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Resumen

El perfil de N-glicanos de las glicoproteínas es esencial para descubrir nuevos biomarcadores y comprender las funciones de los glicanos en los eventos celulares. Además, el análisis de N-glicanos de proteínas biofarmacéuticas es muy importante para el uso humano. En este artículo, se presentó una estrategia de alto rendimiento para identificar y cuantificar estructuras de N-glicanos utilizando la técnica HILIC-FLD-MS/MS.

Resumen

La glicosilación es una modificación vital que se encuentra en las proteínas. El perfil de N-glicanos de las glicoproteínas es necesario para detectar nuevos candidatos a biomarcadores y determinar las alteraciones de los glicanos en las enfermedades. La mayoría de las proteínas biofarmacéuticas disponibles en el mercado son glicoproteínas. La eficacia de estos fármacos se ve afectada por los patrones de glicosilación. Por lo tanto, es necesario un método de caracterización en profundidad para los N-glicanos. Aquí, presentamos un enfoque integral para el análisis cualitativo y cuantitativo de N-glicanos utilizando cromatografía líquida de interacción hidrofílica equipada con detección de fluorescencia y espectrometría de masas en tándem (HILIC-FLD-MS/MS). Los N-glicanos se liberaron de las glicoproteínas con un método sencillo y se marcaron mediante una etiqueta de fluoróforo de procainamida en la estrategia. Posteriormente, se analizaron los N-glicanos marcados con procainamida mediante la técnica HILIC-FLD-MS/MS. En este enfoque, las estructuras de N-glicanos se confirmaron mediante el análisis espectrométrico de masas en tándem, mientras que la detección de fluorescencia se utilizó para el análisis cuantitativo. En el estudio se describe una aplicación para el análisis de datos de los picos de N-glicanos detectados. Este protocolo se puede aplicar a cualquier glicoproteína extraída de varias especies.

Introducción

La glicosilación es una modificación postraduccional vital observada en las proteínas1. Múltiples procesos enzimáticos regulan la modificación de la glicosilación en los organismos celulares. Los glicanos se unen a las proteínas mediante estos procesos enzimáticos, y las proteínas sometidas a esta modificación se denominan glicoproteínas1. Dos tipos de glicosilación se observan comúnmente en las proteínas. La O-glicosilación es la unión de O-glicanos a la cadena lateral de los residuos de aminoácidos de serina o treonina. La N-glicosilación es la unión de N-glicanos a la cadena lateral del residuo de aminoácidos de asparagina en una proteína.

La estructura, la estabilidad y el plegamiento de las proteínas se ven afectados por las uniones de glicanos2. El proceso de glicosilación influye drásticamente en las funciones de las proteínas, y las glicoproteínas regulan muchas funciones celulares en los organismos 3,4. Por ejemplo, las proteínas fuertemente glicosiladas protegen sus glicoproteínas de la degradación proteolítica5. Otro ejemplo son los glicanos de las proteínas de la glándula tiroides que regulan el transporte de Tg y la síntesis de hormonas 6,7. Para explicar su papel en los eventos celulares, se requiere una caracterización en profundidad de las glicoproteínas8.

Los perfiles de N-glicanos de las glicoproteínas cambian en situaciones de enfermedad 9,10,11,12. Es necesario perfilar los N-glicanos derivados de glicoproteínas o fluidos corporales cruciales para descubrir nuevos biomarcadores y comprender los cambios en la actividad enzimática en los casos de enfermedad. Por otro lado, la mayoría de los biofármacos proteicos son glicoproteínas, y sus perfiles de glicanos influyen en la eficacia del fármaco13. Por lo tanto, se debe realizar un método aceptable de perfil de N-glicanos en el desarrollo de biofármacos proteicos adecuados para uso humano14.

La glicómica es una disciplina emergente utilizada para identificar y cuantificar las estructuras de glicanos de moléculas glicosiladas15,16. Se han utilizado muchos métodos para perfilar los glicanos de las especies glicosiladas, incluyendo la RMN17 y la MS18. La cromatografía líquida de interacción hidrofílica con detección de fluorescencia (HPLC-HILIC-FLD) es el método de referencia para perfilar N-glicanos derivados de glicoproteínas19. Cuando esta estrategia se combina con la detección por espectrometría de masas, la identificación de estructuras de N-glicanos podría ser más fácil y fiable. La mayoría de los marcadores de fluorescencia utilizados en el análisis de N-glicanos con espectrometría de masas tienen una baja eficiencia de ionización. Por el contrario, la procainamida aumenta la eficiencia de ionización de los N-glicanos, lo que se utiliza para obtener espectros de masas en tándem eficientes de estructuras de N-glicanos 20,21. A partir de esta estrategia se pueden obtener fragmentos específicos mediante espectrometría de masas en tándem para la identificación estructural de N-glicanos como el núcleo fucosilado22 (proc-HexNAc1Fuc1) y los tipos bisectrizantes23 (proc-Hex1HexNAc3, proc-Hex1HexNAc3Fuc1).

Este estudio demuestra un protocolo sencillo para el perfil de N-glicanos de glicoproteínas con HILIC-FLD-MS/MS. El método presentado incluye cuatro pasos: (1) liberación de N-glicanos de las glicoproteínas, (2) marcaje de N-glicanos mediante una etiqueta de procainamida, (3) purificación de los N-glicanos marcados con procainamida y (4) análisis de datos.

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Protocolo

NOTA: El plasma humano utilizado está disponible comercialmente (Tabla de Materiales). No se utilizaron más muestras biológicas obtenidas de seres humanos.

1. Liberación de glicanos

  1. Desnaturalización de las (glico)proteínas
    1. Prepare los patrones de glicoproteínas (por ejemplo, IgG, un anticuerpo monoclonal) a una concentración de 10 μg·μL-1 en H2O desionizado. Para el plasma humano, la concentración utilizada es de 70 μg·μL-1.
      NOTA: Las muestras deben ser vertiginosas hasta que se disuelvan todas las proteínas sólidas. Para la preparación de las muestras de plasma se utilizó plasma humano (liofilizado).
    2. Tomar 20 μL de muestras de glicoproteínas (200 μg) y plasma humano liofilizado (1,4 mg).
    3. Añadir 40 μL de SDS (dodecil sulfato de sodio) al 2% (p/v).
    4. Incubar las muestras a 60 °C durante 10 min para desnaturalizar las (glico)proteínas.
      NOTA: Las muestras pueden ser mezcladas a 500 rpm por un termomezclador durante la incubación. Alternativamente, se puede utilizar un baño de agua agitado.
  2. Liberación de glicanos
    1. Añadir 20 μL de Igepal-CA630 al 4% a las muestras del paso 1.1.4.
    2. Añadir 20 μL de 5x PBS (solución salina tampón fosfato).
    3. Preparar la enzima PNGasa F a la concentración de 1 U·μL-1 en agua desionizada.
    4. Agregue 1 U de enzima para los patrones de glicoproteína y 2 U de enzima para muestras de plasma humano.
    5. Incubar las muestras a 37 °C durante 16 h.
  3. Etiquetado de procainamida
    1. Prepare la solución de etiquetado con ácido clorhídrico procainamida (110 mg·mL-1 en DMSO/AA (dimetilsulfóxido/ácido acético glacial) 7/3, v/v).
    2. Prepare la solución de aminación reductora con cianoborohidruro de sodio (65 mg·mL-1 en DMSO/AA, 7/3, v/v).
      PRECAUCIÓN: El cianoborohidruro de sodio es muy tóxico e inflamable. Use protectores para los ojos. El complejo de 2-picolina borano (107 mg·mL-1 en DMSO) podría utilizarse alternativamente.
    3. Mezcle estas soluciones en una proporción de 1:1, v/v para preparar la mezcla de etiquetado.
    4. Añada 100 μL de esta mezcla de etiquetado a la muestra de glicano liberada del paso 1.2.5.
    5. Incubar las muestras a 65 °C durante 2 h.

2. Purificación de N-glicanos marcados con procainamida mediante cartucho de extracción en fase sólida (SPE)

  1. Preparar una solución de celulosa microcristalina (100 mg·mL-1) en agua desionizada.
  2. Tome 300 μL de celulosa microcristalina e insértela en los tubos de microcentrífuga.
  3. Lavar la celulosa microcristalina con 1 mL de H2O desionizado.
  4. Lavar la celulosa microcristalina con 1 mL de ACN/MQ (acetonitrilo/dH2O), 85/15, v/v para acondicionamiento.
    NOTA: La microcentrífuga debe usarse durante 1 minuto para desechar las soluciones de lavado con cuidado.
  5. Tomar 120 μL de solución de liberación de glicanos y mezclar con 680 μL de ACN para obtener las condiciones de carga adecuadas (85/15, v/v, ACN/muestra).
  6. Mezclar esta mezcla con celulosa microcristalina en los tubos de microcentrífuga.
  7. Incubar a temperatura ambiente en una termobatidora agitando a 500 rpm durante 15 min.
  8. Transfiera la suspensión a un cartucho SPE (capacidad de volumen de 1 mL).
    NOTA: No permita que entre aire en el empaque del cartucho.
  9. Deseche las soluciones de carga pasando lentamente (1 gota/segundo).
    NOTA: Asegúrese de que el sistema SPE esté conectado a la bomba de vacío. Los disolventes pueden fluir con la gravedad. Cuando sea necesario, aplique vacío a través de una bomba de vacío. La presión de vacío aplicada debe ajustarse adecuadamente para transferir líquidos hacia abajo lentamente.
  10. Lave la muestra pasando 1 mL de solución de ACN/MQ/TFA (acetonitrilo/dH2O/ácido trifluoroacético) (85/14/1, v/v/v) dos veces.
  11. Lave la muestra pasando 1 mL de la mezcla ACN/MQ (85/15, v/v) dos veces.
  12. Eluir los N-glicanos marcados con procainamida con 0,75 mL de agua.
  13. Seque la solución de elución con un concentrador durante la noche.
    NOTA: Utilice una temperatura del concentrador de 45 °C para el secado.
  14. Disuelva las muestras secas en una mezcla de 100 μL de ACN/MQ (75/25, v/v) y transfiera esta solución a los viales, incluido un inserto.
    NOTA: Las muestras redisueltas deben ser en vórtice durante 20 segundos.

3. Análisis HILIC-FLD-MS/MS

  1. Inserte los adaptadores en T (T) en la columna HILIC para separar el flujo en los dos volúmenes iguales. Conecte uno de ambos al detector FLD y el otro al detector MS.
    NOTA: Las líneas de flujo deben tener las mismas longitudes.
  2. Ajuste un programa de gradiente para las separaciones HILIC de N-glicanos marcados con procainamida como se indica en la Figura Suplementaria 1. Utilice Fase A Móvil: 50 mM de formiato de amonio (pH: 4,4 y Fase Móvil B: 100 % ACN).
    NOTA: El programa de gradiente podría optimizarse aún más en función de la heterogeneidad de glicanos de las muestras.
  3. Haga clic en el botón Sampler y ajuste el volumen de inyección a 10 μL.
  4. Haga clic en Composición de columnas y ajuste la temperatura de la columna a 60 °C.
  5. Haga clic en FLD y ajuste las longitudes de onda de excitación y emisión de FLD a 310 nm y 370 nm, respectivamente.
  6. Ajuste los parámetros de fuente, sintonización y MS/MS de MS como se muestra en la Figura complementaria 2.
    NOTA: Los parámetros MS y MS/MS pueden modificarse en función de la espectrometría de masas utilizada en el análisis.

4. Análisis de datos

  1. Identificación de N-glicanos marcados con procainamida
    1. Exporte datos MS/MS en un formato adecuado para las búsquedas en bases de datos (por ejemplo, .mgf, .xml).
    2. Insértelos en una herramienta de búsqueda en una base de datos para la identificación de N-glicanos.
    3. Seleccione el nombre de la muestra que aparece en el software y haga clic en el botón Búsqueda de glicanos para la identificación de la procainamida marcada con N-glicanos utilizando la base de datos de Carbbank con los parámetros proporcionados (Figura complementaria 3).
    4. Abra el botón editar cromatogramas en el software de análisis de datos para datos sin procesar y seleccione el tipo de cromatograma iónico extraído filtrando en todos los MSn.
    5. Agregue masas específicas para el fragmento fucosilado proc-N1F1 (m/z 587.3+) y los fragmentos bisectados proc-H1N3 (m/z 1009.5+) y proc-H1N3F1 (m/z 1155.5+).
    6. Determinar los precursores que contienen fragmentos de estructura de N-glicanos fucosilados y bisectados.
    7. Exporte las estructuras de N-glicanos identificadas por el software (Tabla suplementaria 1-3).
    8. Comprobar los precursores detectados manualmente para la determinación de estructuras de N-glicanos fucosiladas y bisectadas.
  2. Cuantificación de N-glicanos marcados con procainamida mediante un software de código abierto24
    1. Seleccione Cromatograma FLD en los cromatogramas y haga clic en el método en el software. Abra un método para exportar cromatogramas en formato de archivo .xy.
    2. Convierta el formato de archivo .xy de los cromatogramas exportados en archivos .txt.
    3. Abra el software de análisis cuantitativo.
      NOTA: El software utilizado en el estudio se puede descargar desde una fuente de Github (https://github.com/Tarskin/HappyTools).
    4. Siga las instrucciones y tutoriales del programa presentados por el desarrollador.
      NOTA: Se recomienda utilizar un proceso por lotes para exportar áreas relativas.
    5. Ajuste los parámetros de configuración (Figura complementaria 4). Defina cuatro picos mínimos y 27 relaciones señal/ruido para las calibraciones.
    6. Abra el archivo de resultados con el software adecuado, como Microsoft Excel, para una evaluación adicional.

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Resultados

En este enfoque presentado, los N-glicanos se liberaron primero, marcados por la etiqueta de procainamida y purificados por cartuchos de SPE que contienen celulosa. A continuación, se realizó un análisis de N-glicanos de IgG, trastuzumab y plasma humano mediante un sistema HPLC-HILIC-FLD-MS/MS. En la Figura 1 se muestran los cromatogramas MS (pico de base) y FLD de las estructuras N-glicanos determinadas obtenidas a partir de Ig...

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Discusión

El perfil de N-glicanos de glicoproteínas incluye pasos desafiantes. Aunque existen muchas metodologías diferentes para este propósito, se debe seleccionar un enfoque adecuado tanto para la identificación como para la cuantificación de las estructuras de N-glicanos 14. HILIC-FLD es el enfoque de referencia para la cuantificación de N-glicanos. Sin embargo, no se logra la identificación de todos los tipos de N-glicanos med...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado en parte por el Ministerio de Desarrollo de la República de Turquía con el número de proyecto: 2016 K121230. Bekir Salih agradece a la Academia Turca de Ciencias (TUBA) por el apoyo financiero parcial.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidCarlo Erba Reagents401413Glacial RS For LC/MS
AcetonitrileMerck1000292500LC-MS LiChrosolv
Agilent 1200 Series HPLC with 1260 Series FLD dedectorAgilent Technologies
Ammoniumm FormateCarlo Erba Reagents419741For LC/MS
Bruker TIMS-TOF (Q-TOF) Mass SpectrometryBruker Daltonics
CelluloseSigma Aldrich310697microcrystalline, powder, 20 μm
Deionized WaterCarlo Erba Reagents412111For LC/MS
Dimethyl sulfoxideSigma Aldrich41639BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (GC)
Empty polypropylene SPE Tube with PE fritsSigma Aldrich5422020 μm porosity,volume 1 mL
Extraction Manifold, 20-positionWatersWAT200607Complete with rack for 13 x 100 mm tubes
Human PlasmaSigma AldrichP9523lyophilized
IGEPAL CA-630Sigma AldrichI8896for molecular biology
IgGSigma AldrichI4506lyophilized powder
Phosphate buffered salineSigma AldrichP4417Tablet
PNGase F enzymePromegaV483A
Procainamide hydrochlorideabcamab120955
Sodium cyanoborohydrideSigma Aldrich156159reagent grade, 95%
Sodium dodecyl sulfateSigma Aldrich71725
trastuzumabRoche Diagnostics
Trifluoroacetic acidSigma Aldrich302031for HPLC, ≥99.9%

Referencias

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