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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Le profilage N-glycane des glycoprotéines est essentiel pour découvrir de nouveaux biomarqueurs et comprendre les fonctions des glycanes dans les événements cellulaires. De plus, l’analyse des N-glycanes des produits biopharmaceutiques protéiques est très importante pour l’utilisation humaine. Dans cet article, une stratégie à haut débit pour identifier et quantifier les structures N-glycanes a été présentée à l’aide de la technique HILIC-FLD-MS/MS.

Résumé

La glycosylation est une modification vitale présente dans les protéines. Le profilage N-glycane des glycoprotéines est nécessaire pour détecter de nouveaux candidats biomarqueurs et déterminer les altérations glycanes dans les maladies. La plupart des protéines biopharmaceutiques disponibles dans le commerce sont des glycoprotéines. L’efficacité de ces médicaments est affectée par les modèles de glycosylation. Par conséquent, une méthode de caractérisation approfondie des N-glycanes est nécessaire. Nous présentons ici une approche complète pour l’analyse qualitative et quantitative des N-glycanes à l’aide de la chromatographie liquide à interaction hydrophile équipée de la détection de fluorescence et de la spectrométrie de masse en tandem (HILIC-FLD-MS/MS). Les N-glycanes ont été libérés des glycoprotéines avec une méthode simple et marqués par un marqueur fluorophore de procaïnamide dans la stratégie. Par la suite, les N-glycanes marqués au procaïnamide ont été analysés par une technique HILIC-FLD-MS/MS. Dans cette approche, les structures des N-glycanes ont été confirmées par l’analyse spectrométrique de masse en tandem, tandis que la détection par fluorescence a été utilisée pour l’analyse quantitative. Une application pour l’analyse des données des pics de N-glycanes détectés est décrite dans l’étude. Ce protocole peut être appliqué à n’importe quelle glycoprotéine extraite de diverses espèces.

Introduction

La glycosylation est une modification post-traductionnelle vitale observée dans les protéines1. De multiples processus enzymatiques régulent la modification de la glycosylation dans les organismes cellulaires. Les glycanes sont attachés aux protéines par ces processus enzymatiques, et les protéines soumises à cette modification sont appelées glycoprotéines1. Deux types de glycosylation sont couramment observés dans les protéines. L’O-glycosylation est la fixation des O-glycanes à la chaîne latérale des résidus d’acides aminés sérine ou thréonine. La N-glycosylation est la fixation des N-glycanes à la chaîne latérale des résidus d’acides aminés d’asparagine dans une protéine.

La structure, la stabilité et le repliement des protéines sont affectés par les attaches des glycanes2. Le processus de glycosylation influence considérablement les fonctions des protéines, et les glycoprotéines régulent de nombreuses fonctions cellulaires dans les organismes 3,4. Par exemple, les protéines fortement glycosylées protègent leurs glycoprotéines de la dégradation protéolytique5. Un autre exemple est celui des glycanes des protéines de la glande thyroïde qui régulent le transport de la Tg et la synthèsehormonale6,7. Pour expliquer leur rôle dans les événements cellulaires, une caractérisation approfondie des glycoprotéines est nécessaire8.

Les profils N-glycanes des glycoprotéines changent dans les situations de maladie 9,10,11,12. Le profilage des N-glycanes dérivés de glycoprotéines ou de fluides corporels cruciaux est nécessaire pour découvrir de nouveaux biomarqueurs et comprendre les changements d’activité enzymatique dans les cas de maladie. D’autre part, la plupart des produits biopharmaceutiques protéiques sont des glycoprotéines, et leurs profils glycanes influencent l’efficacité des médicaments13. Par conséquent, une méthode acceptable de profilage des N-glycanes doit être mise en œuvre pour développer des produits biopharmaceutiques protéiques appropriés à usage humain14.

La glycomique est une discipline émergente utilisée pour identifier et quantifier les structures glycanes des molécules glycosylées15,16. De nombreuses méthodes ont été utilisées pour profiler les glycanes des espèces glycosylées, notamment la RMN17 et la MS18. La chromatographie liquide à interaction hydrophile avec détection par fluorescence (HPLC-HILIC-FLD) est la méthode de référence pour le profilage des N-glycanes dérivés des glycoprotéines19. Lorsque cette stratégie est combinée à la détection par spectrométrie de masse, l’identification des structures N-glycanes pourrait être plus facile et plus fiable. La plupart des marqueurs de fluorescence utilisés dans l’analyse des N-glycanes par spectrométrie de masse ont de faibles efficacités d’ionisation. En revanche, le procaïnamide augmente l’efficacité d’ionisation des N-glycanes, ce qui est utilisé pour obtenir des spectres de masse en tandem efficaces des structures de N-glycanes 20,21. Des fragments spécifiques peuvent être obtenus à partir de cette stratégie par spectrométrie de masse en tandem pour l’identification structurale des N-glycanes tels que le noyau fucosylé22 (proc-HexNAc1Fuc1) et les typesbissecteurs 23 (proc-Hex1HexNAc3, proc-Hex1HexNAc3Fuc1).

Cette étude démontre un protocole simple pour le profilage N-glycane des glycoprotéines avec HILIC-FLD-MS/MS. La méthode présentée comprend quatre étapes : (1) libération de N-glycanes à partir de glycoprotéines (2) marquage de N-glycanes par un marqueur de procaïnamide (3) purification des N-glycanes marqués au procaïnamide et (4) analyse de données.

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Protocole

REMARQUE : Le plasma humain utilisé est disponible dans le commerce (Table des matières). Aucun autre échantillon biologique prélevé sur l’homme n’a été utilisé.

1. Libération de glycanes

  1. Dénaturation des (glyco-)protéines
    1. Préparez les étalons de glycoprotéines (p. ex., IgG, un anticorps monoclonal) à une concentration de 10 μg·μL-1 dans du H2O désionisé. Pour le plasma humain, la concentration utilisée est de 70 μg·μL-1.
      REMARQUE : Les échantillons doivent être vortex jusqu’à ce que toutes les protéines solides soient dissoutes. Du plasma humain (lyophilisé) a été utilisé pour la préparation des échantillons de plasma.
    2. Prélever 20 μL d’échantillons de glycoprotéines (200 μg) et de plasma humain lyophilisé (1,4 mg).
    3. Ajouter 40 μL de SDS (dodécylsulfate de sodium) à 2 % (p/v).
    4. Incuber les échantillons à 60 °C pendant 10 min pour dénaturer les (glyco-)protéines.
      REMARQUE : Les échantillons peuvent être mélangés à 500 tr/min par un thermomélangeur pendant l’incubation. Un bain-marie agité peut être utilisé alternativement.
  2. Libération de glycanes
    1. Ajouter 20 μL d’Igepal-CA630 à 4 % aux échantillons de l’étape 1.1.4.
    2. Ajouter 20 μL de 5x PBS (tampon phosphate salin).
    3. Préparez l’enzyme PNGase F à la concentration de 1 U·μL-1 dans de l’eau désionisée.
    4. Ajouter 1 U d’enzyme pour les étalons de glycoprotéines et 2 U d’enzyme pour les échantillons de plasma humain.
    5. Incuber les échantillons à 37 °C pendant 16 h.
  3. Marquage du procaïnamide
    1. Préparer la solution d’étiquetage à l’aide d’acide chlorhydrique de procaïnamide (110 mg·mL-1 dans du DMSO/AA (sulfoxyde de diméthyle/acide acétique glacial) 7/3, v/v).
    2. Préparer une solution d’amination réductrice à l’aide de cyanoborohydrure de sodium (65 mg·mL-1 dans du DMSO/AA, 7/3, v/v).
      ATTENTION : Le cyanoborohydrure de sodium est très toxique et inflammable. Portez des lunettes de protection. Le complexe 2-picoline borane (107 mg·mL-1 dans le DMSO) pourrait être utilisé alternativement.
    3. Mélangez ces solutions dans un rapport de 1:1, v/v pour préparer le mélange d’étiquetage.
    4. Ajouter 100 μL de ce mélange de marquage à l’échantillon libéré de glycanes à l’étape 1.2.5.
    5. Incuber les échantillons à 65 °C pendant 2 h.

2. Purification des N-glycanes marqués au procaïnamide par cartouche d’extraction en phase solide (SPE)

  1. Préparez une solution de cellulose microcristalline (100 mg·mL-1) dans de l’eau désionisée.
  2. Prélever 300 μL de cellulose microcristalline et l’insérer dans les tubes de la microcentrifugation.
  3. Laver la cellulose microcristalline avec 1 mL de H2O désionisé.
  4. Laver la cellulose microcristalline avec 1 mL d’ACN/MQ (acétonitrile/dH2O), 85/15, v/v pour le conditionnement.
    REMARQUE : La microcentrifugeuse doit être utilisée pendant 1 min pour jeter soigneusement les solutions de lavage.
  5. Prélever 120 μL de solution de libération de glycanes et mélanger avec 680 μL d’ACN pour obtenir des conditions de charge appropriées (85/15, v/v, ACN/échantillon).
  6. Mélangez ce mélange avec de la cellulose microcristalline dans les tubes de la microcentrifugeuse.
  7. Incuber à température ambiante dans un thermomixeur en secouant à 500 tr/min pendant 15 min.
  8. Transférez la boue dans une cartouche SPE (capacité de 1 ml).
    REMARQUE : Ne laissez pas l’air pénétrer dans l’emballage de la cartouche.
  9. Jetez les solutions de chargement en passant lentement (1 goutte/seconde).
    REMARQUE : Assurez-vous que le système SPE est connecté à la pompe à vide. Les solvants peuvent s’écouler par gravité. Si nécessaire, appliquez le vide à l’aide d’une pompe à vide. La pression de vide appliquée doit être ajustée de manière appropriée pour transférer lentement les liquides vers le bas.
  10. Laver l’échantillon en passant deux fois 1 mL de solution d’ACN/MQ/TFA (acétonitrile/dH2O/acide trifluoroacétique) (85/14/1, v/v/v).
  11. Lavez l’échantillon en passant deux fois 1 mL de mélange ACN/MQ (85/15, v/v).
  12. Éluer les N-glycanes marqués au procaïnamide avec 0,75 mL d’eau.
  13. Séchez la solution d’élution avec un concentrateur pendant la nuit.
    REMARQUE : Utilisez une température de concentrateur de 45 °C pour le séchage.
  14. Dissoudre les échantillons séchés dans un mélange de 100 μL d’ACN/MQ (75/25, v/v) et transférer cette solution dans les flacons, y compris un insert.
    REMARQUE : Les échantillons redissous doivent être tourbillonnés pendant 20 secondes.

3. Analyse HILIC-FLD-MS/MS

  1. Insérez les adaptateurs en T (T) dans la colonne HILIC pour séparer le flux en deux volumes égaux. Connectez l’un des deux au détecteur FLD, l’autre au détecteur MS.
    REMARQUE : Les conduites d’écoulement doivent être de la même longueur.
  2. Ajuster un programme de gradient pour les séparations HILIC des N-glycanes marqués au procaïnamide comme indiqué dans la figure supplémentaire 1. Utiliser la phase mobile A : 50 mM de formiate d’ammonium (pH : 4,4 et phase mobile B : 100 % ACN).
    REMARQUE : Le programme de gradient pourrait être optimisé davantage en fonction de l’hétérogénéité des glycanes des échantillons.
  3. Cliquez sur le bouton Sampler et réglez le volume d’injection sur 10 μL.
  4. Cliquez sur l’icône Column Comp et réglez la température de la colonne à 60 °C.
  5. Cliquez sur FLD et ajustez les longueurs d’onde d’excitation et d’émission FLD à 310 nm et 370 nm, respectivement.
  6. Ajustez les paramètres de source, de réglage et de MS/MS comme illustré à la Figure supplémentaire 2.
    REMARQUE : Les paramètres MS et MS/MS peuvent être modifiés en fonction de la spectrométrie de masse utilisée dans l’analyse.

4. Analyse des données

  1. Identification des N-glycanes marqués au procaïnamide
    1. Exportez les données MS/MS dans un format approprié pour les recherches dans les bases de données (par exemple, .mgf, .xml).
    2. Insérez-les dans un outil de recherche de base de données pour l’identification des N-glycanes.
    3. Sélectionnez le nom de l’échantillon répertorié dans le logiciel et cliquez sur le bouton Recherche de glycanes pour l’identification des N-glycanes marqués au procaïnamide à l’aide de la base de données Carbbank avec les paramètres donnés (Figure supplémentaire 3).
    4. Ouvrez le bouton Modifier les chromatogrammes dans le logiciel d’analyse de données pour les données brutes et sélectionnez le type de chromatogramme ionique extrait en filtrant tous les MSn.
    5. Ajouter des masses spécifiques pour le fragment core-fucosylé proc-N1F1 (m/z 587.3+) et les fragments bissectés proc-H1N3 (m/z 1009.5+) et proc-H1N3F1 (m/z 1155.5+).
    6. Déterminer les précurseurs contenant des fragments de structure N-glycane fucosylés et coupés en deux.
    7. Exporter les structures N-glycanes identifiées par le logiciel (tableau supplémentaire 1-3).
    8. Vérifiez les précurseurs détectés manuellement pour la détermination des structures N-glycanes fucosylées et coupées en deux.
  2. Quantification de N-glycanes marqués au procaïnamide par un logiciel open source24
    1. Sélectionnez le chromatogramme FLD dans les chromatogrammes et cliquez sur la méthode dans le logiciel. Ouvrez une méthode d’exportation de chromatogrammes au format de fichier .xy.
    2. Convertissez le format de fichier .xy des chromatogrammes exportés en fichiers .txt.
    3. Ouvrez le logiciel d’analyse quantitative.
      REMARQUE : Le logiciel utilisé dans l’étude peut être téléchargé à partir d’une source Github (https://github.com/Tarskin/HappyTools).
    4. Suivez les instructions et les tutoriels du programme présentés par le développeur.
      REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser un traitement par lots pour exporter les surfaces relatives.
    5. Ajustez les paramètres de réglage (Figure supplémentaire 4). Définissez quatre pics minimaux et 27 rapports signal/bruit pour les étalonnages.
    6. Ouvrez le fichier de résultats à l’aide d’un logiciel approprié tel que Microsoft Excel pour une évaluation plus approfondie.

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Résultats

Dans cette approche présentée, les N-glycanes ont d’abord été libérés, marqués par l’étiquette procaïnamide et purifiés par des cartouches SPE contenant de la cellulose. Ensuite, l’analyse des N-glycanes des IgG, du trastuzumab et du plasma humain a été effectuée par un système HPLC-HILIC-FLD-MS/MS. Les chromatogrammes MS (pic de base) et FLD des structures N-glycanes déterminées obtenues à partir d’IgG et de trastuzumab sont illustrés...

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Discussion

Le profilage N-glycane des glycoprotéines comprend des étapes difficiles. Bien qu’il existe de nombreuses méthodologies différentes à cet effet, une approche appropriée doit être choisie pour l’identification et la quantification des structures des N-glycanes 14. HILIC-FLD est l’approche de référence pour la quantification des N-glycanes. Cependant, l’identification de tous les types de N-glycanes par détection...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été en partie soutenu par le ministère du Développement de la République de Turquie avec le numéro de projet : 2016 K121230. Bekir Salih remercie chaleureusement l’Académie turque des sciences (TUBA) pour son soutien financier partiel.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidCarlo Erba Reagents401413Glacial RS For LC/MS
AcetonitrileMerck1000292500LC-MS LiChrosolv
Agilent 1200 Series HPLC with 1260 Series FLD dedectorAgilent Technologies
Ammoniumm FormateCarlo Erba Reagents419741For LC/MS
Bruker TIMS-TOF (Q-TOF) Mass SpectrometryBruker Daltonics
CelluloseSigma Aldrich310697microcrystalline, powder, 20 μm
Deionized WaterCarlo Erba Reagents412111For LC/MS
Dimethyl sulfoxideSigma Aldrich41639BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (GC)
Empty polypropylene SPE Tube with PE fritsSigma Aldrich5422020 μm porosity,volume 1 mL
Extraction Manifold, 20-positionWatersWAT200607Complete with rack for 13 x 100 mm tubes
Human PlasmaSigma AldrichP9523lyophilized
IGEPAL CA-630Sigma AldrichI8896for molecular biology
IgGSigma AldrichI4506lyophilized powder
Phosphate buffered salineSigma AldrichP4417Tablet
PNGase F enzymePromegaV483A
Procainamide hydrochlorideabcamab120955
Sodium cyanoborohydrideSigma Aldrich156159reagent grade, 95%
Sodium dodecyl sulfateSigma Aldrich71725
trastuzumabRoche Diagnostics
Trifluoroacetic acidSigma Aldrich302031for HPLC, ≥99.9%

Références

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