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요약

당단백질의 N-글라이칸 프로파일링은 새로운 바이오마커를 발견하고 세포 이벤트에서 글라이칸 기능을 이해하는 데 필수적입니다. 또한 단백질 바이오 의약품의 N-글리칸 분석은 인체 사용에 매우 중요합니다. 이 최신 기사에서는 HILIC-FLD-MS/MS 기술을 사용하여 N-글라이칸 구조를 식별하고 정량화하기 위한 고처리량 전략을 제시했습니다.

초록

당화(glycosylation)는 단백질에서 발견되는 중요한 변형입니다. 당단백질의 N-글라이칸 프로파일링은 새로운 바이오마커 후보를 검출하고 질병의 글라이칸 변화를 결정하는 데 필요합니다. 상업적으로 이용 가능한 대부분의 바이오 제약 단백질은 당단백질입니다. 이러한 약물의 효능은 당화(glycosylation) 패턴의 영향을 받습니다. 따라서 N-글리칸에 대한 심층적인 특성화 방법이 필요합니다. 여기에서는 형광 검출 및 탠덤 질량 분석법(HILIC-FLD-MS/MS)이 장착된 친수성 상호 작용 액체 크로마토그래피를 사용하여 N-글라이칸의 정성 및 정량 분석을 위한 포괄적인 접근 방식을 제시합니다. N-글리칸은 손쉬운 방법으로 당단백질에서 방출되었으며 전략에서 프로카이아미드 형광단 태그로 표지되었습니다. 그 후, 프로카이아미드로 표지된 N-글리칸을 HILIC-FLD-MS/MS 기술로 분석했습니다. 이 접근법에서는 탠덤 질량 분석기 분석으로 N-글리칸 구조를 확인한 반면, 정량 분석에는 형광 검출을 사용했습니다. 검출된 N-글라이칸 피크의 데이터 분석을 위한 응용 프로그램이 연구에 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 다양한 종에서 추출한 모든 당단백질에 적용할 수 있습니다.

서문

당화(glycosylation)는 단백질1에서 관찰되는 중요한 번역 후 변형(post-translational modification)입니다. 여러 효소 과정은 세포 유기체의 당화(glycosylation) 변형을 조절합니다. 글라이칸은 이러한 효소 과정에 의해 단백질에 부착되며, 이러한 변형을 거친 단백질을 당단백질(glycoprotein)이라고 합니다1. 단백질에서는 두 가지 당화(glycosylation) 유형이 일반적으로 관찰됩니다. O-글리코실화(O-glycosylation)는 O-글리칸이 세린(serine) 또는 트레오닌(threonine) 아미노산 잔기의 곁사슬에 부착하는 것입니다. N-글리코실화(N-glycosylation)는 단백질에 있는 아스파라긴 아미노산 잔류물의 곁사슬에 N-글리칸이 부착하는 것입니다.

단백질의 구조, 안정성 및 접힘은 글라이칸 부착2의 영향을 받습니다. 당화(glycosylation) 과정은 단백질의 기능에 극적인 영향을 미치며, 당단백질은 유기체의 많은 세포 기능을 조절합니다 3,4. 예를 들어, 당화(glycosylated protein)가 많으면 단백질 분해(proteolytic degradation)로부터 당단백질(glycoprotein)을 보호합니다5. 또 다른 예는 Tg 수송과 호르몬 합성을 조절하는 갑상선 단백질의 글라이칸입니다 6,7. 세포 사건에서 당단백질의 역할을 설명하기 위해서는 당단백질의 심층적인 규명이 필요합니다8.

당단백질의 N-글라이칸 프로파일은 질병 상황에서 변화합니다 9,10,11,12. 새로운 바이오마커를 발견하고 질병 사례의 효소 활성 변화를 이해하려면 중요한 당단백질 또는 체액에서 파생된 N-글리칸을 프로파일링하는 것이 필요합니다. 반면, 대부분의 단백질 바이오 의약품은 당단백질(glycoprotein)이며, 글리칸 프로파일은 약물 효능에 영향을 미칩니다13. 그러므로, 인간이 사용할 수 있는 적절한 단백질 바이오 의약품을 개발하기 위해서는 N-글라이칸 프로파일링의 허용 가능한 방법을 수행해야 합니다14.

Glycomics는 당화 분자15,16의 글리칸 구조를 식별하고 정량화하는 데 사용되는 새로운 분야입니다. NMR17 및 MS18을 포함하여 당화 종의 글라이칸을 프로파일링하기 위해 많은 방법이 사용되었습니다. 친수성 상호 작용 액체 크로마토그래피-형광 검출 포함(HPLC-HILIC-FLD)은 당단백질에서 유래한 N-글라이칸을 프로파일링하기 위한 황금 표준 방법입니다19. 이 전략을 질량 분석 검출과 결합하면 N-글라이칸 구조를 더 쉽고 신뢰할 수 있게 식별할 수 있습니다. 질량 분석법을 사용한 N-글라이칸 분석에 사용되는 대부분의 형광 태그는 이온화 효율이 낮습니다. 대조적으로, 프로카이 아미드는 N- 글리칸의 이온화 효율을 증가시키며, 이는 N- 글리칸 구조의 효율적인 탠덤 질량 스펙트럼을 얻는 데 사용됩니다20 , 21. 코어 푸코실화22(proc-HexNAc1Fuc1) 및 이등분 유형23(proc-Hex1HexNAc3, proc-Hex1HexNAc3Fuc1)과 같은 N-글라이칸의 구조적 식별을 위해 탠덤 질량 분석법을 통해 이 전략에서 특정 단편을 얻을 수 있습니다.

이 연구는 HILIC-FLD-MS/MS를 사용한 당단백질의 N-글리칸 프로파일링을 위한 손쉬운 프로토콜을 보여줍니다. 제시된 방법에는 (1) 당단백질에서 N-글라이칸 방출, (2) 프로카이아마이드 태그에 의한 N-글라이칸 라벨링, (3) 프로카이아미드 라벨링된 N-글라이칸의 정제, (4) 데이터 분석의 4단계가 포함됩니다.

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프로토콜

참고: 사용된 인간 플라즈마는 상업적으로 이용 가능합니다(재료 표). 인간으로부터 얻은 생물학적 샘플은 더 이상 사용되지 않았습니다.

1. 글라이칸 방출

  1. (glyco-)protein의 변성
    1. 당단백질 표준물질(예: IgG, 단클론 항체)을 탈이온화된 H2O에서 10 μg·μL-1 농도로 준비합니다. 인간 플라즈마의 경우 사용되는 농도는 70 μg·μL-1입니다.
      참고: 모든 고체 단백질이 용해될 때까지 샘플을 와류로 처리해야 합니다. 인간 혈장(동결건조된)은 혈장 샘플의 제조에 사용되었습니다.
    2. 20μL의 당단백질 샘플(200μg)과 동결건조된 인간 혈장(1.4mg)을 채취합니다.
    3. 40μL의 2% SDS(도데실황산나트륨)(w/v)를 추가합니다.
    4. 샘플을 60°C에서 10분 동안 배양하여 (글리코) 단백질을 변성시킵니다.
      참고: 샘플은 배양 중에 온도 혼합기로 500rpm에서 혼합될 수 있습니다. 흔들리는 수조를 대안으로 사용할 수 있습니다.
  2. 글라이칸 방출
    1. 1.1.4단계의 샘플에 20μL의 4% Igepal-CA630을 추가합니다.
    2. 20μL의 5x PBS(인산염 완충액 식염수)를 추가합니다.
    3. PNGase F 효소를 탈이온수에 1 U·μL-1 농도로 준비합니다.
    4. 당단백질 표준물질에 대해 1U의 효소를 추가하고 인간 혈장 샘플에 대해 2U의 효소를 추가합니다.
    5. 샘플을 37°C에서 16시간 동안 배양합니다.
  3. 프로카이나미드 라벨링
    1. 프로카이아미드 염산(DMSO/AA(디메틸설폭사이드/빙초산) 7/3, v/v에서 110mg·mL-1 )을 사용하여 라벨링 용액을 준비합니다.
    2. 시아노보로수소화나트륨(DMSO/AA, 7/3, v/v에서 65mg·mL-1 )을 사용하여 환원성 아민화 용액을 제조합니다.
      주의: 시아노보로하이드리드나트륨은 독성이 매우 강하고 가연성입니다. 눈 가리개를 착용하십시오. 2-피콜린 보란 복합체(DMSO에서 107 mg·mL-1 )를 대안적으로 사용할 수 있습니다.
    3. 이러한 용액을 1:1, v/v의 비율로 혼합하여 라벨링 혼합물을 준비합니다.
    4. 이 라벨링 혼합물 100μL를 1.2.5단계에서 방출된 글라이칸 샘플에 추가합니다.
    5. 샘플을 65°C에서 2시간 동안 배양합니다.

2. 고체상 추출(SPE) 카트리지에 의한 프로카인아미드 라벨링 N- 글라이칸의 정제

  1. 탈이온수에 미정질 셀룰로오스(100mg·mL-1) 용액을 준비합니다.
  2. 미정질 셀룰로오스 300μL를 마이크로 원심분리 튜브에 삽입합니다.
  3. 미정질 셀룰로오스를 1mL의 탈이온화된 H2O로 세척합니다.
  4. 컨디셔닝을 위해 미정질 셀룰로오스를 1mL의 ACN/MQ(아세토니트릴/dH2O), 85/15, v/v로 세척합니다.
    알림: 마이크로 원심분리기는 세척액을 조심스럽게 버리기 위해 1분 동안 사용해야 합니다.
  5. 120μL의 글라이칸 방출 용액을 680μL의 ACN과 혼합하여 적절한 로딩 조건(85/15, v/v, ACN/샘플)을 얻습니다.
  6. 이 혼합물을 미세원심분리기 튜브에서 미정질 셀룰로오스와 혼합합니다.
  7. 써모믹서에서 실온에서 500rpm으로 15분 동안 흔들어 배양합니다.
  8. 슬러리를 SPE 카트리지(1mL 용량)로 옮깁니다.
    알림: 카트리지 패킹에 공기가 들어가지 않도록 하십시오.
  9. 적재 용액은 천천히(1방울/초) 통과하여 폐기합니다.
    알림: SPE 시스템이 진공 펌프에 연결되어 있는지 확인하십시오. 용제는 중력에 따라 흐를 수 있습니다. 필요한 경우 진공 펌프를 통해 진공을 적용합니다. 적용된 진공 압력은 액체를 천천히 아래로 이동시키기 위해 적절하게 조정되어야 합니다.
  10. 1mL의 ACN/MQ/TFA(아세토니트릴/dH2O/트리플루오로아세트산) 용액(85/14/1, v/v/v)을 두 번 통과시켜 샘플을 세척합니다.
  11. 1mL의 ACN/MQ 혼합물(85/15, v/v)을 두 번 통과시켜 샘플을 세척합니다.
  12. 프로카이아마이드로 표시된 N-글라이칸을 물 0.75mL로 용출합니다.
  13. 용출 용액을 농축기로 밤새 건조시킵니다.
    알림: 건조를 위해 45°C의 농축기 온도를 사용하십시오.
  14. 건조된 시료를 100μL의 ACN/MQ(75/25, v/v) 혼합물에 용해시키고 이 용액을 삽입물을 포함한 바이알로 옮깁니다.
    참고: 재용해된 샘플은 20초 동안 와류화되어야 합니다.

3. HILIC-FLD-MS/MS 분석

  1. Tee(T) 어댑터를 HILIC 컬럼에 삽입하여 흐름을 두 개의 동일한 부피로 분리합니다. 둘 중 하나는 FLD 검출기에 연결하고 다른 하나는 MS 검출기에 연결합니다.
    참고: 흐름선은 길이가 같아야 합니다.
  2. 보조 그림 1에 표시된 대로 프로카이아미드 표지 N-글라이칸의 HILIC 분리를 위한 그래디언트 프로그램을 조정합니다. 이동상 A: 50mM 포름산암모늄(pH: 4.4 및 이동상 B: 100% ACN)을 사용합니다.
    참고: 그래디언트 프로그램은 샘플의 글라이칸 이질성에 따라 더욱 최적화될 수 있습니다.
  3. Sampler 버튼을 클릭하고 주입량을 10μL로 설정합니다.
  4. Column Comp를 클릭하고 컬럼 온도를 60°C로 조정합니다.
  5. FLD를 클릭하고 FLD 여기 파장과 방출 파장을 각각 310nm와 370nm로 조정합니다.
  6. MS 소스, 튜닝 및 MS/MS 매개변수를 보충 그림 2에 표시된 대로 조정합니다.
    참고: MS 및 MS/MS 매개변수는 분석에 사용된 질량 분석법에 따라 변경될 수 있습니다.

4. 데이터 분석

  1. 프로카인아마이드 표지된 N-글라이칸의 식별
    1. 데이터베이스 검색에 적합한 형식(예: .mgf, .xml)으로 MS/MS 데이터를 내보냅니다.
    2. N-글라이칸 식별을 위해 데이터베이스 검색 도구에 삽입합니다.
    3. 소프트웨어에 나열된 시료 이름을 선택하고 Glycan Search(글라이칸 검색 ) 버튼을 클릭하여 주어진 매개변수와 함께 Carbbank 데이터베이스를 사용하여 프로카이아미드 표지된 N-글라이칸을 식별합니다(보충 그림 3).
    4. 원시 데이터에 대한 데이터 분석 소프트웨어에서 크로마토그램 편집 버튼을 열고 모든 MSn을 필터링하여 추출된 이온 크로마토그램 유형을 선택합니다.
    5. 코어-푸코실화된 단편 proc-N1F1 (m/z 587.3+) 및 이등분된 단편 proc-H1N3 (m/z 1009.5+) 및 proc-H1N3F1 (m/z 1155.5+)에 대한 특정 질량을 추가합니다.
    6. 코어-푸코실화(core-fucosylated) 및 이등분된 N-글라이칸 구조 단편을 포함하는 전구체를 측정합니다.
    7. 식별된 N-글라이칸 구조를 소프트웨어로 내보냅니다(보충 표 1-3).
    8. 코어-푸코실화(core-fucosylated) 및 이등분된 N-글라이칸 구조(core-fucosylated and bisected N-glycan structure)를 측정하기 위해 수동으로 검출된 전구체를 확인합니다.
  2. 오픈 소스 소프트웨어에 의한 프로카이아미드 표지 N-글라이칸의 정량화24
    1. 크로마토그램에서 FLD 크로마토그램을 선택하고 소프트웨어에서 Method를 클릭합니다. 크로마토그램을 .xy 파일 형식으로 내보내는 Method를 엽니다.
    2. 내보낸 크로마토그램의 .xy 파일 형식을 .txt 파일로 변환합니다.
    3. 정량 분석 소프트웨어를 엽니다.
      참고: 연구에 사용된 소프트웨어는 Github 소스(https://github.com/Tarskin/HappyTools)에서 다운로드할 수 있습니다.
    4. 개발자가 제시한 프로그램의 지침과 자습서를 따르십시오.
      참고: 배치 프로세스를 사용하여 상대 영역을 내보내는 것이 좋습니다.
    5. 설정 매개변수를 조정합니다(보충 그림 4). 캘리브레이션을 위해 4개의 최소 피크와 27개의 신호/잡음 비율을 정의합니다.
    6. 추가 평가를 위해 Microsoft Excel과 같은 적절한 소프트웨어로 결과 파일을 엽니다.

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결과

이 제시된 접근법에서 N-글리칸은 먼저 방출되고, 프로카이아미드 태그로 표지되고, 셀룰로오스 함유 SPE 카트리지로 정제되었습니다. 그런 다음 HPLC-HILIC-FLD-MS/MS 시스템으로 IgG, 트라스투주맙 및 인간 혈장에 대한 N-글라이칸 분석을 수행했습니다. IgG 및 트라스투주맙에서 얻은 결정된 N-글라이칸 구조의 MS(염기 피크) 및 FLD 크로마토그램은 각각

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토론

당단백질의 N-글라이칸 프로파일링에는 까다로운 단계가 포함됩니다. 이 목적을 위한 다양한 방법론이 있지만 N-글라이칸 구조의 식별 및 정량화를 위해 적절한 접근법을 선택해야 합니다14. HILIC-FLD는 N-글라이칸의 정량화를 위한 최적 접근법입니다. 그러나 FLD 검출에 의한 모든 N-글리칸 유형의 식별은 달성되지 않습니다. 따?...

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공개

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 말

이 작업은 프로젝트 번호 : 2016 K121230로 터키 개발부의 일부 지원을 받았습니다. Bekir Salih는 부분적인 재정 지원을 해준 터키 과학 아카데미(TUBA)에 감사를 표합니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidCarlo Erba Reagents401413Glacial RS For LC/MS
AcetonitrileMerck1000292500LC-MS LiChrosolv
Agilent 1200 Series HPLC with 1260 Series FLD dedectorAgilent Technologies
Ammoniumm FormateCarlo Erba Reagents419741For LC/MS
Bruker TIMS-TOF (Q-TOF) Mass SpectrometryBruker Daltonics
CelluloseSigma Aldrich310697microcrystalline, powder, 20 μm
Deionized WaterCarlo Erba Reagents412111For LC/MS
Dimethyl sulfoxideSigma Aldrich41639BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (GC)
Empty polypropylene SPE Tube with PE fritsSigma Aldrich5422020 μm porosity,volume 1 mL
Extraction Manifold, 20-positionWatersWAT200607Complete with rack for 13 x 100 mm tubes
Human PlasmaSigma AldrichP9523lyophilized
IGEPAL CA-630Sigma AldrichI8896for molecular biology
IgGSigma AldrichI4506lyophilized powder
Phosphate buffered salineSigma AldrichP4417Tablet
PNGase F enzymePromegaV483A
Procainamide hydrochlorideabcamab120955
Sodium cyanoborohydrideSigma Aldrich156159reagent grade, 95%
Sodium dodecyl sulfateSigma Aldrich71725
trastuzumabRoche Diagnostics
Trifluoroacetic acidSigma Aldrich302031for HPLC, ≥99.9%

참고문헌

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