Imágenes ópticas mesoscópicas del corazón de todo el ratón

Resumen

Presentamos un método para la reconstrucción mesoscópica de todo el corazón del ratón mediante la combinación de nuevos avances en la transformación de tejidos y la tinción con el desarrollo de un microscopio de hoja de luz escaneado axialmente.

Resumen

Tanto las enfermedades cardíacas genéticas como las no genéticas pueden causar procesos de remodelación severos en el corazón. La remodelación estructural, como la deposición de colágeno (fibrosis) y la desalineación celular, puede afectar la conducción eléctrica, introducir disfunciones electromecánicas y, eventualmente, conducir a arritmias. Los modelos predictivos actuales de estas alteraciones funcionales se basan en información estructural no integrada y de baja resolución. Colocar este marco en un orden de magnitud diferente es un desafío debido a la ineficacia de los métodos de imagen estándar para realizar imágenes de alta resolución en tejido masivo. En este trabajo, describimos un marco metodológico que permite obtener imágenes de corazones de ratón enteros con resolución micrométrica. La consecución de este objetivo ha requerido un esfuerzo tecnológico donde se han combinado los avances en la transformación de tejidos y los métodos de imagen. Primero, describimos un protocolo CLARITY optimizado capaz de transformar un corazón intacto en una forma nanoporosa, hibridada con hidrogel, libre de lípidos que permite una alta transparencia y tinción profunda. Luego, se describe un microscopio de lámina de luz fluorescente capaz de adquirir rápidamente imágenes de un campo de visión mesoscópico (escala mm) con la resolución a escala micrométrica. Siguiendo el proyecto mesoSPIM, el microscopio concebido permite la reconstrucción de todo el corazón del ratón con resolución micrométrica en un solo escaneo tomográfico. Creemos que este marco metodológico permitirá aclarar la participación del desorden citoarquitectónico en las disfunciones eléctricas y allanar el camino para un modelo integral que considere tanto los datos funcionales como los estructurales, permitiendo así una investigación unificada de las causas estructurales que conducen a alteraciones eléctricas y mecánicas después de la remodelación tisular.

Introducción

La remodelación estructural asociada a enfermedades cardíacas puede afectar la conducción eléctrica e introducir disfunciones electromecánicas del órgano ^1,2. Los enfoques actuales utilizados para predecir alteraciones funcionales comúnmente emplean MRI y DT-MRI para obtener una reconstrucción general de la deposición de fibrosis, el árbol vascular y la distribución de fibras del corazón, y se utilizan para modelar las rutas de propagación del potencial de acción preferencial (APP) a través del órgano ^3,4. Estas estrategias pueden proporcionar una hermosa visión general de la organización del corazón. Sin embargo, su resolución espacial es insuficiente para investigar el impacto de la remodelación estructural en la función cardíaca a nivel celular.

Colocar este marco en un orden de magnitud diferente, donde las células individuales pueden desempeñar papeles individuales en la propagación del potencial de acción, es un desafío. La principal limitación es la ineficiencia de los métodos de imagen estándar para realizar imágenes de alta resolución (resolución micrométrica) en tejidos masivos (de tamaño centímetro). De hecho, la obtención de imágenes de tejidos biológicos en 3D a alta resolución es muy complicada debido a la opacidad del tejido. El enfoque más común para realizar reconstrucciones 3D en órganos enteros es preparar secciones delgadas. Sin embargo, la sección precisa, el ensamblaje y las imágenes requieren un esfuerzo y tiempo significativos. Un enfoque alternativo que no exige cortar la muestra es generar un tejido transparente. Durante los últimos años, se han propuesto varias metodologías para clarificar tejidos 5,6,7,8. El desafío de producir tejidos masivos, transparentes y marcados con fluorescencia se ha logrado recientemente mediante el desarrollo de verdaderos enfoques de transformación de tejidos (CLARITY⁹, SHIELD¹⁰). En particular, el método CLARITY se basa en la transformación de un tejido intacto en una forma nanoporosa, hibridada con hidrogel, libre de lípidos que permite conferir una alta transparencia mediante la eliminación selectiva de bicapas lipídicas de membrana. Cabe destacar que este método ha sido encontrado exitoso también en la preparación cardíaca^11,12,13,14. Sin embargo, dado que el corazón es demasiado frágil para ser adecuado para una limpieza activa, debe limpiarse utilizando el enfoque pasivo, que requiere mucho tiempo para conferir una transparencia completa.

En combinación con técnicas avanzadas de imagen como la microscopía de hoja de luz, CLARITY tiene el potencial de obtener imágenes de tejidos cardíacos masivos en 3D a resolución micrométrica. En la microscopía de lámina de luz, la iluminación de la muestra se realiza con una lámina delgada de luz confinada en el plano focal del objetivo de detección. La emisión de fluorescencia se recoge a lo largo de un eje perpendicular al plano de iluminación¹⁵. La arquitectura de detección es similar a la microscopía de campo amplio, lo que hace que la adquisición sea mucho más rápida que los microscopios de barrido láser. El desplazamiento de la muestra a través de la lámina de luz permite obtener una tomografía completa de muestras grandes, de hasta un centímetro de tamaño. Sin embargo, debido a las propiedades intrínsecas del haz gaussiano, es posible obtener una lámina de luz muy delgada (del orden de unas pocas micras) solo para una extensión espacial limitada, lo que limita drásticamente el campo de visión (FoV). Recientemente, se ha introducido un novedoso esquema de excitación para superar esta limitación y se ha aplicado para imágenes cerebrales, permitiendo reconstrucciones 3D con resolución isotrópica¹⁶.

En este documento, se presenta un enfoque de compensación pasiva, lo que permite una reducción significativa del tiempo de compensación necesario para el protocolo CLARITY. El marco metodológico descrito aquí permite reconstruir un corazón de ratón completo con resolución micrométrica en una sola exploración tomográfica con un tiempo de adquisición del orden de minutos.

Protocolo

Todas las manipulaciones y procedimientos de los animales se realizaron de acuerdo con las directrices de la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos y se ajustaron a los principios y reglamentos del Ministerio de Salud italiano. El protocolo experimental fue aprobado por el Ministerio de Salud italiano (número de protocolo 647/2015-PR). Todos los animales fueron proporcionados por ENVIGO, Italia. Para estos experimentos, se utilizaron 5 ratones machos C57BL / 6J de 6 meses de edad.

1. Preparación de la solución

1. Prepare paraformaldehído (PFA) al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7.6) en una campana química. Conservar las alícuotas de PFA al 4% a -20 °C durante varios meses.
2. Preparar solución de hidrogel: Mezclar 4% de acrilamida, 0,05% de bis-acrilamida, 0,25% de iniciador AV-044 en 0,01 M PBS en una campana química. Mantenga los reactivos y la solución en hielo durante toda la preparación. Conservar las alícuotas de hidrogel a -20 °C durante varios meses.
3. Preparar solución de limpieza: Mezclar 200 mM de ácido bórico, 4% de dodecil-sulfato de sodio (SDS) en agua desionizada; pH 8.6 en una campana química. Conservar la solución entre 21-37 °C para evitar la precipitación SDS.
4. Prepare una solución fresca de Tyrode el día del experimento: añadir 10 mM de glucosa, 10 mM de HEPES, 113 mM de NaCl, 1,2 mM de MgCl₂ y 4,7 mM de KCl; valorar a pH 7,4 utilizando 1 M NaOH.

2. Aislamiento del corazón

1. Inyecte 0.1 ml de heparina 500 U.I. por vía subcutánea 30 min antes del procedimiento de aislamiento cardíaco.
2. Llene una jeringa de 30 ml y tres placas de Petri de 6 cm con una solución fresca de Tyrode. Haga una pequeña grieta (3-4 mm de profundidad) en el borde de una de las placas de Petri y colóquela bajo un microscopio estereoscópico.
3. Fije una cánula de 1 mm de diámetro a la jeringa e insértela en la grieta de la placa de Petri. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la jeringa.
4. Llene una jeringa de 20 ml con PFA al 4% y manténgala en la campana química. Prepare una placa de Petri vacía debajo del capó.
5. Anestesiar al ratón con isoflurano/oxígeno al 3% a un caudal de 1,0 L/min y sacrificarlo por luxación cervical de acuerdo con las normas de bienestar animal vigentes.
6. Después del sacrificio, retire el pelaje sobre el pecho y abra el pecho para tener acceso completo al corazón.
7. Aísle el corazón, sumérjalo en la placa de Petri previamente llena con 50 ml de solución Tyrode. Use tijeras quirúrgicas para cortar la aorta inmediatamente cerca del arco aórtico para exponer el corazón.
8. Transfiera el corazón bajo un microscopio estereoscópico y realice cuidadosamente la canulación con cuidado. No inserte la cánula demasiado profundamente en la aorta (no más de 2 mm) para evitar daños tisulares.
9. Use una pequeña pinza y una sutura (tamaño 5/0) para fijar el corazón a la cánula.
10. Perfundir el corazón con 30 ml de la solución Tyrode con una presión constante de 10 ml/min para eliminar la sangre de los vasos.
11. Separe la cánula de la jeringa y coloque el corazón en la placa de Petri llena de solución Tyrode. Tenga cuidado de no tener burbujas de aire en la cánula; De lo contrario, retire las burbujas de aire correctamente.
12. Conecte la jeringa de 20 ml llena de PFA fría al 4% en la cánula y perfunda el corazón a la misma presión constante.
13. Incubar el corazón en 10 ml de PFA al 4% a 4 °C durante la noche (O/N). Para evitar la degradación del tejido, realice los pasos 2.6-2.13 en el menor tiempo posible.

3. Limpieza del corazón

1. Al día siguiente, lavar el corazón en 0,01 M PBS 3 veces a 4 °C durante 15 min.
   NOTA: Después de este paso, el corazón puede almacenarse en PBS + 0,01% de azida de sodio (NaN3) a 4 °C durante varios meses.
2. Incubar el corazón en 30 ml de solución de hidrogel agitando (15 rpm) a 4 °C durante 3 días.
3. Desgasifique la muestra a temperatura ambiente usando un secador, una bomba de vacío y un sistema de tubos que conecta el secador tanto a la bomba como a una tubería de nitrógeno.
   1. Coloque la muestra en la secadora y abra el vial, manteniendo la tapa sobre él.
   2. Cierre la secadora y retire el oxígeno del tubo abriendo la tubería de nitrógeno.
   3. Encienda la bomba de vacío para eliminar el oxígeno de la secadora durante 10 minutos.
   4. Apague la bomba y use la perilla de la secadora para abrir la tubería de nitrógeno. Una vez que la presión sea igual a la presión atmosférica, abra con cuidado el secador y cierre rápidamente el vial.
4. Mantener el corazón en la solución de hidrogel desgasificado a 37 °C durante 3 h en reposo.
5. Cuando el hidrogel esté correctamente polimerizado y parezca completamente gelatinoso, retire con cuidado el corazón y colóquelo en el portamuestras.
6. Inserte el portamuestras con el corazón en una de las cámaras de limpieza y ciérrelo correctamente para evitar fugas de la solución de limpieza.
7. Encienda el baño de agua donde se coloca el recipiente de la solución de limpieza y la bomba peristáltica para iniciar la recirculación de la solución de limpieza.
8. Cambie la solución de limpieza en el contenedor una vez a la semana para acelerar el procedimiento de clarificación.

4. Tinción de la membrana celular

1. Una vez que el corazón aparezca completamente aclarado, retírelo del portamuestras y lávelo en 50 ml de PBS calentado durante 24 h. Lavar de nuevo en 50 mL de PBS + 1% de Triton-X (PBS-T 1x) durante 24 h.
2. Incubar la muestra en 0.01 mg/mL de aglutinina de germen de trigo (WGA) - Alexa Fluor 633 en 3 mL de PBS-T 1x en agitación (50 rpm) a temperatura ambiente durante 7 días.
3. Después de la incubación de 7 días, lavar la muestra en 50 ml de PBS-T 1x a temperatura ambiente agitando durante 24 h.
4. Incubar la muestra en PFA al 4% durante 15 minutos y luego lavarla 3 veces en PBS durante 5 minutos cada una.
   NOTA: Después de este paso, el corazón puede almacenarse en PBS + 0.01% NaN3 a 4 °C durante varios meses.
5. Incubar el corazón en concentraciones crecientes de 2,2′-tiodietanol (TDE) en 0,01 M PBS (20% y 47% TDE/PBS) durante 8 h cada una, hasta la concentración final de 68% TDE en 0,01 M PBS para proporcionar el índice de refracción requerido (RI = 1,46). Este es el medio de coincidencia de RI (RI-medium) para adquirir imágenes¹⁶.

5. Montaje y adquisición del corazón

NOTA: Todos los componentes del sistema óptico se enumeran en detalle en la Tabla de materiales.

1. Llene suavemente aproximadamente el 80% de la cubeta externa (cuarzo, 45 mm × 45 mm × 42,5 mm) con el medio RI.
   NOTA: Aquí es posible utilizar diferentes soluciones no volátiles que garantizan un RI de 1,46.
2. Llene suavemente la cubeta interna (cuarzo, 45 mm × 12,5 mm × 12,5 mm) con el mismo medio RI.
3. Sumerja la muestra dentro de la cubeta interna. Las incubaciones de muestras descritas anteriormente permiten que la muestra permanezca estable dentro del medio RI sin ser retenida.
4. Mueva suavemente la muestra hasta el fondo de la cubeta con pinzas finas y coloque el corazón con su eje longitudinal paralelo al eje principal de la cubeta para minimizar la trayectoria de la luz de excitación a través del tejido durante la exploración.
5. Fije suavemente el tapón hecho a medida sobre la cubeta interna con dos tornillos.
6. Monte la muestra en la etapa de microscopio usando los imanes.
7. Traduzca la etapa de muestra vertical manualmente para sumergir la cubeta interna en la externa.
8. Encienda la fuente de luz de excitación (longitud de onda de 638 nm), estableciendo una potencia baja (del orden de 3 mW).
9. Mueva la muestra utilizando el traductor motorizado para iluminar un plano interno del tejido.
10. Encienda el software de imágenes (HCImageLive) y configure el disparador de la cámara en modo externo (hoja de luz) para controlar el disparador de adquisición de la cámara mediante el software personalizado que controla toda la configuración.
11. Active el guardado automático en el panel Configuración de escaneo y establezca la carpeta de salida donde se deben guardar las imágenes.
12. Ajuste manualmente la posición de la muestra en el plano XY con los traductores lineales para mover la muestra al centro del FoV del sensor de la cámara.
13. Mueva la muestra a lo largo del eje Z utilizando el traductor motorizado lineal para identificar los bordes del corazón para la reconstrucción tomográfica.
14. Aumente la potencia del láser a ~ 20 mW, listo para la sesión de imágenes.
15. Inicie la adquisición tomográfica, haga clic en el botón Inicio en el panel Secuencia del software de imágenes y, al mismo tiempo, mueva la muestra a lo largo del eje Z a una velocidad constante de 6 μm/s utilizando el traductor motorizado.

Resultados

La configuración de limpieza pasiva desarrollada permite obtener un corazón de ratón adulto despejado (con una dimensión del orden de 10 mm x 6 mm x 6 mm) en aproximadamente 3 meses. Todos los componentes de la configuración están montados como se muestra en la Figura 1. El gradiente de temperatura insignificante entre cada cámara de limpieza (del orden de 3 ° C) permite mantener la temperatura en un rango adecuado en todas las cámaras.

Discusión

En este trabajo, se introdujo un enfoque exitoso para limpiar, teñir e imaginar un corazón de ratón completo en alta resolución. En primer lugar, se optimizó y realizó un protocolo de transformación tisular (CLARITY), ligeramente modificado para su aplicación en el tejido cardíaco. De hecho, para obtener una reconstrucción eficiente en 3D de todo un corazón, es esencial prevenir el fenómeno de la dispersión de la luz. La metodología CLARITY nos permite obtener un corazón intacto altamente transparente, per...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-2’ Thiodiethanol	Sigma-Aldrich	166782
Acrylamide	Bio-Rad	61-0140
AV-044 Initiator	Wako Chemicals	AVP5874
Bis-Acrylamide	Bio-Rad	161-042
Boric Acid	Sigma-Aldrich	B7901
Camera	Hamamatsu	Orca flash 4.0 v3
Camera software	Hamamatsu	HC Image
Collimating lens	Thorlabs	AC254-050-A-ML
Detection arm	Integrated optics	0638L-15A-NI-PT-NF
Excitation lens	Nikon	91863
Exteraìnal quartz cuvette	Portmann Instruments	UQ-753
Fold mirrors	Thorlabs	BBE1-E02
Galvanometric mirror	Thorlabs	GVS211/M
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HCImage Live	Hamamatsu	4.6.1.19
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Internal quartz cuvette	Portmann Instruments	UQ-204
KCl	Sigma-Aldrich	P4504
Laser source	Integrated Optics	0638L-15A-NI-PT-NF
Long-pass filter	Thorlabs	FELH0650
Magnetic base	Thorlabs	KB25/M
MgCl2	Chem-Lab	CI-1316-0250
Motorized traslator	Physisk Instrument	M-122.2DD
NaCl	Sigma-Aldrich	59888
Objective	Thorlabs	TL2X-SAP
Paraformaldehyde	Agar Scientific	R1018
Phosphate Buffer Solution	Sigma-Aldrich	P4417
Polycap AS	Whatman	2606T
Relay lens	Qioptiq	G063200000
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
Tube lens	Thorlabs	ACT508-200-A-ML
Tunable lens	Optotune	EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
Vacuum pump	KNF Neuberger Inc	N86KT.18
Water bath	Memmert	WTB