הדמיה אופטית מזוסקופית של לב עכבר שלם

Summary

אנו מדווחים על שיטה לשחזור מזוסקופי של לב העכבר כולו על ידי שילוב של התקדמות חדשה בטרנספורמציה וצביעה של רקמות עם פיתוח של מיקרוסקופ אור סרוק אקסיאלי.

Abstract

מחלות לב גנטיות ולא גנטיות יכולות לגרום לתהליכי שיפוץ חמורים בלב. שיפוץ מבני, כגון תצהיר קולגן (פיברוזיס) ואי-התאמה תאית, יכול להשפיע על ההולכה החשמלית, לגרום להפרעות אלקטרומכניות, ובסופו של דבר להוביל להפרעות קצב. מודלי החיזוי הנוכחיים של שינויים פונקציונליים אלה מבוססים על מידע מבני לא משולב וברזולוציה נמוכה. הצבת מסגרת זו בסדר גודל שונה היא מאתגרת בשל חוסר היעילות של שיטות הדמיה סטנדרטיות בביצוע הדמיה ברזולוציה גבוהה ברקמה מסיבית. בעבודה זו אנו מתארים מסגרת מתודולוגית המאפשרת הדמיה של לבבות עכברים שלמים ברזולוציה מיקרומטרית. השגת מטרה זו דרשה מאמץ טכנולוגי שבו שולבו התקדמות בטרנספורמציה של רקמות ובשיטות הדמיה. ראשית, אנו מתארים פרוטוקול CLARITY אופטימלי המסוגל להפוך לב שלם לצורה ננו-נקבובית, היברידית הידרוג'ל, נטולת שומנים, המאפשרת שקיפות גבוהה וכתמים עמוקים. לאחר מכן, מתואר מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי המסוגל להשיג במהירות תמונות של שדה ראייה מזוסקופי (בקנה מידה מ"מ) ברזולוציה של קנה מידה מיקרוני. בעקבות פרויקט mesoSPIM, המיקרוסקופ שהגה מאפשר שחזור של כל לב העכבר ברזולוציה מיקרומטרית בסריקה טומוגרפית אחת. אנו מאמינים כי מסגרת מתודולוגית זו תאפשר להבהיר את מעורבותם של אי-סדר הציטו-ארכיטקטורה בתפקוד החשמלי ותסלול את הדרך למודל מקיף המתחשב הן בנתונים הפונקציונליים והן בנתונים המבניים, ובכך יאפשר חקירה מאוחדת של הגורמים המבניים המובילים לשינויים חשמליים ומכניים לאחר שיפוץ הרקמה.

Introduction

שיפוץ מבני הקשור למחלות לב יכול להשפיע על ההולכה החשמלית ולהכניס תפקוד אלקטרומכני של האיבר ^1,2. הגישות הנוכחיות המשמשות לחיזוי שינויים תפקודיים משתמשות בדרך כלל ב-MRI וב-DT-MRI כדי לקבל שחזור כולל של תצהיר פיברוזיס, עץ כלי דם וחלוקת סיבים של הלב, והן משמשות למודלים של נתיבי התפשטות פוטנציאלית של פעולה מועדפת (APP) על פני האיבר ^3,4. אסטרטגיות אלה יכולות לספק סקירה יפה של ארגון הלב. עם זאת, הרזולוציה המרחבית שלהם אינה מספיקה כדי לחקור את ההשפעה של שיפוץ מבני על תפקוד הלב ברמה התאית.

הצבת מסגרת זו בסדר גודל שונה, שבו תאים בודדים יכולים למלא תפקידים בודדים על התפשטות פוטנציאל פעולה, היא מאתגרת. המגבלה העיקרית היא חוסר היעילות של שיטות הדמיה סטנדרטיות לביצוע הדמיה ברזולוציה גבוהה (רזולוציה מיקרומטרית) ברקמות מסיביות (בגודל סנטימטר). למעשה, הדמיית רקמות ביולוגיות בתלת-ממד ברזולוציה גבוהה מסובכת מאוד בשל אטימות הרקמות. הגישה הנפוצה ביותר לביצוע שחזורים תלת-ממדיים באיברים שלמים היא להכין חתכים דקים. עם זאת, חיתוך, הרכבה והדמיה מדויקים דורשים מאמץ וזמן משמעותיים. גישה חלופית שאינה דורשת חיתוך הדגימה היא יצירת רקמה שקופה. במהלך השנים האחרונות, מספר מתודולוגיות להבהרת רקמות הוצעו 5,6,7,8. האתגר לייצר רקמות מסיביות, שקופות ומסומנות פלואורסצנטיות הושג לאחרונה על ידי פיתוח גישות טרנספורמציה אמיתיות של רקמות (CLARITY⁹, SHIELD¹⁰). בפרט, שיטת CLARITY מבוססת על הפיכת רקמה שלמה לצורה ננו-נקבובית, הידרו-היברידית, נטולת שומנים, המאפשרת להעניק שקיפות גבוהה על ידי הסרה סלקטיבית של דו-שכבתיות של שומנים בממברנה. יש לציין כי שיטה זו נמצאה מוצלחת גם בהכנה לבבית^11,12,13,14. עם זאת, מכיוון שהלב שברירי מכדי להיות מתאים לניקוי אקטיבי, יש לנקות אותו באמצעות הגישה הפסיבית, הדורשת זמן רב כדי להעניק שקיפות מלאה.

בשילוב עם טכניקות הדמיה מתקדמות כמו מיקרוסקופיה של יריעות אור, ל-CLARITY יש פוטנציאל לצלם רקמות לב מסיביות בתלת-ממד ברזולוציה מיקרומטרית. במיקרוסקופיה של יריעות אור, הארת הדגימה מתבצעת עם יריעה דקה של אור המוגבלת במישור המוקד של מטרת האיתור. הפליטה הפלואורסצנטית נאספת לאורך ציר בניצב למישור התאורה¹⁵. ארכיטקטורת הגילוי דומה למיקרוסקופיית שדה רחב, מה שהופך את הרכישה למהירה הרבה יותר ממיקרוסקופים לסריקת לייזר. העברת הדגימה דרך יריעת האור מאפשרת קבלת טומוגרפיה מלאה של דגימות גדולות, עד דגימות בגודל סנטימטר. עם זאת, בשל התכונות הפנימיות של קרן גאוס, ניתן לקבל יריעת אור דקה מאוד (בסדר גודל של כמה מיקרונים) רק עבור הרחבה מרחבית מוגבלת, ובכך להגביל באופן דרסטי את שדה הראייה (FoV). לאחרונה הוצגה ערכת עירור חדשנית כדי להתגבר על מגבלה זו ולהחיל הדמיה מוחית, המאפשרת שחזורים תלת-ממדיים ברזולוציה איזוטרופית¹⁶.

במאמר זה מוצגת גישת סליקה פסיבית, המאפשרת הפחתה משמעותית של תזמון הסליקה הנדרש על ידי פרוטוקול CLARITY. המסגרת המתודולוגית המתוארת כאן מאפשרת לשחזר לב עכבר שלם ברזולוציה מיקרומטרית בסריקה טומוגרפית אחת עם זמן רכישה בסדר גודל של דקות.

Protocol

כל הטיפול והנהלים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות דירקטיבה 2010/63/EU של הפרלמנט האירופי להגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות והתאימו לעקרונות ולתקנות של משרד הבריאות האיטלקי. פרוטוקול הניסוי אושר על ידי משרד הבריאות האיטלקי (פרוטוקול מספר 647/2015-PR). כל בעלי החיים סופקו על ידי ENVIGO, איטליה. בניסויים אלה נעשה שימוש ב-5 עכברי C57BL/6J זכרים בני 6 חודשים.

1. הכנת פתרון

1. יש להכין 4% פרפורמלדהיד (PFA) בתמיסת מלח ספוגת פוספט (PBS) (pH 7.6) במכסה המנוע הכימי. אחסן את 4% PFA aliquots ב -20 °C במשך מספר חודשים.
2. הכן תמיסת הידרוג'ל: יש לערבב 4% אקרילאמיד, 0.05% ביס-אקרילאמיד, 0.25% ייזום AV-044 ב-0.01 M PBS במכסה מנוע כימי. שמור את הריאגנטים ואת הפתרון על הקרח במהלך כל ההכנה. אחסנו את ההידרוג'ל בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים.
3. הכן פתרון ניקוי: לערבב 200 mM חומצה בורית, 4% נתרן דודציל-סולפט (SDS) במים deionized; pH 8.6 במכסה מנוע כימי. אחסן את התמיסה בין 21-37 מעלות צלזיוס כדי למנוע משקעי SDS.
4. הכן תמיסת טירודה טרייה ביום הניסוי: הוסף 10 mM גלוקוז, 10 mM HEPES, 113 mM NaCl, 1.2 mM MgCl₂, ו 4.7 mM KCl; טיטרט ל-pH 7.4 באמצעות 1 M NaOH.

2. בידוד לב

1. להזריק 0.1 מ"ל של 500 I.U. הפרין תת עורית 30 דקות לפני הליך בידוד הלב.
2. מלאו מזרק של 30 מ"ל ושלוש צלחות פטרי בקוטר 6 ס"מ בתמיסת טיירוד טרייה. יוצרים בקע קטן (3-4 מ"מ עומק) על גבול אחת מצלחות הפטרי ומניחים אותו מתחת למיקרוסקופ סטריאוסקופי.
3. מקבעים צינורית בקוטר 1 מ"מ למזרק ומכניסים אותה לבקע של צלחת פטרי. ודא שאין בועות אוויר במזרק.
4. מלאו מזרק של 20 מ"ל ב-4% PFA ושמרו אותו במכסה המנוע הכימי. הכינו צלחת פטרי ריקה מתחת למכסה המנוע.
5. מרדימים את העכבר ב-3% איזופלורן/חמצן בקצב זרימה של 1.0 ליטר/דקה ומקריבים אותו על ידי נקע צוואר הרחם בהתאם לכללי רווחת בעלי החיים שבתוקף.
6. לאחר ההקרבה, הסר את הפרווה מעל החזה ופתח את החזה כדי לקבל גישה מלאה ללב.
7. לבודד את הלב, לטבול אותו בצלחת פטרי מלא בעבר עם 50 מ"ל של תמיסת טירוד. השתמש במספריים כירורגיים כדי לחתוך את אבי העורקים מיד ליד קשת אבי העורקים כדי לחשוף את הלב.
8. להעביר את הלב תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי בזהירות לבצע את cannulation. אין להכניס את הצינורית עמוק מדי לאבי העורקים (לא יותר מ-2 מ"מ) כדי למנוע נזק לרקמות.
9. השתמשו במעט מהדק ותפר (גודל 5/0) כדי לקבע את הלב לצינורית.
10. למזג את הלב עם 30 מ"ל של תמיסת Tyrode עם לחץ קבוע של 10 מ"ל / דקה כדי להסיר דם מן כלי הדם.
11. מנתקים את הצינורית מהמזרק ומניחים את הלב בצלחת הפטרי המלאה בתמיסת טירוד. היזהר לא יש בועות אוויר בצינורית; אחרת, הסר את בועות האוויר כראוי.
12. חברו את מזרק ה-20 מ"ל המלא ב-4% PFA קר לצינורית והכניסו את הלב לאותו לחץ קבוע.
13. לדגום את הלב ב 10 מ"ל של 4% PFA ב 4 מעלות צלזיוס בלילה (O / N). כדי למנוע השפלה של רקמות, בצע את שלבים 2.6-2.13 בזמן הקצר ביותר האפשרי.

3. ניקוי לב

1. למחרת, לשטוף את הלב ב 0.01 M PBS 3 פעמים ב 4 °C (64 °F) במשך 15 דקות.
   הערה: לאחר שלב זה, הלב יכול להיות מאוחסן PBS + 0.01% נתרן אזיד (NaN3) ב 4 °C במשך מספר חודשים.
2. לדגום את הלב ב 30 מ"ל של תמיסת הידרוג'ל ברעידות (15 סל"ד) ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים.
3. דגה את הדגימה בטמפרטורת החדר באמצעות מייבש, משאבת ואקום ומערכת צינורות המחברת את המייבש הן למשאבה והן לצינור חנקן.
   1. מניחים את הדגימה במייבש ופותחים את הבקבוקון, תוך שמירה על הפקק עליו.
   2. סגרו את המייבש והוציאו את החמצן מהצינור על ידי פתיחת צינור החנקן.
   3. הפעילו את משאבת הוואקום כדי להוציא את החמצן מהמייבש למשך 10 דקות.
   4. כבו את המשאבה והשתמשו בידית המייבש כדי לפתוח את צינור החנקן. ברגע שהלחץ שווה ללחץ האטמוספרי, פתחו בזהירות את המייבש וסגרו במהירות את הבקבוקון.
4. שמור את הלב בתמיסת הידרוג'ל degassed ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות במנוחה.
5. כאשר ההידרוג'ל עובר פולימריזציה נכונה ונראה ג'לטיני לחלוטין, הסר בזהירות את הלב ממנו והנח אותו במחזיק הדגימה.
6. הכנס את מחזיק הדגימה עם הלב באחד מתאי הניקוי וסגור אותו כראוי כדי למנוע דליפות של פתרון הסליקה.
7. הפעל את אמבט המים שבו ממוקם מיכל תמיסת הניקוי ואת המשאבה הפריסטלטית כדי להתחיל את סירקולציה של פתרון הסליקה.
8. שנה את תמיסת הסליקה במיכל פעם בשבוע כדי לזרז את הליך ההבהרה.

4. מכתים את קרום התא

1. ברגע שהלב נראה מובהר לחלוטין, הסר אותו ממחזיק הדגימה ושטוף אותו ב -50 מ"ל של PBS מחומם במשך 24 שעות. יש לשטוף שוב ב-50 מ"ל של PBS + 1% של Triton-X (PBS-T 1x) למשך 24 שעות.
2. דגירה של הדגימה ב-0.01 מ"ג/מ"ל נבט חיטה אגלוטינין (WGA) - Alexa Fluor 633 ב-3 מ"ל של PBS-T 1x ברעידות (50 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך 7 ימים.
3. לאחר הדגירה בת 7 הימים, יש לשטוף את הדגימה ב-50 מ"ל של PBS-T 1x בטמפרטורת החדר בטלטול במשך 24 שעות.
4. לדגום את הדגימה ב 4% PFA במשך 15 דקות ולאחר מכן לשטוף אותו 3 פעמים PBS במשך 5 דקות כל אחד.
   הערה: לאחר שלב זה, הלב יכול להיות מאוחסן PBS + 0.01% NaN3 ב 4 °C במשך מספר חודשים.
5. לדגום את הלב בריכוזים הולכים וגדלים של 2,2′-תיומיאתנול (TDE) ב-0.01 M PBS (20% ו-47% TDE/PBS) למשך 8 שעות כל אחד, עד לריכוז הסופי של 68% TDE ב-0.01 M PBS כדי לספק את מקדם השבירה הנדרש (RI = 1.46). זהו המדיום התואם RI (RI-medium) לרכישת תמונות¹⁶.

5. הרכבה ורכישה של הלב

הערה: כל רכיבי המערכת האופטית מפורטים בפירוט בטבלת החומרים.

1. מלאו בעדינות כ-80% מהקובט החיצוני (קוורץ, 45 מ"מ × 45 מ"מ × 42.5 מ"מ) במדיום RI.
   הערה: כאן, ניתן להשתמש בפתרונות לא נדיפים שונים המבטיחים RI של 1.46.
2. מלאו בעדינות את הקובט הפנימי (קוורץ, 45 מ"מ × 12.5 מ"מ × 12.5 מ"מ) באותו מדיום RI.
3. לטבול את הדגימה בתוך הקובט הפנימי. הדגירה של הדגימה שתוארה לעיל מאפשרת לדגימה להישאר יציבה בתוך מדיום ה-RI מבלי להיות מוחזקת.
4. הזיזו בעדינות את הדגימה לתחתית הקובטה באמצעות פינצטה דקה וסדרו את הלב עם ציר האורך שלו במקביל לציר הראשי של הקובט כדי למזער את נתיב אור העירור על פני הרקמה במהלך הסריקה.
5. תקן בעדינות את התקע המותאם מעל הקובט הפנימי באמצעות שני ברגים.
6. הרכיבו את הדגימה לשלב המיקרוסקופ באמצעות המגנטים.
7. תרגם את שלב הדגימה האנכי באופן ידני כדי לטבול את הקובטה הפנימית לתוך החיצונית.
8. הפעל את מקור האור העירור (אורך גל של 638 ננומטר), הגדרת הספק נמוך (בסדר גודל של 3 mW).
9. הזז את הדגימה באמצעות המתרגם הממונע כדי להאיר מישור פנימי של הרקמה.
10. הפעל את תוכנת ההדמיה (HCImageLive) והגדר את ההדק של המצלמה למצב חיצוני (גיליון אור) כדי להניע את הדק הרכישה של המצלמה על-ידי התוכנה המותאמת אישית השולטת בהגדרה כולה.
11. הפעל שמירה אוטומטית בחלונית Scan Settings והגדר את תיקיית הפלט שבה יש לשמור את התמונות.
12. כוונן ידנית את מיקום הדגימה במישור XY עם המתרגמים הלינאריים כדי להזיז את הדגימה למרכז ה- FoV של חיישן המצלמה.
13. הזז את הדגימה לאורך ציר Z באמצעות המתרגם הממונע הליניארי כדי לזהות גבולות לב לצורך שחזור טומוגרפי.
14. הגדל את עוצמת הלייזר ל~20 mW, מוכן לסשן ההדמיה.
15. התחל את הרכישה הטומוגרפית, לחץ על לחצן התחל בלוח הרצף של תוכנת ההדמיה, ובמקביל הזז את הדגימה לאורך ציר Z במהירות קבועה של 6 מיקרומטר לשנייה באמצעות המתרגם הממונע.

תוצאות

מערך הסליקה הפסיבית שפותח מאפשר לקבל לב עכבר בוגר מנוקה (עם ממד של הסדר 10 מ"מ x 6 מ"מ x 6 מ"מ) תוך כ -3 חודשים. כל רכיבי ההתקנה מותקנים כפי שמוצג באיור 1. שיפוע הטמפרטורה הזניח בין כל תא ניקוי (בסדר גודל של 3 מעלות צלזיוס) מאפשר שמירה על הטמפרטורה בטווח תקין בכל התאים.

Discussion

בעבודה זו הוצגה גישה מוצלחת לניקוי, הכתמה ותמונה של לב עכבר שלם ברזולוציה גבוהה. ראשית, פרוטוקול טרנספורמציה של רקמות (CLARITY) עבר אופטימיזציה ובוצע, שונה מעט ליישומו על רקמת הלב. ואכן, כדי להשיג שחזור יעיל בתלת מימד של לב שלם, חיוני למנוע את תופעת פיזור האור. מתודולוגיית CLARITY מאפשרת לנו להשיג ל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-2’ Thiodiethanol	Sigma-Aldrich	166782
Acrylamide	Bio-Rad	61-0140
AV-044 Initiator	Wako Chemicals	AVP5874
Bis-Acrylamide	Bio-Rad	161-042
Boric Acid	Sigma-Aldrich	B7901
Camera	Hamamatsu	Orca flash 4.0 v3
Camera software	Hamamatsu	HC Image
Collimating lens	Thorlabs	AC254-050-A-ML
Detection arm	Integrated optics	0638L-15A-NI-PT-NF
Excitation lens	Nikon	91863
Exteraìnal quartz cuvette	Portmann Instruments	UQ-753
Fold mirrors	Thorlabs	BBE1-E02
Galvanometric mirror	Thorlabs	GVS211/M
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HCImage Live	Hamamatsu	4.6.1.19
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Internal quartz cuvette	Portmann Instruments	UQ-204
KCl	Sigma-Aldrich	P4504
Laser source	Integrated Optics	0638L-15A-NI-PT-NF
Long-pass filter	Thorlabs	FELH0650
Magnetic base	Thorlabs	KB25/M
MgCl2	Chem-Lab	CI-1316-0250
Motorized traslator	Physisk Instrument	M-122.2DD
NaCl	Sigma-Aldrich	59888
Objective	Thorlabs	TL2X-SAP
Paraformaldehyde	Agar Scientific	R1018
Phosphate Buffer Solution	Sigma-Aldrich	P4417
Polycap AS	Whatman	2606T
Relay lens	Qioptiq	G063200000
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
Tube lens	Thorlabs	ACT508-200-A-ML
Tunable lens	Optotune	EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
Vacuum pump	KNF Neuberger Inc	N86KT.18
Water bath	Memmert	WTB