Marcatura immunofluorescente di virus vegetali e proteine di insetti vettori nell'intestino degli emitteri

Riepilogo

Questo protocollo per la marcatura immunofluorescente sia delle proteine del virus vegetale che delle proteine degli insetti vettori nelle viscere degli insetti asportati può essere utilizzato per studiare le interazioni tra virus e insetti vettori, le funzioni delle proteine degli insetti e i meccanismi molecolari alla base della trasmissione del virus.

Abstract

La maggior parte dei virus vegetali in natura sono trasmessi da una pianta all'altra dagli insetti emitteri. Un'alta densità di popolazione di insetti vettori che sono altamente efficienti nella trasmissione del virus gioca un ruolo chiave nelle epidemie di virus nei campi. Lo studio delle interazioni virus-insetto vettore può far progredire la nostra comprensione della trasmissione del virus e delle epidemie con l'obiettivo di progettare nuove strategie per controllare i virus delle piante e i loro insetti vettori. La marcatura con immunofluorescenza è stata ampiamente utilizzata per analizzare le interazioni tra patogeni e ospiti ed è utilizzata qui nella cicalina dal dorso bianco (WBPH, Sogatella furcifera), che trasmette in modo efficiente il virus nano striato nero del riso meridionale (SRBSDV, genere Fijivirus, famiglia Reoviridae), per localizzare i virioni e le proteine degli insetti nelle cellule epiteliali dell'intestino medio. Utilizzando la microscopia confocale a scansione laser, abbiamo studiato le caratteristiche morfologiche delle cellule epiteliali dell'intestino medio, la localizzazione cellulare delle proteine degli insetti e la colocalizzazione dei virioni e di una proteina dell'insetto. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare le attività dei virus negli insetti, le funzioni delle proteine degli insetti e le interazioni tra virus e insetto vettore.

Introduzione

I virus vegetali più descritti sono trasmessi dagli insetti dall'ordine Hemiptera che include afidi, mosche bianche, cicaline, cicaline e tripidi ^1,2. L'apparato boccale penetrante-succhiatore degli insetti emitteri perfora il tessuto vegetale per nutrire e secernere la saliva, trasmettendo contemporaneamente in modo efficiente il virus². Sono stati descritti diversi meccanismi di trasmissione dei virus vegetali da parte di insetti vettori. Questi includono non persistente, semipersistente e persistente. Il tipo persistente è non propagante o propagante^3,4, ma per entrambi questi tipi^, il virus trasmesso deve muoversi in tutto il corpo dell'insetto. Nella modalità persistente-propagativa, i virus inizialmente infettano e si replicano nelle cellule epiteliali dell'intestino dell'insetto, quindi si diffondono in diversi tessuti e infine nelle ghiandole salivari, da dove possono quindi essere introdotti in una pianta attraverso la saliva durante l'alimentazione degli insetti ^5,6. I virus trasmessi persistenti si muovono attraverso diversi organi e si replicano nei loro insetti vettori, il che richiede interazioni specifiche tra virus e componenti vettoriali in diversi stadi ^7,8.

Le proteine virali e le proteine degli insetti devono interagire per facilitare i processi critici per il riconoscimento, l'infezione, la replicazione o la diffusione del virus negli insetti vettori ^9,10. Sebbene la microscopia ottica possa essere utilizzata per osservare le strutture cellulari negli insetti, non può mostrare la distribuzione dei virioni, la localizzazione cellulare o la colocalizzazione delle proteine virali e delle proteine degli insetti o l'ultrastruttura dei tessuti e delle cellule degli insetti. La marcatura con immunofluorescenza è stata eseguita per la prima volta da Coons et al. nelle cellule fagocitiche del topo mediante marcatura di anticorpi specifici contro la fluoresceina, e ora è ampiamente utilizzata¹¹. La tecnica di immunofluorescenza, nota anche come tecnica degli anticorpi di fluorescenza, è una delle prime tecniche di marcatura immunologica sviluppate e si basa sulla specifica reazione di legame tra l'antigene e l'anticorpo^11,12. L'anticorpo noto viene prima marcato con fluoresceina, che viene utilizzata come sonda per rilevare gli antigeni corrispondenti nelle cellule o nei tessuti^13,14. Dopo che l'anticorpo marcato con fluoresceina si lega all'antigene corrispondente nelle cellule o nei tessuti, la sonda emetterà fluorescenza brillante quando irradiata con lunghezze d'onda di eccitazione e osservata con un microscopio a fluorescenza per localizzare l'antigene¹⁵.

La maggior parte degli insetti vettori dei virus vegetali sono emitteri. Una maggiore densità di popolazione di insetti vettori che hanno un'elevata efficienza di trasmissione del virus vegetale può portare a epidemie di virus⁵. Il virus nano striato nero del riso meridionale (SRBSDV, genere Fijivirus, famiglia Reoviridae), uno dei patogeni più gravi del riso, si è rapidamente diffuso in tutte le aree di coltivazione del riso nell'Asia orientale e sudorientale e ha causato gravi perdite di resa dal 2010^16,17. Gli adulti e le ninfe della cavalletta dorsobianco (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) trasmettono SRBSDV al riso in modo persistente-propagativo con alta efficienza. Studi sul campo hanno dimostrato che i focolai di malattia nana striata nera indotta da SRBSDV di solito coincidono con la migrazione di massa a lunga distanza di WBPHs, un fattore cruciale nelle epidemie di SRBSDV 7,8,18. La proteina di membrana 7 associata alla vescicola (VAMP7) è un recettore solubile della proteina di attaccamento del fattore N-etilmaleimmide sensibile (SNARE), che può mediare il trasporto di sostanze attraverso la fusione delle vescicole. VAMP7 interagisce con la proteina capside maggiore esterna di SRBSDV in vitro, il che indica che VAMP7 potrebbe essere strettamente associato alla trasmissione del virus¹⁶.

Nel protocollo qui presentato, abbiamo asportato l'intestino da WBPH virulifero come esempio per etichettare i virioni SRBSDV e VAMP7 nelle cellule epiteliali dell'intestino medio¹⁶. Come sito di invasione iniziale del virus, l'epitelio dell'intestino medio svolge ruoli vitali nell'infezione, nella replicazione e nella trasmissione del virus. In primo luogo, abbiamo dettagliato i passaggi per asportare l'intestino da ninfe e adulti di WBPHs. In secondo luogo, abbiamo utilizzato anticorpi specifici marcati con fluoresceina per marcare i virioni SRBSDV e VAMP7 nelle cellule epiteliali intestinali. Poi abbiamo osservato le cellule epiteliali e la posizione cellulare dei virioni e VAMP7 tramite un microscopio confocale a scansione laser. I risultati hanno mostrato che i virioni SRBSDV e VAMP7 potrebbero colocalizzarsi nel citoplasma delle cellule epiteliali dell'intestino medio, suggerendo che la funzione specifica di VAMP7 potrebbe essere correlata alla disseminazione di virioni dalle cellule epiteliali dell'intestino medio.

Protocollo

1. Allevamento di insetti non viruliferi

1. Raccogliere WBPHs dalle risaie e retrocedere con piantine di riso in bicchieri di vetro da 1 L coperti con rete a prova di insetti in un'incubatrice a 28 °C con 16 ore di luce e 8 ore di buio. Poiché SRBSDV non viene trasmesso attraverso le uova, le ninfe appena nate non sono virulifere.
2. Con una penna, spazzola delicatamente gli insetti dal becher che alleva insetti in un nuovo becher di piantine di riso fresco ogni settimana fino a quando le ninfe WBPH non si sono schiuse. Continua ad allevare queste ninfe non virulifere tratteggiate a 2 o 3 pollici.
   NOTA: Spazzolare con attenzione per evitare che i WBPH volino dal becher o li danneggino.

2. Acquisizione del virus e raccolta di insetti viruliferi

1. Trasferire insetti non viruliferi dai bicchieri di vetro alle piante di riso fresche infette da SRBSDV coperte da una rete a prova di insetto per un periodo di accesso all'acquisizione del virus (AAP) di 2 d nutrendosi di piante. Quindi, raccogliere gli insetti in bicchieri di vetro contenenti piantine di riso fresco.
2. Dopo 2 d, raccogliere gli insetti dai bicchieri di vetro con un aspiratore manuale per la dissezione e l'escissione dell'intestino.
   NOTA: L'AAP minimo di SRBSDV è di 5 minuti sia per le ninfe WBPH che per gli adulti, ma gli insetti dovrebbero essere autorizzati a nutrirsi di piante di riso fresche infette da SRBSDV per 2 d per ottenere un'efficienza di acquisizione fino all'80%.

3. Preparazione del reagente

1. Sciogliere 8,5 g di NaCl, 3,5 g di Na 2 HPO 4·12H 2 O e 0,25 g di NaH 2 PO₄ in 1 mL di ddH₂O per preparare una soluzione salina tamponata con fosfato(PBS).
2. Aggiungere 4 g di paraformaldeide a 100 ml di PBS per preparare il 4% (m/v) di paraformaldeide in PBS.
3. Aggiungere 2 mL di Triton X-100 in 98 mL di PBS per preparare il 2% (v/v) di Triton X-100.

4. Dissezione degli adulti e asportazione delle viscere

1. Utilizzare un pipettor per posizionare 100 μL di PBS su un vetrino. Posizionare il vetrino sul palco di un microscopio ottico.
2. Raccogliere gli adulti infetti da SRBSDV dai bicchieri di vetro con un aspiratore manuale e metterli in tubi da 1,5 ml. Posizionare i tubi sul ghiaccio per paralizzare gli insetti, quindi trasferire un adulto paralizzato nei 100 μL di PBS sul vetrino con l'addome verso l'alto.
   NOTA: Gli insetti saranno completamente paralizzati dopo 5 minuti sul ghiaccio.
3. Utilizzare una pinzetta in una mano per bloccare il corpo, quindi rimuovere la testa con un'altra serie di pinzette nell'altra mano.
4. Bloccare i lati dell'addome con una serie di pinzette e bloccare l'ovopositore o l'organo copulatore della coda con l'altro set. Quindi allontanare attentamente la membrana intersegmentale di un segmento addominale ed esporre lentamente l'intestino nell'addome.
5. Continuare a strappare via la membrana e gradualmente estrarre l'intestino completo dall'addome. Tirare delicatamente la coda, che è collegata alla fine dell'intestino, per rimuovere l'intestino completo.
   NOTA: Tirare con molta attenzione o l'intestino sarà danneggiato.
6. Posizionare le budella asportate in una provetta da centrifuga da 200 μL, aggiungere 200 μL di PBS al tubo e aspirare delicatamente la soluzione con una pipetta per lavare accuratamente le budella.

5. Dissezione delle ninfe e escissione delle budella

NOTA: I corpi delle ninfe sono più fragili dei corpi adulti e l'intestino è facilmente danneggiato quando viene estratto dalla coda. Pertanto, il metodo più affidabile per asportare l'intestino della ninfa è tirando dalla testa.

1. Utilizzare un pipettor per posizionare 100 μL di PBS su un vetrino. Posizionare il vetrino sul palco di un microscopio ottico.
2. Raccogliere le ninfe infette da SRBSDV dai becher di vetro con un aspiratore manuale e posizionarle in tubi da 1,5 ml. Posizionare i tubi sul ghiaccio per paralizzare gli insetti. Quindi, trasferire una ninfa paralizzata nei 100 μL di tampone sul vetrino con l'addome rivolto verso l'alto.
3. Usa una pinzetta per staccare la coda della ninfa. Quindi bloccare il corpo dell'insetto per fissare delicatamente e utilizzare l'altro set per bloccare la testa. Tirare delicatamente la testa lontano dal corpo pur mantenendo il suo attaccamento all'intestino in modo che la testa sia staccata dal corpo, ma l'intestino è ancora attaccato al torace e all'addome.
   NOTA: Dopo che la testa è stata staccata, il corpo adiposo della ninfa defluirà, rendendo il PBS torbido. Rimuovere la soluzione torbida di PBS e sostituirla con 100 μL di PBS fresco.
4. Con le pinzette che ancora bloccano il corpo, usa l'altro set per muovere la testa con attenzione e gradualmente estrai l'intestino.
5. Staccare delicatamente l'intestino dalla testa con una pinzetta e alla fine ottenere un intestino intatto senza danneggiare il corpo della cavalletta.
6. Posizionare le budella asportate in una provetta da centrifuga da 200 μL, aggiungere 200 μL di PBS al tubo e aspirare delicatamente la soluzione con una pipetta per lavare accuratamente le budella.
   NOTA: Le budella asportate devono essere pulite bene con PBS per rimuovere eventuali corpi grassi contaminanti dalla cavità addominale; Possono interferire con il protocollo di colorazione.

6. Protocolli di etichettatura per virioni SRBSDV e una proteina di insetto

1. Preparare gli anticorpi e il mezzo di montaggio utilizzati in questo test. Gli anticorpi sono anticorpi anti-SRBSDV marcati con Dylight 549 (rosso) contro i virioni SRBSDV 18, anticorpi anti-VAMP7 marcati con Dylight 488 (verde) contro la proteina dell'insetto VAMP7^16,19, Dylight 633 falloidina (blu) e terreno di montaggio contenente 4,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI^, blu).
2. Posizionare immediatamente le budella WBPH appena asportate e lavate con PBS in 100 μL di paraformaldeide al 4% (m/v) in una provetta da centrifuga da 200 μL e tenere premuto per 2 ore a temperatura ambiente.
   NOTA: Le budella WBPH appena asportate non devono essere immerse in PBS per una durata più lunga, o le cellule epiteliali saranno danneggiate.
3. Rimuovere il 4% (m/v) di paraformaldeide con un pipettatore, quindi aggiungere 200 μL di PBS nella provetta da centrifuga da 200 μL. Dopo 10 minuti, rimuovere PBS utilizzando un pipettor per eliminare qualsiasi paraformaldeide.
4. Ripetere questo passaggio di lavaggio PBS due volte.
5. Rimuovere il PBS e aggiungere 200 μL di detergente non ionico Triton X-100 (2%, v/v). Permeabilizzare i campioni nel detergente non ionico per 30 minuti a temperatura ambiente.
6. Rimuovere Triton X-100 al 2% (v/v) con un pipettatore, quindi lavare via il detergente rimanente con tre lavaggi di 10 minuti con 200 μL di PBS (vedere punti 6.3 e 6.4).
7. Anticorpo diluito anti-SRBSDV marcato con Dylight 549 (rosso) e anticorpo anti-VAMP7 marcato con Dylight 488 (verde) 1:50 con 50 μL di albumina sierica del toro (3%, m/v).
8. Aggiungere gli anticorpi diluiti alla provetta e incubare i campioni per una notte a 4 °C.
9. Rimuovere il diluente anticorpale con un pipettor e quindi lavare via il diluente anticorpale rimanente con tre lavaggi di 10 minuti con 200 μL di PBS.
10. Diluire 1 μL di falloidina Dylight 633 con 50 μL di PBS.
11. Aggiungere 50 μL di falloidina diluita alla provetta e incubare i campioni per 2 ore a temperatura ambiente.
12. Rimuovere il diluente della falloidina con un pipettatore, quindi lavare via la falloidina rimanente con tre lavaggi di 10 minuti con 200 μL di PBS.
    NOTA: lavaggi accurati sono fondamentali per ridurre lo sfondo e la rilegatura non specifica.
13. Posizionare una goccia di supporto di montaggio contenente DAPI su un vetrino da microscopio e trasferire le budella sul supporto.
    NOTA: aprire delicatamente ogni budello con una pinzetta ed evitare di creare bolle. Ci sono circa 15 budella per diapositiva.
14. Posizionare delicatamente un vetro di copertura sopra i campioni senza creare bolle.
    NOTA: Il vetrino deve essere tenuto a 4 °C al buio per inibire la tempra della fluorescenza prima dell'osservazione con un microscopio confocale a scansione laser.
15. Visualizza tutti i campioni con un microscopio confocale a scansione laser. Cattura le immagini usando la luce blu e salva i file su un computer.

Risultati

La Figura 1 illustra tutte le fasi di questo protocollo: allevamento di insetti, acquisizione del virus, escissione dell'intestino, marcatura immunofluorescente e realizzazione del vetrino.

Le budella WBPH asportate dagli adulti sono state fissate in paraformaldeide al 4% (m/v), permeabilizzate con Triton X-100 al 2% (v/v) e quindi incubate con Dylight 633 falloidina^10,18. La micrografia confocale a scansi...

Discussione

Per ottenere i migliori risultati, è necessario considerare alcuni punti chiave. In primo luogo, è necessario un alto rapporto di insetti viruliferi tra la popolazione totale. Sebbene l'AAP minimo per SRBSDV da parte di ninfe e adulti WBPH sia di 5 min¹⁷, gli insetti dovrebbero essere autorizzati a nutrirsi di piante di riso fresche infette da SRBSDV per 2 d per ottenere un'efficienza di acquisizione fino all'80%. Poiché i virioni SRBSDV possono essere rilevati nell'80% delle viscere medie

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3% Bull serum albumin (BSA)	Coolaber	SL1331	Dilute antibodies
Cover glass	Solarbio	YA0771-18*18mm	For slide making
Dissecting microscope	Beitja	XTL-7045B1	For insect dissection
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	Zeiss LSM880	Observe fluorescence signal
Microscope slides	Solarbio	ZBP-7105	For slide making
Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Abcam	AB104139	Label cell necleus
Paraformaldehyde	Sigma	158127	For tissues fixation
Phalloidin	Invitrogen	A22284	Label actin of midgut epithiels
Triton X-100	Amresco	0290C484	For tissues permeation
Tweezers (5-SA)	AsOne	6-7905-40	For insect dissection