N-Glykan-Profilierung von Glykoproteinen durch hydrophile Interaktionsflüssigkeitschromatographie mit Fluoreszenz und massenspektrometrischer Detektion

Zusammenfassung

Die Erstellung von N-Glykan-Profilen von Glykoproteinen ist unerlässlich, um neue Biomarker zu entdecken und die Glykanfunktionen bei zellulären Ereignissen zu verstehen. Darüber hinaus ist die N-Glykan-Analyse von Protein-Biopharmazeutika für den menschlichen Gebrauch von großer Bedeutung. In diesem Artikel wurde eine Hochdurchsatzstrategie zur Identifizierung und Quantifizierung von N-Glykanstrukturen unter Verwendung der HILIC-FLD-MS/MS-Technik vorgestellt.

Zusammenfassung

Die Glykosylierung ist eine wichtige Modifikation, die in Proteinen vorkommt. Die Erstellung von N-Glykan-Profilen von Glykoproteinen ist erforderlich, um neue Biomarkerkandidaten zu erkennen und Glykanveränderungen bei Krankheiten zu bestimmen. Die meisten kommerziell erhältlichen biopharmazeutischen Proteine sind Glykoproteine. Die Wirksamkeit dieser Medikamente wird durch Glykosylierungsmuster beeinflusst. Daher ist eine tiefgreifende Charakterisierungsmethode für die N-Glykane notwendig. In dieser Arbeit stellen wir einen umfassenden Ansatz für die qualitative und quantitative Analyse von N-Glykanen mittels hydrophiler Interaktionsflüssigkeitschromatographie vor, die mit Fluoreszenzdetektion und Tandem-Massenspektrometrie (HILIC-FLD-MS/MS) ausgestattet ist. N-Glykane wurden mit einer einfachen Methode aus Glykoproteinen freigesetzt und in der Strategie mit einem Procainamid-Fluorophor-Tag markiert. Anschließend wurden die mit Procainamid markierten N-Glykane mittels einer HILIC-FLD-MS/MS-Technik analysiert. Bei diesem Ansatz wurden die N-Glykan-Strukturen durch die tandem-massenspektrometrische Analyse bestätigt, während die Fluoreszenzdetektion für die quantitative Analyse verwendet wurde. Eine Anwendung zur Datenanalyse der detektierten N-Glykan-Peaks wird in der Studie beschrieben. Dieses Protokoll kann auf jedes Glykoprotein angewendet werden, das aus verschiedenen Spezies extrahiert wird.

Einleitung

Die Glykosylierung ist eine wichtige posttranslationale Modifikation, die in Proteinen^{beobachtet wird 1}. Mehrere enzymatische Prozesse regulieren die Modifikation der Glykosylierung in zellulären Organismen. Glykane werden durch diese enzymatischen Prozesse an die Proteine gebunden, und die Proteine, die dieser Modifikation unterzogen werden, werden Glykoproteine¹ genannt. In Proteinen werden häufig zwei Glykosylierungstypen beobachtet. Unter der O-Glykosylierung versteht man die Bindung von O-Glykanen an die Seitenkette von Serin- oder Threonin-Aminosäureresten. Die N-Glykosylierung ist die Bindung von N-Glykanen an die Seitenkette von Asparagin-Aminosäureresten in einem Protein.

Die Struktur, Stabilität und Faltung der Proteine wird durch Glykanbindungen beeinflusst². Der Glykosylierungsprozess beeinflusst die Funktionen der Proteine dramatisch, und Glykoproteine regulieren viele zelluläre Funktionen in Organismen ^3,4. So schützen beispielsweise stark glykosylierte Proteine ihre Glykoproteine vor proteolytischem Abbau⁵. Ein weiteres Beispiel sind Glykane von Schilddrüsenproteinen, die den Tg-Transport und die Hormonsynthese regulieren ^6,7. Um ihre Rolle bei zellulären Ereignissen zu erklären, ist eine eingehende Charakterisierung von Glykoproteinen erforderlich⁸.

Die N-Glykanprofile der Glykoproteine ändern sich in Krankheitssituationen 9,10,11,12. Die Profilierung von N-Glykanen, die aus wichtigen Glykoproteinen oder Körperflüssigkeiten gewonnen werden, ist erforderlich, um neue Biomarker zu entdecken und die Veränderungen der enzymatischen Aktivität bei Krankheitsfällen zu verstehen. Auf der anderen Seite sind die meisten Protein-Biopharmazeutika Glykoproteine, und ihre Glykanprofile beeinflussen die Wirksamkeit von Arzneimitteln¹³. Daher muss bei der Entwicklung geeigneter Protein-Biopharmazeutika für den menschlichen Gebrauch eine akzeptable Methode zur Erstellung von N-Glykan-Profilen durchgeführt werden¹⁴.

Die Glykomik ist eine aufstrebende Disziplin, die zur Identifizierung und Quantifizierung von Glykanstrukturen glykosylierter Moleküle verwendet wird^15,16. Viele Methoden wurden verwendet, um die Glykane von glykosylierten Spezies zu profilieren, einschließlich NMR¹⁷ und MS¹⁸. Hydrophile Wechselwirkung Flüssigchromatographie mit Fluoreszenzdetektion (HPLC-HILIC-FLD) ist die Goldstandardmethode zur Profilierung von N-Glykanen, die aus Glykoproteinen^{gewonnen werden 19}. Wenn diese Strategie mit einem massenspektrometrischen Nachweis kombiniert wird, könnte die Identifizierung von N-Glykan-Strukturen einfacher und zuverlässiger sein. Die meisten Fluoreszenz-Tags, die in der N-Glykan-Analyse mit Massenspektrometrie verwendet werden, weisen eine geringe Ionisationseffizienz auf. Im Gegensatz dazu erhöht Procainamid die Ionisationseffizienz von N-Glykanen, was zur Erzielung effizienter Tandem-Massenspektren von N-Glykanstrukturen verwendet wird^20,21. Spezifische Fragmente können aus dieser Strategie mittels Tandem-Massenspektrometrie zur strukturellen Identifizierung von N-Glykanen gewonnen werden, wie z.B. Kernfucosylierte²² (proc-HexNAc1Fuc1) und halbierende Typen²³ (proc-Hex1HexNAc3, proc-Hex1HexNAc3Fuc1).

Diese Studie demonstriert ein einfaches Protokoll für das N-Glykan-Profiling von Glykoproteinen mit HILIC-FLD-MS/MS. Die vorgestellte Methode umfasst vier Schritte: (1) Freisetzung von N-Glykanen aus Glykoproteinen, (2) Markierung von N-Glykanen durch ein Procainamid-Tag, (3) Reinigung der Procainamid-markierten N-Glykane und (4) Datenanalyse.

Protokoll

HINWEIS: Das verwendete humane Plasma ist im Handel erhältlich (Materialtabelle). Es wurden keine weiteren biologischen Proben vom Menschen verwendet.

1. Freisetzung von Glykanen

1. Denaturierung von (Glyko-)Proteinen
   1. Bereiten Sie die Glykoproteinstandards (z. B. IgG, einen monoklonalen Antikörper) in einer Konzentration von 10 μgημL-1 in deionisiertem H₂O vor. Für menschliches Plasma beträgt die verwendete Konzentration 70 μgμL-1.
      HINWEIS: Die Proben sollten so lange vortexiert werden, bis sich alle festen Proteine aufgelöst haben. Für die Aufbereitung der Plasmaproben wurde humanes Plasma (lyophilisiert) verwendet.
   2. Entnahme von 20 μl Glykoproteinproben (200 μg) und lyophilisiertem humanem Plasma (1,4 mg).
   3. 40 μl 2 % SDS (Natriumdodecylsulfat) (w/v) zugeben.
   4. Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 60 °C, um die (Glyko-)Proteine zu denaturieren.
      HINWEIS: Die Proben können während der Inkubation mit einem Thermomixer bei 500 U/min gemischt werden. Alternativ kann auch ein Schüttelwasserbad verwendet werden.
2. Freisetzung von Glykanen
   1. 20 μl 4 % Igepal-CA630 werden zu den Proben aus Schritt 1.1.4 gegeben.
   2. Fügen Sie 20 μL 5x PBS (Phosphatpuffer-Kochsalzlösung) hinzu.
   3. Bereiten Sie das Enzym PNGase F in einer Konzentration von 1 ^μl-1 in entionisiertem Wasser vor.
   4. 1 U Enzym für Glykoproteinstandards und 2 U Enzym für menschliche Plasmaproben zugeben.
   5. Die Proben werden 16 Stunden lang bei 37 °C inkubiert.
3. Procainamid-Markierung
   1. Bereiten Sie die Markierungslösung mit Procainamid-Salzsäure (110 mg·^mL-1 in DMSO/AA (Dimethylsulfoxid / Eisessig) 7/3, v/v) vor.
   2. Bereiten Sie eine reduktive Aminierungslösung mit Natriumcyanoborohydrid (65 mg·^mL-1 in DMSO/AA, 7/3, v/v) her.
      ACHTUNG: Natriumcyanoborohydrid ist sehr giftig und brennbar. Tragen Sie einen Augenschutz. Alternativ kann auch ein ^{2-Pikolin-Boran-Komplex} (107 mg·mL-1 in DMSO) verwendet werden.
   3. Mischen Sie diese Lösungen im Verhältnis 1:1, v/v, um die Markierungsmischung herzustellen.
   4. 100 μl dieser Markierungsmischung werden der aus Schritt 1.2.5 freigesetzten Glykanprobe zugegeben.
   5. Die Proben werden 2 h lang bei 65 °C inkubiert.

2. Aufreinigung von Procainamid-markierten N-Glykanen durch Festphasenextraktion (SPE)-Kartusche

1. Eine Lösung aus mikrokristalliner Cellulose (100 ^mgμl-1) in entionisiertem Wasser herstellen.
2. Nehmen Sie 300 μl mikrokristalline Cellulose und geben Sie sie in die Mikrozentrifugenröhrchen.
3. Waschen Sie die mikrokristalline Cellulose mit 1 mL deionisiertem H₂O.
4. Die mikrokristalline Cellulose zur Konditionierung mit 1 mL ACN/MQ (Acetonitril/dH₂O), 85/15, v/v waschen.
   HINWEIS: Die Mikrozentrifuge sollte 1 Minute lang verwendet werden, um Waschlösungen vorsichtig zu entsorgen.
5. Nehmen Sie 120 μl Glykanfreisetzungslösung und mischen Sie sie mit 680 μl ACN, um geeignete Belastungsbedingungen (85/15, v/v, ACN/Probe) zu erhalten.
6. Mischen Sie diese Mischung mit mikrokristalliner Cellulose in den Mikrozentrifugenröhrchen.
7. Inkubieren Sie es bei Raumtemperatur in einem Thermomixer, indem Sie es 15 Minuten lang bei 500 U/min schütteln.
8. Übertragen Sie die Aufschlämmung in eine SPE-Kartusche (1 ml Volumenkapazität).
   HINWEIS: Lassen Sie keine Luft in die Patronenverpackung eindringen.
9. Entsorgen Sie die Ladelösungen durch langsames Passieren (1 Tropfen/Sekunde).
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das SPE-System an die Vakuumpumpe angeschlossen ist. Lösungsmittel können mit der Schwerkraft fließen. Bei Bedarf Vakuum über eine Vakuumpumpe anlegen. Der angelegte Vakuumdruck sollte entsprechend angepasst werden, um Flüssigkeiten langsam nach unten zu befördern.
10. Waschen Sie die Probe, indem Sie zweimal 1 ml ACN/MQ/TFA-Lösung (Acetonitril/dH₂O/Trifluoressigsäure) (85/14/1, v/v/v) passieren.
11. Waschen Sie die Probe, indem Sie zweimal 1 ml ACN/MQ-Gemisch (85/15, v/v) passieren.
12. Eluieren Sie die mit Procainamid markierten N-Glykane mit 0,75 ml Wasser.
13. Trocknen Sie die Elutionslösung über Nacht mit einem Konzentrator.
    HINWEIS: Verwenden Sie zum Trocknen eine Konzentratortemperatur von 45 °C.
14. Die getrockneten Proben werden in einer Mischung aus 100 μl ACN/MQ (75/25, v/v) aufgelöst und diese Lösung in die Fläschchen, einschließlich eines Einsatzes, überführt.
    HINWEIS: Die wiedergelösten Proben sollten 20 Sekunden lang vortexiert werden.

3. HILIC-FLD-MS/MS-Analyse

1. Setzen Sie T-Adapter (T) in die HILIC-Säule ein, um den Durchfluss in die beiden gleichen Volumina zu trennen. Verbinden Sie einen von beiden mit dem FLD-Detektor, den anderen mit dem MS-Detektor.
   HINWEIS: Die Fließlinien müssen die gleichen Längen haben.
2. Passen Sie ein Gradientenprogramm für HILIC-Trennungen von Procainamid-markierten N-Glykanen an, wie in der ergänzenden Abbildung 1 gezeigt. Verwenden Sie Mobile Phase A: 50 mM Ammoniumformiat (pH: 4,4 und Mobile Phase B: 100 % ACN).
   HINWEIS: Das Gradientenprogramm kann je nach Glykanheterogenität der Proben weiter optimiert werden.
3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Sampler und stellen Sie das Injektionsvolumen auf 10 μl ein.
4. Klicken Sie auf die Spaltenkomposition und stellen Sie die Säulentemperatur auf 60 °C ein.
5. Klicken Sie auf FLD und stellen Sie die Anregungs- und Emissionswellenlängen der FLD auf 310 nm bzw. 370 nm ein.
6. Passen Sie die Parameter MS-Quelle, Abstimmung und MS/MS an, wie in der ergänzenden Abbildung 2 gezeigt.
   HINWEIS: Die MS- und MS/MS-Parameter können je nach der bei der Analyse verwendeten Massenspektrometrie geändert werden.

4. Datenanalyse

1. Identifizierung von Procainamid-markierten N-Glykanen
   1. Exportieren Sie MS/MS-Daten in einem geeigneten Format für die Datenbanksuche (z. B. .mgf, .xml).
   2. Fügen Sie sie in ein Datenbanksuchwerkzeug zur Identifizierung von N-Glykanen ein.
   3. Wählen Sie den in der Software aufgeführten Probennamen aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Glykansuche , um die mit Procainamid markierten N-Glykane unter Verwendung der Carbbank-Datenbank mit den angegebenen Parametern zu identifizieren (Ergänzende Abbildung 3).
   4. Öffnen Sie die Schaltfläche "Chromatogramme bearbeiten" in der Datenanalysesoftware für Rohdaten und wählen Sie den Typ des extrahierten Ionenchromatogramms aus, indem Sie in allen MSn filtern.
   5. Fügen Sie spezifische Massen für das kernfucosylierte Fragment proc-N1F1 (m/z 587.3⁺) und die halbierten Fragmente proc-H1N3 (m/z 1009.5⁺) und proc-H1N3F1 (m/z 1155.5⁺) hinzu.
   6. Bestimmen Sie die Vorläufer, die kernfucosylierte und halbierte N-Glykan-Strukturfragmente enthalten.
   7. Exportieren Sie die identifizierten N-Glykan-Strukturen durch die Software (Ergänzende Tabelle 1-3).
   8. Überprüfen Sie die manuell detektierten Vorläufer zur Bestimmung von kernfucosylierten und halbierten N-Glykanstrukturen.
2. Quantifizierung von Procainamid-markierten N-Glykanen durch eine Open-Source-Software²⁴
   1. Wählen Sie FLD-Chromatogramm in den Chromatogrammen aus und klicken Sie auf die Methode in der Software. Öffnen Sie eine Methode zum Exportieren von Chromatogrammen im Dateiformat .xy.
   2. Konvertieren Sie das .xy-Dateiformat der exportierten Chromatogramme in .txt Dateien.
   3. Öffnen Sie die Software für die quantitative Analyse.
      HINWEIS: Die in der Studie verwendete Software kann von einer Github-Quelle (https://github.com/Tarskin/HappyTools) heruntergeladen werden.
   4. Befolgen Sie die Anweisungen und Tutorials des Programms, die vom Entwickler präsentiert werden.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, einen Stapelprozess zu verwenden, um relative Bereiche zu exportieren.
   5. Passen Sie die Einstellparameter an (Ergänzende Abbildung 4). Definieren Sie vier minimale Spitzen und 27 Signal-Rausch-Verhältnisse für Kalibrierungen.
   6. Öffnen Sie die Ergebnisdatei mit der richtigen Software wie Microsoft Excel zur weiteren Auswertung.

Ergebnisse

In diesem vorgestellten Ansatz wurden zunächst die N-Glykane freigesetzt, mit dem Procainamid-Tag markiert und mit cellulosehaltigen SPE-Kartuschen gereinigt. Anschließend wurde die N-Glykan-Analyse von IgG, Trastuzumab und humanem Plasma mit einem HPLC-HILIC-FLD-MS/MS-System durchgeführt. Die MS- (Base Peak) und FLD-Chromatogramme der bestimmten N-Glykanstrukturen, die aus IgG und Trastuzumab gewonnen wurden, sind in Abbildung 1

Diskussion

Das N-Glykan-Profiling von Glykoproteinen umfasst anspruchsvolle Schritte. Obwohl es viele verschiedene Methoden zu diesem Zweck gibt, sollte sowohl für die Identifizierung als auch für die Quantifizierung von N-Glykanstrukturen ein geeigneter Ansatz gewählt werden¹⁴. HILIC-FLD ist der Goldstandard-Ansatz für die Quantifizierung von N-Glykanen. Die Identifizierung aller N-Glykan-Typen durch FLD-Detektion ist jedoch nicht mö...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Carlo Erba Reagents	401413	Glacial RS For LC/MS
Acetonitrile	Merck	1000292500	LC-MS LiChrosolv
Agilent 1200 Series HPLC with 1260 Series FLD dedector	Agilent Technologies
Ammoniumm Formate	Carlo Erba Reagents	419741	For LC/MS
Bruker TIMS-TOF (Q-TOF) Mass Spectrometry	Bruker Daltonics
Cellulose	Sigma Aldrich	310697	microcrystalline, powder, 20 μm
Deionized Water	Carlo Erba Reagents	412111	For LC/MS
Dimethyl sulfoxide	Sigma Aldrich	41639	BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (GC)
Empty polypropylene SPE Tube with PE frits	Sigma Aldrich	54220	20 μm porosity,volume 1 mL
Extraction Manifold, 20-position	Waters	WAT200607	Complete with rack for 13 x 100 mm tubes
Human Plasma	Sigma Aldrich	P9523	lyophilized
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	I8896	for molecular biology
IgG	Sigma Aldrich	I4506	lyophilized powder
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P4417	Tablet
PNGase F enzyme	Promega	V483A
Procainamide hydrochloride	abcam	ab120955
Sodium cyanoborohydride	Sigma Aldrich	156159	reagent grade, 95%
Sodium dodecyl sulfate	Sigma Aldrich	71725
trastuzumab	Roche Diagnostics
Trifluoroacetic acid	Sigma Aldrich	302031	for HPLC, ≥99.9%