Imagem óptica mesoscópica do coração de todo o rato

Resumo

Relatamos um método para reconstrução mesoscópica de todo o coração do rato, combinando novos avanços na transformação e coloração de tecidos com o desenvolvimento de um microscópio de folha de luz digitalizado axialmente.

Resumo

Doenças cardíacas genéticas e não genéticas podem causar processos graves de remodelação no coração. O remodelamento estrutural, como a deposição de colágeno (fibrose) e o desalinhamento celular, pode afetar a condução elétrica, introduzir disfunções eletromecânicas e, eventualmente, levar à arritmia. Os modelos preditivos atuais dessas alterações funcionais são baseados em informações estruturais não integradas e de baixa resolução. Colocar essa estrutura em uma ordem diferente de magnitude é um desafio devido à ineficácia dos métodos de imagem padrão na realização de imagens de alta resolução em tecidos maciços. Neste trabalho, descrevemos um referencial metodológico que permite a imagem de corações inteiros de camundongos com resolução micrométrica. A consecução deste objetivo exigiu um esforço tecnológico onde os avanços na transformação de tecidos e métodos de imagem foram combinados. Primeiro, descrevemos um protocolo CLARITY otimizado capaz de transformar um coração intacto em uma forma nanoporosa, hibridizada em hidrogel e livre de lipídios que permite alta transparência e coloração profunda. Em seguida, um microscópio de folha de luz de fluorescência capaz de adquirir rapidamente imagens de um campo de visão mesoscópico (escala mm) com a resolução em escala mícron é descrito. Seguindo o projeto mesoSPIM, o microscópio concebido permite a reconstrução de todo o coração do rato com resolução micrométrica em uma única varredura tomográfica. Acreditamos que esse referencial metodológico permitirá esclarecer o envolvimento do desarranjo citoarquitetônico nas disfunções elétricas e abrir caminho para um modelo abrangente que considere tanto os dados funcionais quanto estruturais, possibilitando assim uma investigação unificada das causas estruturais que levam a alterações elétricas e mecânicas após o remodelamento tecidual.

Introdução

O remodelamento estrutural associado a doenças cardíacas pode afetar a condução elétrica e introduzir disfunções eletromecânicas do órgão ^1,2. As abordagens atuais utilizadas para predizer alterações funcionais comumente empregam RM e DT-MRI para obter uma reconstrução geral da deposição de fibrose, árvore vascular e distribuição de fibras do coração, e são usadas para modelar caminhos de propagação do potencial de ação preferencial (APP) através do órgão ^3,4. Essas estratégias podem fornecer uma bela visão geral da organização do coração. No entanto, sua resolução espacial é insuficiente para investigar o impacto do remodelamento estrutural na função cardíaca em nível celular.

Colocar essa estrutura em uma ordem diferente de magnitude, onde células individuais podem desempenhar papéis individuais na propagação do potencial de ação, é um desafio. A principal limitação é a ineficiência dos métodos de imagem padrão para realizar imagens de alta resolução (resolução micrométrica) em tecidos maciços (tamanho de centímetros). De fato, a imagem de tecidos biológicos em 3D em alta resolução é muito complicada devido à opacidade do tecido. A abordagem mais comum para realizar reconstruções 3D em órgãos inteiros é preparar seções finas. No entanto, o seccionamento, a montagem e a imagem precisos exigem esforço e tempo significativos. Uma abordagem alternativa que não exija o corte da amostra é gerar um tecido transparente. Nos últimos anos, diversas metodologias de clarificação de tecidos têm sido propostas 5,6,7,8. O desafio de produzir tecidos maciços, transparentes e marcados fluorescentemente foi recentemente alcançado através do desenvolvimento de verdadeiras abordagens de transformação de tecidos (CLARITY⁹, SHIELD¹⁰). Em particular, o método CLARITY baseia-se na transformação de um tecido intacto em uma forma nanoporosa, hibridizada em hidrogel e livre de lipídios que permite conferir alta transparência pela remoção seletiva de bicamadas lipídicas de membrana. Notavelmente, esse método tem sido bem sucedido também no preparo cardíaco ^11,12,13,14. No entanto, uma vez que o coração é demasiado frágil para ser adequado para uma clareira activa, deve ser limpo utilizando a abordagem passiva, que requer muito tempo para conferir total transparência.

Em combinação com técnicas avançadas de imagem, como a microscopia de folha de luz, o CLARITY tem o potencial de visualizar tecidos cardíacos maciços em 3D em resolução micrométrica. Na microscopia de folha de luz, a iluminação da amostra é realizada com uma fina folha de luz confinada no plano focal do objetivo de detecção. A emissão de fluorescência é coletada ao longo de um eixo perpendicular ao plano de iluminação¹⁵. A arquitetura de detecção é semelhante à microscopia de campo amplo, tornando a aquisição muito mais rápida do que os microscópios de varredura a laser. Mover a amostra através da folha de luz permite obter uma tomografia completa de grandes espécimes, amostras de até centímetros. No entanto, devido às propriedades intrínsecas do feixe gaussiano, é possível obter uma folha de luz muito fina (da ordem de alguns mícrons) apenas para uma extensão espacial limitada, limitando drasticamente o campo de visão (FoV). Recentemente, um novo esquema de excitação foi introduzido para superar essa limitação e aplicado para imagens cerebrais, permitindo reconstruções 3D com resolução isotrópica¹⁶.

Neste artigo, uma abordagem de compensação passiva é apresentada, permitindo uma redução significativa do tempo de compensação necessário para o protocolo CLARITY. O referencial metodológico aqui descrito permite reconstruir todo um coração de camundongo com resolução micrométrica em uma única tomografia com tempo de aquisição na ordem de minutos.

Protocolo

Todos os manuseamentos e procedimentos de animais foram realizados de acordo com as diretrizes da Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu relativa à proteção dos animais utilizados para fins científicos e em conformidade com os princípios e regulamentos do Ministério da Saúde italiano. O protocolo experimental foi aprovado pelo Ministério da Saúde italiano (protocolo número 647/2015-PR). Todos os animais foram fornecidos pela ENVIGO, Itália. Para esses experimentos, foram utilizados 5 camundongos machos C57BL/6J de 6 meses de idade.

1. Preparação da solução

1. Prepare paraformaldeído a 4% (PFA) em salina tamponada com fosfato (PBS) (pH 7,6) em um exaustor químico. Conservar as alíquotas de PFA a -20 °C durante vários meses.
2. Preparar solução de hidrogel: Misture 4% de acrilamida, 0,05% de bis-acrilamida, 0,25% de Initiatior AV-044 em 0,01 M PBS em um exaustor químico. Mantenha os reagentes e a solução no gelo durante toda a preparação. Conservar as alíquotas de hidrogel a -20 °C durante vários meses.
3. Preparar solução de Limpeza: Misture ácido bórico a 200 mM, Dodecil-Sulfato de Sódio (SDS) a 4% em água deionizada; pH 8,6 em um exaustor químico. Conservar a solução entre 21-37 °C para evitar a precipitação SDS.
4. Preparar solução fresca de Tyrode no dia do experimento: Adicionar 10 mM de glicose, 10 mM de HEPES, 113 mM de NaCl, 1,2 mM de MgCl₂ e 4,7 mM de KCl; titula para pH 7,4 usando 1 M de NaOH.

2. Isolamento cardíaco

1. Injete 0,1 mL de 500 UI de heparina por via subcutânea 30 min antes do procedimento de isolamento cardíaco.
2. Encha uma seringa de 30 ml e três placas de Petri de 6 cm com solução fresca de Tyrode. Faça uma pequena fenda (3-4 mm de profundidade) na borda de uma das placas de Petri e coloque-a sob um microscópio estereoscópico.
3. Fixe uma cânula de 1 mm de diâmetro na seringa e insira-a na fenda da placa de Petri. Certifique-se de que não existem bolhas de ar na seringa.
4. Encha uma seringa de 20 ml com 4% de PFA e mantenha-a no exaustor químico. Prepare uma placa de Petri vazia sob o capô.
5. Anestesiar o ratinho com isoflurano/oxigénio a 3% a um caudal de 1,0 L/min e sacrificá-lo por luxação cervical de acordo com as regras de bem-estar animal em vigor.
6. Após o sacrifício, remova o pelo sobre o peito e abra o peito para ter acesso total ao coração.
7. Isole o coração, mergulhe-o na placa de Petri previamente preenchida com 50 mL de Solução de Tiroide. Use uma tesoura cirúrgica para cortar a aorta imediatamente perto do arco aórtico para ter o coração exposto.
8. Transfira o coração sob um microscópio estereoscópico e realize cuidadosamente a canulação. Não insira a cânula muito profundamente na aorta (não mais de 2 mm) para evitar danos nos tecidos.
9. Use um pouco de grampo e uma sutura (tamanho 5/0) para fixar o coração à cânula.
10. Perfundir o coração com 30 ml da solução de Tyrode com uma pressão constante de 10 ml/min para remover o sangue dos vasos.
11. Retire a cânula da seringa e coloque o coração na placa de Petri cheia de solução de Tyrode. Tenha cuidado para não ter bolhas de ar na cânula; caso contrário, remova as bolhas de ar corretamente.
12. Ligue a seringa de 20 ml cheia de PFA a 4% frio à cânula e perfunda o coração à mesma pressão constante.
13. Incubar o coração em 10 mL de PFA a 4% a 4 °C durante a noite (O/N). Para evitar a degradação tecidual, execute as etapas 2.6-2.13 no menor tempo possível.

3. Limpeza do coração

1. No dia seguinte, lave o coração em 0,01 M PBS 3 vezes a 4 °C por 15 min.
   NOTA: Após esta etapa, o coração pode ser armazenado em PBS + azida de sódio a 0,01% (NaN3) a 4 °C durante vários meses.
2. Incubar o coração em 30 ml de solução de Hidrogel em agitação (15 rpm) a 4 °C durante 3 dias.
3. Desgaseifique a amostra à temperatura ambiente usando um secador, uma bomba de vácuo e um sistema de tubos que conecta o secador à bomba e a uma tubulação de nitrogênio.
   1. Coloque a amostra no secador e abra o frasco para injetáveis, mantendo a tampa sobre ele.
   2. Feche o secador e remova o oxigênio do tubo abrindo a tubulação de nitrogênio.
   3. Ligue a bomba de vácuo para remover o oxigênio do secador por 10 minutos.
   4. Desligue a bomba e use o botão do secador para abrir a tubulação de nitrogênio. Quando a pressão for igual à pressão atmosférica, abra cuidadosamente o secador e feche rapidamente o frasco para injetáveis.
4. Manter o coração na solução de hidrogel desgaseificada a 37 °C durante 3 h em repouso.
5. Quando o hidrogel estiver devidamente polimerizado e parecer inteiramente gelatinoso, retire cuidadosamente o coração dele e coloque-o no suporte da amostra.
6. Insira o suporte da amostra com o coração em uma das câmaras de limpeza e feche-o corretamente para evitar vazamentos da solução de limpeza.
7. Ligue o banho-maria onde o recipiente de solução de limpeza é colocado e a bomba peristáltica para iniciar a recirculação da solução de limpeza.
8. Altere a solução de limpeza no recipiente uma vez por semana para acelerar o procedimento de clarificação.

4. Coloração da membrana celular

1. Quando o coração parecer completamente clarificado, retire-o do suporte da amostra e lave-o em 50 mL de PBS aquecido por 24 h. Lavar novamente em 50 mL de PBS + 1% de Triton-X (PBS-T 1x) por 24 h.
2. Incubar a amostra em 0,01 mg/mL de Aglutinina de Gérmen de Trigo (WGA) - Alexa Fluor 633 em 3 mL de PBS-T 1x em agitação (50 rpm) à temperatura ambiente por 7 dias.
3. Após a incubação de 7 dias, lavar a amostra em 50 mL de PBS-T 1x em temperatura ambiente em agitação por 24 h.
4. Incubar a amostra em PFA a 4% por 15 min e depois lavá-la 3 vezes em PBS por 5 min cada.
   NOTA: Após esta etapa, o coração pode ser armazenado em PBS + 0,01% de NaN3 a 4 °C por vários meses.
5. Incubar o coração em concentrações crescentes de 2,2′-Tiodietanol (TDE) em 0,01 M PBS (20% e 47% TDE/PBS) por 8 h cada, até a concentração final de 68% de TDE em 0,01 M PBS para fornecer o índice de refração necessário (IR = 1,46). Este é o meio de correspondência do IR (RI-médio) para a aquisição de imagens¹⁶.

5. Montagem e aquisição do coração

NOTA: Todos os componentes do sistema óptico estão listados em detalhes na Tabela de Materiais.

1. Encha suavemente cerca de 80% da cubeta externa (quartzo, 45 mm × 45 mm × 42,5 mm) com o meio RI.
   NOTA: Aqui, é possível usar diferentes soluções não voláteis que garantem um IR de 1,46.
2. Encha suavemente a cubeta interna (quartzo, 45 mm × 12,5 mm × 12,5 mm) com o mesmo meio IR.
3. Mergulhe a amostra dentro da cubeta interna. As incubações de amostras descritas acima permitem que a amostra permaneça estável dentro do meio IR sem ser mantida.
4. Mova suavemente a amostra para o fundo da cubeta usando pinças finas e organize o coração com seu eixo longitudinal paralelo ao eixo principal da cubeta para minimizar o caminho da luz de excitação através do tecido durante a varredura.
5. Fixe suavemente o plugue sob medida acima da cubeta interna com dois parafusos.
6. Monte a amostra no estágio de microscópio usando os ímãs.
7. Traduza o estágio vertical da amostra manualmente para imergir a cubeta interna na externa.
8. Ligue a fonte de luz de excitação (comprimento de onda de 638 nm), definindo uma baixa potência (na ordem de 3 mW).
9. Mova a amostra usando o tradutor motorizado para iluminar um plano interno do tecido.
10. Ligue o software de imagem (HCImageLive) e defina o gatilho da câmera no modo externo (folha de luz) para acionar o gatilho de aquisição da câmera pelo software personalizado que controla toda a configuração.
11. Habilite o Salvamento automático no painel Configurações de digitalização e defina a pasta de saída onde as imagens precisam ser salvas.
12. Ajuste manualmente a posição da amostra no plano XY com os tradutores lineares para mover a amostra para o centro do FoV do sensor da câmera.
13. Mova a amostra ao longo do eixo Z usando o tradutor motorizado linear para identificar as bordas do coração para reconstrução tomográfica.
14. Aumente a potência do laser para ~20 mW, pronto para a sessão de imagem.
15. Inicie a aquisição tomográfica, clique no botão Iniciar no Painel de Sequência do software de imagem e, ao mesmo tempo, mova a amostra ao longo do eixo Z na velocidade constante de 6 μm/s usando o tradutor motorizado.

Resultados

A configuração de limpeza passiva desenvolvida permite obter um coração de rato adulto limpo (com uma dimensão da ordem 10 mm x 6 mm x 6 mm) em cerca de 3 meses. Todos os componentes da configuração são montados como mostrado na Figura 1. O gradiente de temperatura insignificante entre cada câmara de compensação (da ordem de 3 ° C) permite manter a temperatura em uma faixa adequada em todas as câmaras.

Discussão

Neste trabalho, uma abordagem bem-sucedida para limpar, manchar e visualizar todo o coração de um rato em alta resolução foi introduzida. Primeiramente, um protocolo de transformação tecidual (CLARITY) foi otimizado e realizado, levemente modificado para sua aplicação no tecido cardíaco. De fato, para obter uma reconstrução eficiente em 3D de todo um coração, é essencial evitar o fenômeno da dispersão da luz. A metodologia CLARITY permite-nos obter um coração intacto altamente transparente, mas requer l...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-2’ Thiodiethanol	Sigma-Aldrich	166782
Acrylamide	Bio-Rad	61-0140
AV-044 Initiator	Wako Chemicals	AVP5874
Bis-Acrylamide	Bio-Rad	161-042
Boric Acid	Sigma-Aldrich	B7901
Camera	Hamamatsu	Orca flash 4.0 v3
Camera software	Hamamatsu	HC Image
Collimating lens	Thorlabs	AC254-050-A-ML
Detection arm	Integrated optics	0638L-15A-NI-PT-NF
Excitation lens	Nikon	91863
Exteraìnal quartz cuvette	Portmann Instruments	UQ-753
Fold mirrors	Thorlabs	BBE1-E02
Galvanometric mirror	Thorlabs	GVS211/M
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HCImage Live	Hamamatsu	4.6.1.19
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Internal quartz cuvette	Portmann Instruments	UQ-204
KCl	Sigma-Aldrich	P4504
Laser source	Integrated Optics	0638L-15A-NI-PT-NF
Long-pass filter	Thorlabs	FELH0650
Magnetic base	Thorlabs	KB25/M
MgCl2	Chem-Lab	CI-1316-0250
Motorized traslator	Physisk Instrument	M-122.2DD
NaCl	Sigma-Aldrich	59888
Objective	Thorlabs	TL2X-SAP
Paraformaldehyde	Agar Scientific	R1018
Phosphate Buffer Solution	Sigma-Aldrich	P4417
Polycap AS	Whatman	2606T
Relay lens	Qioptiq	G063200000
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
Tube lens	Thorlabs	ACT508-200-A-ML
Tunable lens	Optotune	EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
Vacuum pump	KNF Neuberger Inc	N86KT.18
Water bath	Memmert	WTB