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要約

糖タンパク質のN型糖鎖プロファイリングは、新規バイオマーカーの発見や細胞イベントにおける糖鎖機能の理解に不可欠です。さらに、タンパク質バイオ医薬品のN型糖鎖分析は、ヒトが使用するために非常に重要です。今回の記事では、HILIC-FLD-MS/MS 技術を使用して N 型糖鎖構造を同定および定量するためのハイスループット戦略について紹介しました。

要約

グリコシル化は、タンパク質に見られる重要な修飾です。糖タンパク質の N型糖鎖プロファイリングは、新規バイオマーカー候補を検出し、疾患における糖鎖変化を決定するために必要です。市販されているバイオ医薬品タンパク質のほとんどは糖タンパク質です。これらの薬剤の有効性は、グリコシル化パターンの影響を受けます。そのため、 N型糖鎖の詳細な特性評価法が必要です。ここでは、蛍光検出とタンデム質量分析(HILIC-FLD-MS/MS)を備えた親水性相互作用液体クロマトグラフィーを使用した N型糖鎖の定性および定量分析のための包括的なアプローチを紹介します。N型糖鎖は、簡単な方法で糖タンパク質から遊離され、この戦略ではプロカインアミドフルオロフォアタグで標識されました。続いて、プロカインアミド標識 N型糖鎖をHILIC-FLD-MS/MS法で分析しました。 このアプローチでは、タンデム質量分析により N型糖鎖の構造を確認し、定量分析では蛍光検出を用いた。この研究では、検出された N 型糖鎖のピークのデータ解析の応用について説明しています。このプロトコールは、さまざまな種から抽出された任意の糖タンパク質に適用できます。

概要

グリコシル化は、タンパク質1で観察される重要な翻訳後修飾です。複数の酵素プロセスが細胞生物のグリコシル化修飾を調節します。糖鎖はこれらの酵素プロセスによってタンパク質に結合し、この修飾を受けたタンパク質は糖タンパク質と呼ばれます1。タンパク質では、2種類のグリコシル化が一般的に観察されます。 O-グリコシル化とは、 O-グリカンがセリンアミノ酸残基またはスレオニンアミノ酸残基の側鎖に結合することです。 N-グリコシル化とは、タンパク質中のアスパラギンアミノ酸残基の側鎖に N-グリカンが付着することです。

タンパク質の構造、安定性、およびフォールディングは、糖鎖付着の影響を受けます2。グリコシル化プロセスはタンパク質の機能に劇的に影響を及ぼし、糖タンパク質は生物の多くの細胞機能を調節します3,4。例えば、高度にグリコシル化されたタンパク質は、その糖タンパク質をタンパク質分解から保護する5。別の例は、Tg輸送とホルモン合成を調節する甲状腺タンパク質の糖鎖です6,7。細胞イベントにおけるそれらの役割を説明するためには、糖タンパク質の詳細な特性評価が必要である8。

糖タンパク質のN型糖鎖プロファイルは、疾患状況で変化します9,10,11,12。重要な糖タンパク質や体液に由来するN型糖鎖のプロファイリングは、新規バイオマーカーを発見し、疾患症例における酵素活性の変化を理解するために必要です。一方、タンパク質バイオ医薬品の多くは糖タンパク質であり、その糖鎖プロファイルは薬効に影響を与える13。したがって、ヒト使用のための適切なタンパク質バイオ医薬品の開発には、N型糖鎖プロファイリングの許容可能な方法を実施する必要があります14。

グライコミクスは、グリコシル化分子の糖鎖構造を同定し定量するために使用される新しい学問分野です15,16。グリコシル化分子種の糖鎖のプロファイリングには、NMR17やMS18など、多くの方法が利用されています。Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography-with Fluorescence Detection(HPLC-HILIC-FLD)は、糖タンパク質に由来するN型糖鎖をプロファイリングするためのゴールドスタンダードの方法です19。この戦略を質量分析検出と組み合わせると、N型糖鎖構造の同定がより容易で信頼性が向上します。質量分析によるN型糖鎖分析で使用される蛍光タグのほとんどは、イオン化効率が低くなります。対照的に、プロカインアミドはN型糖鎖のイオン化効率を高め、N型糖鎖構造の効率的なタンデム質量スペクトルを得るために使用されます20,21。この戦略では、コアフコシル化22 (proc-HexNAc1Fuc1) や二等分型23 (proc-Hex1HexNAc3, proc-Hex1HexNAc3Fuc1) などの N 型糖鎖の構造同定のために、タンデム質量分析により特定のフラグメントを取得できます。

この研究は、HILIC-FLD-MS/MS による糖タンパク質の N 型糖鎖プロファイリングの簡便なプロトコールを示しています。提示された方法は、(1)糖タンパク質からの N型糖鎖の遊離、(2)プロカインアミドタグによる N型糖鎖の標識、(3)プロカインアミド標識 N型糖鎖の精製、(4)データ解析の4つのステップからなる。

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プロトコル

注:使用されるヒト血漿は市販されています(材料の表)。ヒトから得られたそれ以上の生物学的サンプルは使用されなかった。

1. 糖鎖の放出

  1. (糖)タンパク質の変性
    1. 脱イオンH2O中に10μg·μL-1の濃度で糖タンパク質標準物質(例えば、モノクローナル抗体であるIgG)を調製します。ヒト血漿の場合、使用される濃度は70μg·μL-1です。
      注:すべての固体タンパク質が溶解するまで、サンプルをボルテックスする必要があります。血漿サンプルの調製には、ヒト血漿(凍結乾燥)を使用しました。
    2. 20 μL の糖タンパク質サンプル (200 μg) と凍結乾燥したヒト血漿 (1.4 mg) を採取します。
    3. 2% SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)(w / v)40μLを加えます。
    4. サンプルを60°Cで10分間インキュベートし、(糖)タンパク質を変性させます。
      注:サンプルは、インキュベーション中にサーモミキサーで500rpmで混合できます。振とうウォーターバスを代わりに使用できます。
  2. 糖鎖の放出
    1. ステップ1.1.4のサンプルに20μLの4%Igepal-CA630を加えます。
    2. 20 μL の 5x PBS (リン酸緩衝生理食塩水) を加えます。
    3. 脱イオン水中で1 U·μL-1 の濃度でPNGase F酵素を調製します。
    4. 糖タンパク質標準試料には酵素1 U、ヒト血漿サンプルには酵素2 Uを添加します。
    5. サンプルを37°Cで16時間インキュベートします。
  3. プロカインアミドのラベリング
    1. プロカインアミド塩酸(DMSO/AA(ジメチルスルホキシド/氷酢酸)7/3、v / v)中の110 mg·mL-1 )を使用して標識液を調製します。
    2. シアノ水素化ホウ素ナトリウム(65 mg·mL-1 in DMSO/AA, 7/3, v/v)を用いた還元的アミノ化溶液を調製します。
      注意:シアノ水素化ホウ素ナトリウムは非常に有毒で可燃性です。アイシールドを着用してください。2-ピコリンボラン複合体(DMSO中の107mg・mL-1 )を代わりに使用できます。
    3. これらの溶液を1:1、v / vの比率で混合して、標識混合物を調製します。
    4. この標識混合物100 μLをステップ1.2.5の糖鎖遊離サンプルに加えます。
    5. サンプルを65°Cで2時間インキュベートします。

2. 固相抽出(SPE)カートリッジによるプロカインアミド標識 N- 糖鎖の精製

  1. 微結晶性セルロース(100 mg・mL-1)を脱イオン水に溶液を調製します。
  2. 300μLの微結晶性セルロースを取り、微量遠心チューブに挿入します。
  3. 微結晶性セルロースを1mLの脱イオンH2Oで洗浄します。
  4. 微結晶性セルロースを1 mLのACN/MQ(アセトニトリル/dH2O)、85/15、v/vで洗浄してコンディショニングします。
    注:微量遠心分離機は、洗浄液を慎重に廃棄するために1分間使用する必要があります。
  5. 120 μL の糖鎖放出液を 680 μL の ACN と混合して、適切なローディング条件 (85/15、v/v、ACN/サンプル) を得てください。
  6. この混合物を微量遠心チューブ内で微結晶性セルロースと混合します。
  7. サーモミキサーで室温で500rpmで15分間振とうしてインキュベートします。
  8. スラリーをSPEカートリッジ(容量容量1 mL)に移します。
    注意: カートリッジパッキンに空気が入らないようにしてください。
  9. ローディング溶液をゆっくりと(1滴/秒)通過させて廃棄します。
    注:SPEシステムが真空ポンプに接続されていることを確認してください。溶剤は重力で流れることがあります。必要に応じて、真空ポンプで真空を適用します。加えられた真空圧は、液体をゆっくりと移動させるために適切に調整する必要があります。
  10. 1 mLのACN/MQ/TFA(アセトニトリル/dH2O/トリフルオロ酢酸)溶液(85/14/1、v/v/v)を2回通過させてサンプルを洗浄します。
  11. 1 mLのACN/MQ混合物(85/15、v / v)を2回通過させてサンプルを洗浄します。
  12. プロカインアミド標識 N型糖鎖を0.75 mLの水で溶出します。
  13. 溶出溶液を濃縮器で一晩乾燥させます。
    注意: 乾燥には45°Cの濃縮器温度を使用してください。
  14. 乾燥したサンプルを100 μLのACN/MQ(75/25、v/v)の混合物に溶解し、この溶液をインサートを含むバイアルに移します。
    注:再溶解したサンプルは、20秒間ボルテックスする必要があります。

3. HILIC-FLD-MS/MS分析

  1. HILICカラムにTee(T)アダプターを挿入して、フローを2つの等しいボリュームに分離します。両方の一方をFLD検出器に接続し、もう一方をMS検出器に接続します。
    注: フロー ラインは同じ長さである必要があります。
  2. 補足図 1 に示すように、プロカインアミド標識 N 型糖鎖の HILIC 分離のグラジエントプログラムを調整します。移動相 A:50 mM ギ酸アンモニウム(pH:4.4、移動相 B:100% ACN)を使用します。
    注:グラジエントプログラムは、サンプルの糖鎖の不均一性に応じてさらに最適化できます。
  3. [Sampler]ボタンをクリックし、注入量を 10 μL に設定します。
  4. [Column Comp]をクリックし、カラム温度を 60 °C に調整します。
  5. FLDをクリックし、FLDの励起波長と発光波長をそれぞれ310 nmと370 nmに調整します。
  6. MS ソース、チューニング、および MS/MS パラメーターを 補足図 2 に示すように調整します。
    注:MSおよびMS/MSパラメータは、分析に使用する質量分析に応じて変更される場合があります。

4. データ分析

  1. プロカインアミド標識 N型糖鎖の同定
    1. MS/MS データをデータベース検索に適した形式 (.mgf、.xml など) でエクスポートします。
    2. それらをデータベース検索ツールに挿入して、 N-グリカンを同定します。
    3. ソフトウェアにリストされているサンプル名を選択し、[ Glycan Search ]ボタンをクリックして、所定のパラメーターを持つCarbbankデータベースを使用して、プロカインアミドで標識 されたN-糖鎖を同定します(補足図3)。
    4. 生データのデータ解析ソフトウェアでクロマトグラムの編集ボタンを開き、すべてのMSnでフィルタリングして抽出されたイオンクロマトグラムタイプを選択します。
    5. コアフコース化フラグメントproc-N1F1(m/z 587.3+)および二等分フラグメントproc-H1N3(m/z 1009.5+)およびproc-H1N3F1(m/z 1155.5+)に特異的質量を添加します。
    6. コアフコース化および二分された N型糖鎖構造のフラグメントを含む前駆体を同定します。
    7. 同定した N型糖鎖構造をソフトウェアでエクスポートします(補足表1-3)。
    8. 手動で検出したプリカーサーをチェックして、コアフコース化および二分された N 型糖鎖構造を決定します。
  2. オープンソースソフトウェアによるプロカインアミド標識 N型糖鎖の定量24
    1. クロマトグラムでFLDクロマトグラムを選択し、ソフトウェアでメソッドをクリックします。クロマトグラムを .xy ファイル形式でエクスポートする方法を開きます。
    2. エクスポートされたクロマトグラムの .xy ファイル形式を .txt ファイルに変換します。
    3. 定量分析ソフトウェアを開きます。
      注:この調査で使用したソフトウェアは、Githubのソース(https://github.com/Tarskin/HappyTools)からダウンロードできます。
    4. 開発者が提示したプログラムの指示とチュートリアルに従ってください。
      注:バッチプロセスを使用して相対領域をエクスポートすることをお勧めします。
    5. 設定パラメータを調整します(補足図4)。キャリブレーションのために、4つの最小ピークと27の信号/ノイズ比を定義します。
    6. Microsoft Excelなどの適切なソフトウェアで結果ファイルを開き、さらに評価します。

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結果

この提示されたアプローチでは、まず N 型糖鎖を遊離し、プロカインアミドタグで標識し、セルロース含有 SPE カートリッジで精製しました。次に、IgG、トラスツズマブ、およびヒト血漿のN型糖鎖分析をHPLC-HILIC-FLD-MS/MSシステムにより行いました。図 1 に、IgG およびトラスツズマブから得られた測定された N 型糖鎖構造の MS(ベースピーク)および ...

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ディスカッション

糖タンパク質のN型糖鎖プロファイリングには、困難なステップが含まれます。この目的にはさまざまな方法論がありますが、N型糖鎖構造の同定と定量の両方に適したアプローチを選択する必要があります14。HILIC-FLDは、N型糖鎖の定量におけるゴールドスタンダードのアプローチです。しかし、FLD検出によるすべてのN型糖...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この作業は、トルコ共和国開発省の支援の一部を受けており、プロジェクト番号は2016 K121230です。Bekir Salih氏は、トルコ科学アカデミー(TUBA)が部分的な財政支援を行ったことに感謝しています。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidCarlo Erba Reagents401413Glacial RS For LC/MS
AcetonitrileMerck1000292500LC-MS LiChrosolv
Agilent 1200 Series HPLC with 1260 Series FLD dedectorAgilent Technologies
Ammoniumm FormateCarlo Erba Reagents419741For LC/MS
Bruker TIMS-TOF (Q-TOF) Mass SpectrometryBruker Daltonics
CelluloseSigma Aldrich310697microcrystalline, powder, 20 μm
Deionized WaterCarlo Erba Reagents412111For LC/MS
Dimethyl sulfoxideSigma Aldrich41639BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (GC)
Empty polypropylene SPE Tube with PE fritsSigma Aldrich5422020 μm porosity,volume 1 mL
Extraction Manifold, 20-positionWatersWAT200607Complete with rack for 13 x 100 mm tubes
Human PlasmaSigma AldrichP9523lyophilized
IGEPAL CA-630Sigma AldrichI8896for molecular biology
IgGSigma AldrichI4506lyophilized powder
Phosphate buffered salineSigma AldrichP4417Tablet
PNGase F enzymePromegaV483A
Procainamide hydrochlorideabcamab120955
Sodium cyanoborohydrideSigma Aldrich156159reagent grade, 95%
Sodium dodecyl sulfateSigma Aldrich71725
trastuzumabRoche Diagnostics
Trifluoroacetic acidSigma Aldrich302031for HPLC, ≥99.9%

参考文献

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