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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

La profilazione degli N-glicani delle glicoproteine è essenziale per scoprire nuovi biomarcatori e comprendere le funzioni dei glicani negli eventi cellulari. Inoltre, l'analisi degli N-glicani dei biofarmaci proteici è molto importante per l'uso umano. In questo articolo, è stata presentata una strategia ad alto rendimento per identificare e quantificare le strutture di N-glicani utilizzando la tecnica HILIC-FLD-MS/MS.

Abstract

La glicosilazione è una modifica vitale che si trova nelle proteine. La profilazione degli N-glicani delle glicoproteine è necessaria per rilevare nuovi candidati biomarcatori e determinare le alterazioni dei glicani nelle malattie. La maggior parte delle proteine biofarmaceutiche disponibili in commercio sono glicoproteine. L'efficacia di questi farmaci è influenzata dai pattern di glicosilazione. Pertanto, è necessario un metodo di caratterizzazione approfondito per gli N-glicani. Qui, presentiamo un approccio completo per l'analisi qualitativa e quantitativa degli N-glicani utilizzando la cromatografia liquida a interazione idrofila dotata di rivelazione a fluorescenza e spettrometria di massa tandem (HILIC-FLD-MS/MS). Gli N-glicani sono stati rilasciati dalle glicoproteine con un metodo facile e marcati con un marcatore di fluoroforo di procainamide nella strategia. Successivamente, gli N-glicani marcati con procainamide sono stati analizzati con una tecnica HILIC-FLD-MS/MS. In questo approccio, le strutture degli N-glicani sono state confermate dall'analisi spettrometrica di massa tandem, mentre per l'analisi quantitativa è stata utilizzata la rilevazione della fluorescenza. Nello studio viene descritta un'applicazione per l'analisi dei dati dei picchi di N-glicani rilevati. Questo protocollo può essere applicato a qualsiasi glicoproteina estratta da varie specie.

Introduzione

La glicosilazione è una modificazione post-traduzionale vitale osservata nelle proteine1. Molteplici processi enzimatici regolano la modificazione della glicosilazione negli organismi cellulari. I glicani sono attaccati alle proteine da questi processi enzimatici e le proteine sottoposte a questa modifica sono chiamate glicoproteine1. Due tipi di glicosilazione sono comunemente osservati nelle proteine. L'O-glicosilazione è l'attaccamento degli O-glicani alla catena laterale dei residui di aminoacidi di serina o treonina. La N-glicosilazione è l'attaccamento degli N-glicani alla catena laterale del residuo di amminoacido asparagina in una proteina.

La struttura, la stabilità e il ripiegamento delle proteine sono influenzati dagli attacchi dei glicani2. Il processo di glicosilazione influenza notevolmente le funzioni delle proteine e le glicoproteine regolano molte funzioni cellulari negli organismi 3,4. Ad esempio, le proteine fortemente glicosilate proteggono le loro glicoproteine dalla degradazione proteolitica5. Un altro esempio sono i glicani delle proteine della ghiandola tiroidea che regolano il trasporto della Tg e la sintesi ormonale 6,7. Per spiegare il loro ruolo negli eventi cellulari, è necessaria una caratterizzazione approfondita delle glicoproteine8.

I profili N-glicani delle glicoproteine cambiano in situazioni di malattia 9,10,11,12. La profilazione degli N-glicani derivati da glicoproteine cruciali o fluidi corporei è necessaria per scoprire nuovi biomarcatori e comprendere i cambiamenti dell'attività enzimatica nei casi di malattia. D'altra parte, la maggior parte dei biofarmaci proteici sono glicoproteine e i loro profili glicani influenzano l'efficacia dei farmaci13. Pertanto, un metodo accettabile di profilazione degli N-glicani deve essere eseguito nello sviluppo di biofarmaci proteici adeguati per uso umano14.

La glicomica è una disciplina emergente utilizzata per identificare e quantificare le strutture dei glicani delle molecole glicosilate 15,16. Molti metodi sono stati utilizzati per profilare i glicani delle specie glicosilate, tra cui NMR17 e MS18. La cromatografia liquida con interazione idrofila con rilevamento della fluorescenza (HPLC-HILIC-FLD) è il metodo gold standard per la profilazione degli N-glicani derivati dalle glicoproteine19. Quando questa strategia è combinata con la rilevazione spettrometrica di massa, l'identificazione delle strutture di N-glicani potrebbe essere più facile e affidabile. La maggior parte dei tag di fluorescenza utilizzati nell'analisi degli N-glicani con spettrometria di massa ha una bassa efficienza di ionizzazione. Al contrario, la procainamide aumenta l'efficienza di ionizzazione degli N-glicani, che viene utilizzata per ottenere efficienti spettri di massa tandem delle strutture degli N-glicani 20,21. Frammenti specifici possono essere ottenuti da questa strategia mediante spettrometria di massa tandem per l'identificazione strutturale di N-glicani come il nucleo fucosilato22 (proc-HexNAc1Fuc1) e i tipi bisecanti23 (proc-Hex1HexNAc3, proc-Hex1HexNAc3Fuc1).

Questo studio dimostra un protocollo facile per la profilazione degli N-glicani delle glicoproteine con HILIC-FLD-MS/MS. Il metodo presentato comprende quattro fasi: (1) rilascio di N-glicani dalle glicoproteine, (2) marcatura degli N-glicani mediante un tag di procainamide, (3) purificazione degli N-glicani marcati con procainamide e (4) analisi dei dati.

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Protocollo

NOTA: Il plasma umano utilizzato è disponibile in commercio (Tabella dei materiali). Non sono stati utilizzati ulteriori campioni biologici ottenuti dall'uomo.

1. Rilascio di glicani

  1. Denaturazione delle (glico-)proteine
    1. Preparare gli standard delle glicoproteine (ad es. IgG, un anticorpo monoclonale) a una concentrazione di 10 μg·μL-1 in H2O deionizzato. Per il plasma umano, la concentrazione utilizzata è di 70 μg·μL-1.
      NOTA: I campioni devono essere agitati fino a quando tutte le proteine solide non sono disciolte. Il plasma umano (liofilizzato) è stato utilizzato per la preparazione dei campioni di plasma.
    2. Prelevare 20 μL di campioni di glicoproteine (200 μg) e plasma umano liofilizzato (1,4 mg).
    3. Aggiungere 40 μl di SDS (sodio dodecil solfato) al 2% (p/v).
    4. Incubare i campioni a 60 °C per 10 minuti per denaturare le (glico-)proteine.
      NOTA: I campioni possono essere miscelati a 500 giri/min da un termomiscelatore durante l'incubazione. In alternativa si potrebbe utilizzare un bagno d'acqua agitante.
  2. Rilascio di glicani
    1. Aggiungere 20 μl di Igepal-CA630 al 4% ai campioni del passaggio 1.1.4.
    2. Aggiungere 20 μl di 5x PBS (soluzione salina tampone fosfato).
    3. Preparare l'enzima PNGasi F alla concentrazione di 1 U·μL-1 in acqua deionizzata.
    4. Aggiungere 1 U di enzima per gli standard glicoproteici e 2 U di enzima per i campioni di plasma umano.
    5. Incubare i campioni a 37 °C per 16 ore.
  3. Etichettatura della procainamide
    1. Preparare la soluzione di marcatura utilizzando acido cloridrico procainamide (110 mg·mL-1 in DMSO/AA (dimetilsolfossido / acido acetico glaciale) 7/3, v/v).
    2. Preparare una soluzione di amminazione riduttiva utilizzando cianoboroidruro di sodio (65 mg·mL-1 in DMSO/AA, 7/3, v/v).
      ATTENZIONE: Il cianoboroidruro di sodio è molto tossico e infiammabile. Indossare protezioni per gli occhi. In alternativa potrebbe essere utilizzato il complesso di 2-picolina borano (107 mg·mL-1 in DMSO).
    3. Mescolare queste soluzioni in un rapporto di 1:1, v/v per preparare la miscela di etichettatura.
    4. Aggiungere 100 μl di questa miscela di marcatura al campione rilasciato dal glicano dal passaggio 1.2.5.
    5. Incubare i campioni a 65 °C per 2 ore.

2. Purificazione di N-glicani marcati con procainamide mediante cartuccia di estrazione in fase solida (SPE)

  1. Preparare una soluzione di cellulosa microcristallina (100 mg·mL-1) in acqua deionizzata.
  2. Prelevare 300 μl di cellulosa microcristallina e inserirla nelle provette della microcentrifuga.
  3. Lavare la cellulosa microcristallina con 1 mL di H2O deionizzato.
  4. Lavare la cellulosa microcristallina con 1 mL di ACN/MQ (acetonitrile/dH2O), 85/15, v/v per il condizionamento.
    NOTA: La microcentrifuga deve essere utilizzata per 1 minuto per scartare accuratamente le soluzioni di lavaggio.
  5. Prelevare 120 μl di soluzione di rilascio di glicano e miscelare con 680 μl di ACN per ottenere condizioni di carico adeguate (85/15, v/v, ACN/campione).
  6. Mescolare questa miscela con cellulosa microcristallina nelle provette della microcentrifuga.
  7. Incubarlo a temperatura ambiente in un termomixer agitando a 500 giri/min per 15 min.
  8. Trasferire l'impasto in una cartuccia SPE (capacità di volume di 1 mL).
    NOTA: Evitare che l'aria penetri nell'imballaggio della cartuccia.
  9. Scartare le soluzioni di caricamento passando lentamente (1 goccia/secondo).
    NOTA: Assicurarsi che il sistema SPE sia collegato alla pompa del vuoto. I solventi possono fluire per gravità. Se necessario, applicare il vuoto tramite una pompa a vuoto. La pressione del vuoto applicata deve essere regolata in modo appropriato per trasferire lentamente i liquidi verso il basso.
  10. Lavare il campione facendo passare due volte 1 mL di soluzione di ACN/MQ/TFA (acetonitrile/dH2O/acido trifluoroacetico) (85/14/1, v/v/v).
  11. Lavare il campione passando due volte 1 mL di miscela ACN/MQ (85/15, v/v).
  12. Eluire gli N-glicani marcati con procainamide con 0,75 ml di acqua.
  13. Asciugare la soluzione di eluizione con un concentratore per una notte.
    NOTA: Utilizzare una temperatura del concentratore di 45 °C per l'essiccazione.
  14. Sciogliere i campioni essiccati in una miscela di 100 μl di ACN/MQ (75/25, v/v) e trasferire questa soluzione nelle fiale, compreso un inserto.
    NOTA: I campioni ridisciolti devono essere agitati per 20 secondi.

3. Analisi HILIC-FLD-MS/MS

  1. Inserire gli adattatori a T (T) nella colonna HILIC per separare il flusso nei due volumi uguali. Collegare uno di entrambi al rilevatore FLD, l'altro al rilevatore MS.
    NOTA: Le linee di flusso devono avere le stesse lunghezze.
  2. Regolare un programma di gradiente per le separazioni HILIC di N-glicani marcati con procainamide come indicato nella Figura 1 supplementare. Utilizzare Mobile Phase A: 50 mM di formiato di ammonio (pH: 4,4 e Mobile Phase B: 100 % ACN).
    NOTA: Il programma del gradiente potrebbe essere ulteriormente ottimizzato a seconda dell'eterogeneità dei glicani dei campioni.
  3. Fare clic sul pulsante Campionatore e impostare il volume di iniezione su 10 μl.
  4. Fare clic su Comp colonna e regolare la temperatura della colonna a 60 °C.
  5. Fare clic su FLD e regolare le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione FLD rispettivamente su 310 nm e 370 nm.
  6. Regolare la sorgente MS, la sintonizzazione e i parametri MS/MS come mostrato nella Figura 2 supplementare.
    NOTA: I parametri MS e MS/MS possono essere modificati a seconda della spettrometria di massa utilizzata nell'analisi.

4. Analisi dei dati

  1. Identificazione di N-glicani marcati con procainamide
    1. Esporta i dati MS/MS con un formato appropriato per le ricerche nel database (ad esempio, .mgf, .xml).
    2. Inseriscili in uno strumento di ricerca in un database per l'identificazione degli N-glicani.
    3. Selezionare il nome del campione elencato nel software e fare clic sul pulsante di ricerca dei glicani per l'identificazione degli N-glicani marcati con procainamide utilizzando il database Carbbank con i parametri specificati (Figura 3 supplementare).
    4. Aprire il pulsante Modifica cromatogrammi nel software di analisi dei dati per i dati grezzi e selezionare il tipo di cromatogramma ionico estratto filtrando in tutti gli MSn.
    5. Aggiungere masse specifiche per il frammento fucosilato-nucleo proc-N1F1 (m/z 587.3+) e i frammenti bisecati proc-H1N3 (m/z 1009.5+) e proc-H1N3F1 (m/z 1155.5+).
    6. Determinare i precursori contenenti frammenti di struttura di N-glicani fucosilati e bisecati in due.
    7. Esportare le strutture di N-glicani identificate dal software (Tabella supplementare 1-3).
    8. Controllare i precursori rilevati manualmente per la determinazione delle strutture di N-glicani fucosilate e bisezionate.
  2. Quantificazione di N-glicani marcati con procainamide mediante un software open source24
    1. Selezionare il cromatogramma FLD nei cromatogrammi e fare clic sul metodo nel software. Aprire un metodo per esportare i cromatogrammi in formato file .xy.
    2. Converti il formato di file .xy dei cromatogrammi esportati in file .txt.
    3. Aprire il software di analisi quantitativa.
      NOTA: Il software utilizzato nello studio può essere scaricato da una fonte Github (https://github.com/Tarskin/HappyTools).
    4. Segui le istruzioni e i tutorial del programma presentati dallo sviluppatore.
      NOTA: Si consiglia di utilizzare un processo batch per esportare le aree relative.
    5. Regolare i parametri di impostazione (Figura 4 supplementare). Definisci quattro picchi minimi e 27 rapporti segnale/rumore per le calibrazioni.
    6. Apri il file dei risultati con un software appropriato come Microsoft Excel per un'ulteriore valutazione.

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Risultati

In questo approccio presentato, gli N-glicani sono stati prima rilasciati, marcati con il tag procainamide e purificati da cartucce SPE contenenti cellulosa. Quindi, l'analisi degli N-glicani di IgG, trastuzumab e plasma umano è stata eseguita da un sistema HPLC-HILIC-FLD-MS/MS. I cromatogrammi MS (picco base) e FLD delle strutture N-glicani determinate ottenute da IgG e trastuzumab sono mostrati rispettivamente nella Figura 1. I ...

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Discussione

La profilazione degli N-glicani delle glicoproteine comprende passaggi impegnativi. Sebbene esistano molte metodologie diverse per questo scopo, dovrebbe essere scelto un approccio adatto sia per l'identificazione che per la quantificazione delle strutture N-glicani 14. HILIC-FLD è l'approccio gold standard per la quantificazione degli N-glicani. Tuttavia, l'identificazione di tutti i tipi di N-glicani mediante rilevamento FLD ...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato in parte sostenuto dal Ministero dello Sviluppo della Repubblica di Turchia con il numero di progetto: 2016 K121230. Bekir Salih ringrazia l'Accademia turca delle scienze (TUBA) per il parziale sostegno finanziario.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidCarlo Erba Reagents401413Glacial RS For LC/MS
AcetonitrileMerck1000292500LC-MS LiChrosolv
Agilent 1200 Series HPLC with 1260 Series FLD dedectorAgilent Technologies
Ammoniumm FormateCarlo Erba Reagents419741For LC/MS
Bruker TIMS-TOF (Q-TOF) Mass SpectrometryBruker Daltonics
CelluloseSigma Aldrich310697microcrystalline, powder, 20 μm
Deionized WaterCarlo Erba Reagents412111For LC/MS
Dimethyl sulfoxideSigma Aldrich41639BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (GC)
Empty polypropylene SPE Tube with PE fritsSigma Aldrich5422020 μm porosity,volume 1 mL
Extraction Manifold, 20-positionWatersWAT200607Complete with rack for 13 x 100 mm tubes
Human PlasmaSigma AldrichP9523lyophilized
IGEPAL CA-630Sigma AldrichI8896for molecular biology
IgGSigma AldrichI4506lyophilized powder
Phosphate buffered salineSigma AldrichP4417Tablet
PNGase F enzymePromegaV483A
Procainamide hydrochlorideabcamab120955
Sodium cyanoborohydrideSigma Aldrich156159reagent grade, 95%
Sodium dodecyl sulfateSigma Aldrich71725
trastuzumabRoche Diagnostics
Trifluoroacetic acidSigma Aldrich302031for HPLC, ≥99.9%

Riferimenti

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