolo de coloração.

6. Protocolos de marcação para virions SRBSDV e uma proteína de inseto

1. Preparar os anticorpos e o meio de montagem utilizados neste ensaio. Os anticorpos são anticorpo anti-SRBSDV marcado com Dylight 549 (vermelho) contra virions SRBSDV 18, anticorpo anti-VAMP7 marcado com Dylight 488 (verde) contra a proteína de inseto VAMP7^16,19, faloidina Dylight 633 (azul) e meio de montagem contendo 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI^, azul).
2. Colocar imediatamente as vísceras WBPH recém-excisadas e lavadas com PBS em 100 μL de paraformaldeído a 4% (m/v) num tubo de centrifugação de 200 μL e segurar durante 2 h à temperatura ambiente.
   NOTA: Os intestinos recém-excisados do WBPH não devem ser embebidos em PBS por um período mais longo, ou as células epiteliais serão danificadas.
3. Remover paraformaldeído a 4% (m/v) com um pipetador e, em seguida, adicionar 200 μL de PBS no tubo de centrifugação de 200 μL. Após 10 min, remova o PBS usando um pipetador para eliminar qualquer paraformaldeído.
4. Repita esta etapa de lavagem PBS duas vezes.
5. Retire o PBS e adicione 200 μL de detergente não iônico Triton X-100 (2%, v/v). Permeabilizar as amostras em detergente não iónico durante 30 min à temperatura ambiente.
6. Remover 2% (v/v) Triton X-100 com um pipetador e, em seguida, lavar qualquer detergente restante com três lavagens de 10 minutos com 200 μL de PBS (ver passos 6.3 e 6.4).
7. Anticorpo anti-SRBSDV diluído marcado por Dylight 549 (vermelho) e anticorpo anti-VAMP7 marcado por Dylight 488 (verde) 1:50 com 50 μL de albumina sérica de touro (3%, m/v).
8. Adicionar os anticorpos diluídos ao tubo e incubar as amostras durante a noite a 4 °C.
9. Remova o diluente de anticorpos com um pipetador e, em seguida, lave o diluente de anticorpos restante com três lavagens de 10 minutos com 200 μL de PBS.
10. Diluir 1 μL de faloidina Dylight 633 com 50 μL de PBS.
11. Adicionar 50 μL de faloidina diluída ao tubo e incubar as amostras durante 2 h à temperatura ambiente.
12. Remova o diluente de faloidina com um pipetador e, em seguida, lave a faloidina restante com três lavagens de 10 minutos com 200 μL de PBS.
    NOTA: Lavagens completas são fundamentais para reduzir o fundo e a vinculação inespecífica.
13. Coloque uma gota de meio de montagem contendo DAPI em uma lâmina de microscópio e transfira as vísceras para o meio.
    NOTA: Desdobre suavemente cada intestino com uma pinça e evite criar bolhas. São cerca de 15 tripas por slide.
14. Coloque suavemente um vidro de cobertura sobre as amostras sem criar bolhas.
    NOTA: A lâmina deve ser mantida a 4 °C no escuro para inibir a supressão da fluorescência antes da observação com um microscópio confocal de varredura a laser.
15. Veja todas as amostras com um microscópio confocal de varredura a laser. Capture as imagens usando luz azul e salve os arquivos em um computador.

Resultados

A Figura 1 ilustra todas as etapas desse protocolo: criação de insetos, aquisição do vírus, excisão do intestino, marcação por imunofluorescência e confecção da lâmina.

Intestinos WBPH excisados de adultos foram fixados em paraformaldeído a 4% (m/v), permeabilizados com Triton X-100 a 2% (v/v) e, em seguida, incubados com faloidina Dylight 633^10,18. A micrografia confocal de varredura a laser ...

Discussão

Para melhores resultados, alguns pontos-chave devem ser considerados. Primeiro, uma alta proporção de insetos virulíferos entre a população total é necessária. Embora o AAP mínimo para SRBSDV por ninfas e adultos WBPH seja de 5 min¹⁷, os insetos devem ser autorizados a se alimentar de plantas de arroz frescas infectadas com SRBSDV por 2 d para alcançar uma eficiência de aquisição de até 80%. Como os virions SRBSDV podem ser detectados em 80% dos intestinos médios^18<...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3% Bull serum albumin (BSA)	Coolaber	SL1331	Dilute antibodies
Cover glass	Solarbio	YA0771-18*18mm	For slide making
Dissecting microscope	Beitja	XTL-7045B1	For insect dissection
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	Zeiss LSM880	Observe fluorescence signal
Microscope slides	Solarbio	ZBP-7105	For slide making
Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Abcam	AB104139	Label cell necleus
Paraformaldehyde	Sigma	158127	For tissues fixation
Phalloidin	Invitrogen	A22284	Label actin of midgut epithiels
Triton X-100	Amresco	0290C484	For tissues permeation
Tweezers (5-SA)	AsOne	6-7905-40	For insect dissection