Immunfluoreszenzmarkierung von pflanzlichen Virus- und Insektenvektorproteinen in Hemipteren-Eingeweiden

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zur Immunfluoreszenzmarkierung sowohl von Pflanzenvirusproteinen als auch von Vektorinsektenproteinen in herausgeschnittenen Insektendärmen kann verwendet werden, um Interaktionen zwischen Virus- und Vektorinsekten, Insektenproteinfunktionen und molekulare Mechanismen, die der Virusübertragung zugrunde liegen, zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die meisten Pflanzenviren in der Natur werden durch Hemipteran-Insekten von einer Pflanze auf eine andere übertragen. Eine hohe Populationsdichte der Vektorinsekten, die bei der Virusübertragung hocheffizient sind, spielt eine Schlüsselrolle bei Virusepidemien auf Feldern. Die Untersuchung von Virus-Insekten-Vektorinteraktionen kann unser Verständnis von Virusübertragung und Epidemien verbessern, mit dem Ziel, neuartige Strategien zur Bekämpfung von Pflanzenviren und ihren Vektorinsekten zu entwickeln. Die Immunfluoreszenzmarkierung ist weit verbreitet, um Interaktionen zwischen Krankheitserregern und Wirten zu analysieren, und wird hier in der Weißrücken-Zikade (WBPH, Sogatella furcifera) verwendet, die das südliche Reis-Schwarzstreifen-Zwergvirus (SRBSDV, Gattung Fijivirus, Familie Reoviridae) effizient überträgt, um die Virionen und Insektenproteine in den Epithelzellen des Mitteldarms zu lokalisieren. Mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie untersuchten wir die morphologischen Eigenschaften von Mitteldarmepithelzellen, die zelluläre Lokalisation von Insektenproteinen und die Kolokalisation von Virionen und einem Insektenprotein. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Virusaktivitäten in Insekten, Funktionen von Insektenproteinen und Wechselwirkungen zwischen Virus und Vektorinsekt zu untersuchen.

Einleitung

Die meisten beschriebenen Pflanzenviren werden durch Insekten aus der Ordnung Hemiptera übertragen, zu der Blattläuse, Weiße Fliegen, Zikaden, Zikaden und Thripse ^1,2 gehören. Die stechend-saugenden Mundwerkzeuge von Hemipteran-Insekten durchbohren das Pflanzengewebe, um Speichel zu füttern und abzusondern, wodurch das Virus gleichzeitig effizient übertragen^{wird 2}. Verschiedene Übertragungsmechanismen von Pflanzenviren durch Vektorinsekten wurden beschrieben. Dazu gehören nonpersistent, semipersistent und persistent. Der persistente Typ ist entweder nicht-propagativ oder propagativ^3,4, aber für beide Typen muss sich das übertragene Virus durch den Körper des Insekts bewegen. Im persistent-propagativen Modus infizieren und vermehren sich Viren zunächst in den Epithelzellen des Darms des Insekts, verbreiten sich dann in verschiedenen Geweben und schließlich in den Speicheldrüsen, von wo aus sie dann während der Insektenfütterung über den Speichel in eine Pflanze eingeführt werden^{können 5,6}. Persistente übertragene Viren bewegen sich durch verschiedene Organe und replizieren sich in ihren Insektenvektoren, was spezifische Wechselwirkungen zwischen Virus- und Vektorkomponenten in verschiedenen Stadien erfordert ^7,8.

Virale Proteine und Insektenproteine müssen interagieren, um kritische Prozesse für die Viruserkennung, -infektion, -replikation oder -verbreitung in den Vektorinsekten^zu erleichtern ^9,10. Obwohl die optische Mikroskopie verwendet werden kann, um zelluläre Strukturen in Insekten zu beobachten, kann sie keine Virionverteilung, zelluläre Lokalisation oder Kolokalisation von viralen Proteinen und Insektenproteinen oder die Ultrastruktur von Insektengeweben und -zellen zeigen. Die Immunfluoreszenzmarkierung wurde zuerst von Coons et al. in den phagozytischen Zellen der Maus mittels Markierung spezifischer Fluorescein-Antikörper durchgeführt und ist heute weit verbreitet¹¹. Die Immunfluoreszenztechnik, auch bekannt als Fluoreszenz-Antikörper-Technik, ist eine der frühesten immunologischen Markierungstechniken und basiert auf der spezifischen Bindungsreaktion zwischen dem Antigen und dem Antikörper^11,12. Der bekannte Antikörper wird zunächst mit Fluorescein markiert, das als Sonde zum Nachweis der entsprechenden Antigene in den Zellen oder Geweben verwendet wird^13,14. Nachdem der Fluorescein-markierte Antikörper an das entsprechende Antigen in Zellen oder Geweben gebunden hat, emittiert die Sonde eine helle Fluoreszenz, wenn sie mit Anregungswellenlängen bestrahlt und mit einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet wird, um das Antigen¹⁵ zu lokalisieren.

Die meisten Vektorinsekten von Pflanzenviren sind Hemipteren. Eine höhere Populationsdichte von Vektorinsekten, die eine hohe Übertragungseffizienz für das Pflanzenvirus aufweisen, kann zu Virusepidemien führen⁵. Das Südliche Reis-Schwarzstreifen-Zwergvirus (SRBSDV, Gattung Fijivirus, Familie Reoviridae), einer der schwerwiegendsten Erreger von Reis, hat sich in den Reisanbaugebieten in Ost- und Südostasien rasch ausgebreitet und seit 2010 schwere Ertragseinbußen verursacht^16,17. Erwachsene und Nymphen der Weißrückenzikade (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) übertragen SRBSDV persistent-propagativ mit hoher Effizienz auf Reis. Feldstudien haben gezeigt, dass Ausbrüche der SRBSDV-induzierten Reisschwarzstreifen-Zwergkrankheit in der Regel mit einer Massenmigration von WBPHs über große Entfernungen zusammenfallen, einem entscheidenden Faktor bei SRBSDV-Epidemien ^7,8,18. Vesicle-assoziiertes Membranprotein 7 (VAMP7) ist ein löslicher N-Ethylmaleimid-sensitiver Faktor-Bindungsprotein-Rezeptor (SNARE), der den Transport von Substanzen durch Vesikelfusion vermitteln kann. VAMP7 interagiert in vitro mit dem äußeren Hauptkapsidprotein von SRBSDV, was darauf hindeutet, dass VAMP7 eng mit der Virusübertragung assoziiert sein könnte¹⁶.

In dem hier vorgestellten Protokoll haben wir den Darm aus viruliferem WBPH herausgeschnitten, um SRBSDV-Virionen und VAMP7 in Mitteldarmepithelzellen^{zu markieren 16}. Als erste Invasionsstelle des Virus spielt das Mitteldarmepithel eine wichtige Rolle bei der Infektion, Replikation und Übertragung von Viren. Zuerst haben wir die Schritte beschrieben, um den Darm von Nymphen und Erwachsenen von WBPHs zu entfernen. Zweitens verwendeten wir spezifische Fluorescein-markierte Antikörper, um SRBSDV-Virionen und VAMP7 in Darmepithelzellen zu markieren. Dann beobachteten wir Epithelzellen und die zelluläre Lage der Virionen und VAMP7 über ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop. Die Ergebnisse zeigten, dass SRBSDV-Virionen und VAMP7 im Zytoplasma der Mitteldarmepithelzellen kolokalisieren können, was darauf hindeutet, dass die spezifische Funktion von VAMP7 mit der Verbreitung von Virionen aus Mitteldarmepithelzellen zusammenhängen könnte.

Protokoll

1. Nichtvirulifere Insektenaufzucht

1. WBPHs von Reisfeldern sammeln und mit Reissämlingen in 1-Liter-Glasbechern, die mit insektendichtem Netz bedeckt sind, in einem Inkubator bei 28 °C mit 16 h Licht und 8 h Dunkelheit aufziehen. Da SRBSDV nicht über Eier übertragen wird, sind frisch geschlüpfte Nymphen nicht virulifer.
2. Bürsten Sie mit einem Pinselstift jede Woche vorsichtig Insekten aus dem Becher, die Insekten aufziehen, in ein neues Becherglas mit frischen Reissämlingen, bis WBPH-Nymphen geschlüpft sind. Setzen Sie die Aufzucht dieser geschlüpften nichtviruliferen Nymphen bis zum 2- oder 3-in-Stadium fort.
   HINWEIS: Bürsten Sie vorsichtig, um zu vermeiden, dass WBPHs aus dem Becherglas fliegen oder sie beschädigen.

2. Viruserwerb und -sammlung von viruliferen Insekten

1. Übertragen Sie nichtvirulifere Insekten aus den Bechergläsern auf frische SRBSDV-infizierte Reispflanzen, die mit einem insektensicheren Netz bedeckt sind, für eine 2-Tage-Virus-Akquisitions-Zugangsperiode (AAP), indem Sie sich von Pflanzen ernähren. Sammeln Sie dann die Insekten in Glasbechern mit frischen Reissämlingen.
2. Sammeln Sie nach 2 Tagen die Insekten aus Glasbechern mit einem manuellen Aspirator zur Dissektion und Exzision des Darms.
   HINWEIS: Der minimale AAP von SRBSDV beträgt 5 min sowohl für WBPH-Nymphen als auch für Erwachsene, aber die Insekten sollten sich 2 Tage lang von frischen SRBSDV-infizierten Reispflanzen ernähren dürfen, um eine Erfassungseffizienz von bis zu 80% zu erreichen.

3. Vorbereitung der Reagenzien

1. 8,5 g NaCl, 3,5 g Na 2 HPO 4·12H 2 O und 0,25 g NaH 2 PO₄ werden in 1 ml ddH₂O gelöst, um 0,01 M Lösung phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) herzustellen.
2. Fügen Sie 4 g Paraformaldehyd zu 100 ml PBS hinzu, um 4% (m/v) Paraformaldehyd in PBS herzustellen.
3. Fügen Sie 2 ml Triton X-100 zu 98 ml PBS hinzu, um 2% (v/v) Triton X-100 herzustellen.

4. Dissektion von Erwachsenen und Exzision von Eingeweiden

1. Verwenden Sie eine Pipettiermaschine, um 100 μl PBS auf einen Objektträger zu geben. Legen Sie den Objektträger auf den Tisch eines optischen Mikroskops.
2. Sammeln Sie die SRBSDV-infizierten Erwachsenen aus Glasbechern mit einem manuellen Absauger und legen Sie sie in 1,5-ml-Röhrchen. Legen Sie die Röhrchen auf Eis, um Insekten zu lähmen, und übertragen Sie dann einen gelähmten Erwachsenen mit dem Bauch nach oben in die 100 μl PBS auf dem Objektträger.
   HINWEIS: Die Insekten sind nach 5 Minuten auf Eis gründlich gelähmt.
3. Verwenden Sie eine Pinzette in einer Hand, um den Körper festzuklemmen, und entfernen Sie dann den Kopf mit einer anderen Pinzette in der anderen Hand.
4. Klemmen Sie die Seiten des Bauches mit einer Pinzette fest und klemmen Sie den Ovipositor oder das Kopulationsorgan des Schwanzes mit dem anderen Satz fest. Ziehen Sie dann die intersegmentale Membran eines Bauchsegments vorsichtig weg und legen Sie den Darm langsam im Bauch frei.
5. Reißen Sie die Membran weiter weg und ziehen Sie nach und nach den gesamten Darm aus dem Bauch. Ziehen Sie den Schwanz, der mit dem Ende des Darms verbunden ist, vorsichtig ab, um den gesamten Darm zu entfernen.
   HINWEIS: Ziehen Sie sehr vorsichtig, sonst wird der Darm beschädigt.
6. Legen Sie die herausgeschnittenen Eingeweide in ein 200-μl-Zentrifugenröhrchen, geben Sie 200 μl PBS in das Röhrchen und saugen Sie die Lösung vorsichtig mit einer Pipette ab, um die Eingeweide gründlich zu waschen.

5. Sezieren von Nymphen und Exzision von Eingeweiden

HINWEIS: Nymphenkörper sind zerbrechlicher als erwachsene Körper, und der Darm kann leicht beschädigt werden, wenn er vom Schwanz gezogen wird. Daher ist die zuverlässigste Methode, den Nymphendarm zu entfernen, das Ziehen vom Kopf.

1. Verwenden Sie eine Pipettiermaschine, um 100 μl PBS auf einen Objektträger zu geben. Legen Sie den Objektträger auf den Tisch eines optischen Mikroskops.
2. Sammeln Sie die SRBSDV-infizierten Nymphen aus Glasbechern mit einem manuellen Aspirator und legen Sie sie in 1,5-ml-Röhrchen. Legen Sie die Röhrchen auf Eis, um Insekten zu lähmen. Übertragen Sie dann eine gelähmte Nymphe mit dem Bauch nach oben in die 100 μl Puffer auf dem Objektträger.
3. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Schwanz der Nymphe zu lösen. Klemmen Sie dann den Insektenkörper fest, um ihn vorsichtig zu fixieren, und verwenden Sie den anderen Satz, um den Kopf zu klemmen. Ziehen Sie den Kopf vorsichtig vom Körper weg, während Sie seine Befestigung am Darm beibehalten, so dass sich der Kopf vom Körper löst, der Darm jedoch immer noch am Brustkorb und am Bauch befestigt ist.
   HINWEIS: Nachdem der Kopf abgenommen wurde, fließt das Corpus Adiposum der Nymphe heraus, wodurch das PBS trüb wird. Entfernen Sie die trübe PBS-Lösung und wechseln Sie sie mit 100 μl frischem PBS.
4. Während die Pinzette den Körper noch festklemmt, verwenden Sie den anderen Satz, um den Kopf vorsichtig zu bewegen, und ziehen Sie den Darm allmählich heraus.
5. Lösen Sie den Darm vorsichtig mit einer Pinzette vom Kopf und erhalten Sie schließlich einen intakten Darm, ohne den Körper der Zikade zu beschädigen.
6. Legen Sie die herausgeschnittenen Eingeweide in ein 200-μl-Zentrifugenröhrchen, geben Sie 200 μl PBS in das Röhrchen und saugen Sie die Lösung vorsichtig mit einer Pipette ab, um die Eingeweide gründlich zu waschen.
   HINWEIS: Die herausgeschnittenen Eingeweide sollten gut mit PBS gereinigt werden, um kontaminierende Fettkörper aus der Bauchhöhle zu entfernen. Sie können das Färbeprotokoll stören.

6. Markierungsprotokolle für SRBSDV-Virionen und ein Insektenprotein

1. Bereiten Sie die Antikörper und das Einlagerungsmedium vor, die in diesem Assay verwendet werden. Antikörper sind mit Dylight 549 (rot) markierte Anti-SRBSDV-Antikörper gegen SRBSDV-Virionen 18, mit Dylight 488 (grün) markierte Anti-VAMP7-Antikörper gegen das Insektenprotein VAMP7^16,19, Dylight 633 Phalloidin (blau) und Einlagemedium, das 4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI^, blau) enthält.
2. Legen Sie die frisch herausgeschnittenen und PBS-gewaschenen WBPH-Eingeweide sofort in 100 μl 4% (m/v) Paraformaldehyd in ein 200-μl-Zentrifugenröhrchen und halten Sie sie 2 h bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Die frisch herausgeschnittenen WBPH-Eingeweide sollten nicht länger in PBS eingeweicht werden, da sonst die Epithelzellen beschädigt werden.
3. Entfernen Sie 4 % (m/v) Paraformaldehyd mit einem Pipettor und geben Sie dann 200 μl PBS in das 200 μl Zentrifugenröhrchen. Entfernen Sie PBS nach 10 Minuten mit einer Pipettiermaschine, um Paraformaldehyd zu entfernen.
4. Wiederholen Sie diesen PBS-Waschschritt zweimal.
5. Entfernen Sie das PBS und fügen Sie 200 μl nichtionisches Reinigungsmittel Triton X-100 (2%, v/v) hinzu. Permeabilisieren Sie die Proben im nichtionischen Detergens für 30 min bei Raumtemperatur.
6. Entfernen Sie 2 % (v/v) Triton X-100 mit einer Pipette und waschen Sie dann das restliche Reinigungsmittel mit drei 10-minütigen Wäschen mit 200 μl PBS ab (siehe Schritte 6.3 und 6.4).
7. Verdünnen Sie den mit Dylight 549 (rot) markierten Anti-SRBSDV-Antikörper und den mit Dylight 488 (grün) markierten Anti-VAMP7-Antikörper 1:50 mit 50 μl Bullserumalbumin (3%, m/v).
8. Die verdünnten Antikörper werden in das Röhrchen gegeben und die Proben über Nacht bei 4 °C inkubiert.
9. Entfernen Sie das Antikörperverdünnungsmittel mit einem Pipettor und waschen Sie dann das verbleibende Antikörperverdünnungsmittel mit drei 10-minütigen Wäschen mit 200 μl PBS ab.
10. 1 μl Dylight 633 Phalloidin mit 50 μl PBS verdünnen.
11. 50 μl verdünntes Phalloidin in das Röhrchen geben und die Proben 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
12. Entfernen Sie das Phalloidin-Verdünnungsmittel mit einem Pipettor und waschen Sie dann das restliche Phalloidin mit drei 10-minütigen Wäschen mit 200 μl PBS ab.
    HINWEIS: Gründliches Waschen ist entscheidend, um den Hintergrund und die unspezifische Bindung zu reduzieren.
13. Legen Sie einen Tropfen des Einlegemediums, das DAPI enthält, auf einen Objektträger und übertragen Sie die Eingeweide auf das Medium.
    HINWEIS: Entfalten Sie jeden Darm vorsichtig mit einer Pinzette und vermeiden Sie die Bildung von Blasen. Es gibt etwa 15 Eingeweide pro Folie.
14. Legen Sie vorsichtig ein Deckglas über die Proben, ohne Blasen zu bilden.
    HINWEIS: Der Objektträger sollte bei 4 °C im Dunkeln gehalten werden, um die Fluoreszenzlöschung vor der Beobachtung mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop zu verhindern.
15. Betrachten Sie alle Proben mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop. Nehmen Sie die Bilder mit blauem Licht auf und speichern Sie die Dateien auf einem Computer.

Ergebnisse

Abbildung 1 veranschaulicht alle Schritte in diesem Protokoll: Insektenaufzucht, Viruserwerb, Exzision des Darms, Immunfluoreszenzmarkierung und Herstellung des Objektträgers.

Exzidierte WBPH-Eingeweide von Erwachsenen wurden in 4% (m/v) Paraformaldehyd fixiert, mit 2% (v/v) Triton X-100 permeabilisiert und dann mit Dylight 633 Phalloidin^10,18 inkubiert. Die konfokale Laserscanning-Aufnahme in

Diskussion

Um die besten Ergebnisse zu erzielen, sollten einige wichtige Punkte beachtet werden. Erstens ist ein hoher Anteil viruliferer Insekten an der Gesamtpopulation notwendig. Obwohl der minimale AAP für SRBSDV durch WBPH-Nymphen und Erwachsene 5 min¹⁷ beträgt, sollten die Insekten 2 Tage lang von frischen SRBSDV-infizierten Reispflanzen gefressen werden, um eine Erfassungseffizienz von bis zu 80% zu erreichen. Da die SRBSDV-Virionen in 80% des Mitteldarms nachgewiesen werden können

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3% Bull serum albumin (BSA)	Coolaber	SL1331	Dilute antibodies
Cover glass	Solarbio	YA0771-18*18mm	For slide making
Dissecting microscope	Beitja	XTL-7045B1	For insect dissection
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	Zeiss LSM880	Observe fluorescence signal
Microscope slides	Solarbio	ZBP-7105	For slide making
Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Abcam	AB104139	Label cell necleus
Paraformaldehyde	Sigma	158127	For tissues fixation
Phalloidin	Invitrogen	A22284	Label actin of midgut epithiels
Triton X-100	Amresco	0290C484	For tissues permeation
Tweezers (5-SA)	AsOne	6-7905-40	For insect dissection