Mesoskopische optische Bildgebung des ganzen Mausherzens

Zusammenfassung

Wir berichten über eine Methode zur mesoskopischen Rekonstruktion des gesamten Mausherzens durch die Kombination neuer Fortschritte in der Gewebetransformation und Färbung mit der Entwicklung eines axial gescannten Lichtblattmikroskops.

Zusammenfassung

Sowohl genetische als auch nicht-genetische Herzerkrankungen können schwere Umbauprozesse im Herzen verursachen. Strukturelle Umbauten, wie Kollagenablagerung (Fibrose) und zelluläre Fehlausrichtung, können die elektrische Leitung beeinträchtigen, elektromechanische Funktionsstörungen verursachen und schließlich zu Arrhythmien führen. Aktuelle Vorhersagemodelle dieser funktionellen Veränderungen basieren auf nicht integrierten und niedrig aufgelösten Strukturinformationen. Diesen Rahmen auf eine andere Größenordnung zu legen, ist aufgrund der Unwirksamkeit von Standard-Bildgebungsmethoden bei der Durchführung hochauflösender Bildgebung in massivem Gewebe eine Herausforderung. In dieser Arbeit beschreiben wir einen methodischen Rahmen, der die Abbildung ganzer Mausherzen mit mikrometrischer Auflösung ermöglicht. Die Erreichung dieses Ziels erforderte eine technologische Anstrengung, bei der Fortschritte bei der Gewebetransformation und bildgebenden Verfahren kombiniert wurden. Zunächst beschreiben wir ein optimiertes CLARITY-Protokoll, das in der Lage ist, ein intaktes Herz in eine nanoporöse, hydrogelhybridisierte, lipidfreie Form umzuwandeln, die eine hohe Transparenz und tiefe Färbung ermöglicht. Dann wird ein Fluoreszenz-Lichtblattmikroskop beschrieben, das in der Lage ist, schnell Bilder eines mesoskopischen Sichtfeldes (mm-Skala) mit der Auflösung im Mikrometerbereich aufzunehmen. Im Anschluss an das mesoSPIM-Projekt ermöglicht das konzipierte Mikroskop die Rekonstruktion des gesamten Mausherzens mit mikrometrischer Auflösung in einem einzigen tomographischen Scan. Wir glauben, dass dieser methodische Rahmen es ermöglichen wird, die Beteiligung der Zytoarchitektur an den elektrischen Dysfunktionen zu klären und den Weg für ein umfassendes Modell zu ebnen, das sowohl die funktionellen als auch die strukturellen Daten berücksichtigt und so eine einheitliche Untersuchung der strukturellen Ursachen ermöglicht, die zu elektrischen und mechanischen Veränderungen nach dem Gewebeumbau führen.

Einleitung

Strukturumbau im Zusammenhang mit Herzerkrankungen kann die elektrische Leitung beeinträchtigen und elektromechanische Funktionsstörungen des Organs ^1,2 verursachen. Aktuelle Ansätze zur Vorhersage funktioneller Veränderungen verwenden häufig MRT und DT-MRT, um eine Gesamtrekonstruktion der Fibroseablagerung, des Gefäßbaums und der Faserverteilung des Herzens zu erhalten, und sie werden verwendet, um APP-Pfade (Preferential Action Potential Propagation) über das Organ ^3,4 zu modellieren. Diese Strategien können einen schönen Überblick über die Herzorganisation geben. Ihre räumliche Auflösung reicht jedoch nicht aus, um die Auswirkungen des strukturellen Umbaus auf die Herzfunktion auf zellulärer Ebene zu untersuchen.

Es ist eine Herausforderung, dieses Framework in einer anderen Größenordnung zu platzieren, in der einzelne Zellen individuelle Rollen bei der Ausbreitung des Aktionspotentials spielen können. Die Haupteinschränkung ist die Ineffizienz von Standard-Bildgebungsmethoden zur Durchführung hochauflösender Bildgebung (mikrometrische Auflösung) in massiven (zentimetergroßen) Geweben. Tatsächlich ist die Abbildung biologischer Gewebe in 3D mit hoher Auflösung aufgrund der Undurchsichtigkeit des Gewebes sehr kompliziert. Der gebräuchlichste Ansatz zur Durchführung von 3D-Rekonstruktionen in ganzen Organen ist die Vorbereitung von Dünnschnitten. Präzises Schneiden, Zusammensetzen und Abbilden erfordern jedoch erheblichen Aufwand und Zeit. Ein alternativer Ansatz, bei dem die Probe nicht geschnitten werden muss, besteht darin, ein transparentes Gewebe zu erzeugen. In den letzten Jahren wurden mehrere Methoden zur Klärung von Geweben vorgeschlagen 5,6,7,8. Die Herausforderung, massive, transparente und fluoreszenzmarkierte Gewebe herzustellen, wurde kürzlich durch die Entwicklung echter Gewebetransformationsansätze (CLARITY⁹, SHIELD¹⁰) erreicht. Insbesondere basiert die CLARITY-Methode auf der Umwandlung eines intakten Gewebes in eine nanoporöse, hydrogel-hybridisierte, lipidfreie Form, die es ermöglicht, durch die selektive Entfernung von Membranlipiddoppelschichten eine hohe Transparenz zu verleihen. Bemerkenswerterweise hat sich diese Methode auch in der Herzvorbereitung als erfolgreich erwiesen 11,12,13,14. Da das Herz jedoch zu zerbrechlich ist, um für eine aktive Klärung geeignet zu sein, muss es mit dem passiven Ansatz gereinigt werden, der lange Zeit benötigt, um vollständige Transparenz zu verleihen.

In Kombination mit fortschrittlichen bildgebenden Verfahren wie der Lichtblattmikroskopie hat CLARITY das Potenzial, massives 3D-Herzgewebe mit mikrometrischer Auflösung abzubilden. In der Lichtblattmikroskopie wird die Beleuchtung der Probe mit einer dünnen Lichtschicht durchgeführt, die in der Brennebene des Detektionsobjektivs eingeschlossen ist. Die Fluoreszenzemission wird entlang einer Achse senkrecht zur Beleuchtungsebene¹⁵ gesammelt. Die Detektionsarchitektur ähnelt der Weitfeldmikroskopie, wodurch die Erfassung viel schneller ist als bei Laserscanning-Mikroskopen. Das Bewegen der Probe durch die Lichtschicht ermöglicht eine vollständige Tomographie von großen Proben, bis zu zentimetergroßen Proben. Aufgrund der intrinsischen Eigenschaften des Gaußstrahls ist es jedoch möglich, ein sehr dünnes (in der Größenordnung von wenigen Mikrometern) Lichtblatt nur für eine begrenzte räumliche Ausdehnung zu erhalten, wodurch das Sichtfeld (FoV) drastisch eingeschränkt wird. Vor kurzem wurde ein neuartiges Anregungsschema eingeführt, um diese Einschränkung zu überwinden, und für die Bildgebung des Gehirns angewendet, was 3D-Rekonstruktionen mit isotroper Auflösung ermöglicht¹⁶.

In diesem Beitrag wird ein passiver Clearingansatz vorgestellt, der eine signifikante Reduzierung des vom CLARITY-Protokoll benötigten Clearing-Timings ermöglicht. Der hier beschriebene methodische Rahmen erlaubt es, ein ganzes Mausherz mit mikrometrischer Auflösung in einem einzigen tomographischen Scan mit einer Erfassungszeit in der Größenordnung von Minuten zu rekonstruieren.

Protokoll

Alle Tierbehandlungen und -verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere durchgeführt und entsprachen den Grundsätzen und Vorschriften des italienischen Gesundheitsministeriums. Das Versuchsprotokoll wurde vom italienischen Gesundheitsministerium genehmigt (Protokollnummer 647/2015-PR). Alle Tiere wurden von ENVIGO, Italien, zur Verfügung gestellt. Für diese Experimente wurden 5 männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 6 Monaten verwendet.

1. Lösungsvorbereitung

1. Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,6) in einer chemischen Haube vor. Lagern Sie die 4%igen PFA-Aliquots mehrere Monate bei -20 °C.
2. Hydrogel-Lösung vorbereiten: Mischen Sie 4% Acrylamid, 0,05% Bis-Acrylamid, 0,25% Initiatior AV-044 in 0,01 M PBS in einer chemischen Haube. Bewahren Sie die Reagenzien und die Lösung während der gesamten Zubereitung auf Eis auf. Lagern Sie die Hydrogel-Aliquots mehrere Monate bei -20 °C.
3. Clearing-Lösung vorbereiten: 200 mM Borsäure, 4% Natriumdodecylsulfat (SDS) in entionisiertem Wasser mischen; pH 8,6 in einer chemischen Haube. Lagern Sie die Lösung zwischen 21-37 °C, um SDS-Niederschläge zu vermeiden.
4. Bereiten Sie am Tag des Experiments eine frische Tyrode-Lösung vor: Fügen Sie 10 mM Glucose, 10 mM HEPES, 113 mM NaCl, 1,2 mM MgCl₂ und 4,7 mM KCl hinzu; titrieren auf pH 7,4 mit 1 M NaOH.

2. Herzisolation

1. Injizieren Sie 0,1 ml 500 I.E. Heparin subkutan 30 min vor der Herzisolierung.
2. Füllen Sie eine 30-ml-Spritze und drei 6-cm-Petrischalen mit frischer Tyrode-Lösung. Machen Sie einen kleinen Riss (3-4 mm tief) am Rand einer der Petrischalen und legen Sie ihn unter ein stereoskopisches Mikroskop.
3. Befestigen Sie eine Kanüle mit einem Durchmesser von 1 mm an der Spritze und führen Sie sie in den Riss der Petrischale ein. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Spritze befinden.
4. Füllen Sie eine 20-ml-Spritze mit 4% PFA und bewahren Sie sie in der chemischen Haube auf. Bereiten Sie eine leere Petrischale unter der Haube vor.
5. Betäuben Sie die Maus mit 3% Isofluran/Sauerstoff bei einer Flussrate von 1,0 l/min und opfern Sie sie durch zervikale Dislokation gemäß den geltenden Tierschutzbestimmungen.
6. Entfernen Sie nach dem Opfer das Fell über der Brust und öffnen Sie die Brust, um vollen Zugang zum Herzen zu haben.
7. Isolieren Sie das Herz, tauchen Sie es in die Petrischale, die zuvor mit 50 ml Tyrode Solution gefüllt war. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um die Aorta unmittelbar in der Nähe des Aortenbogens zu schneiden, um das Herz freizulegen.
8. Übertragen Sie das Herz unter ein stereoskopisches Mikroskop und führen Sie die Kanülierung sorgfältig durch. Führen Sie die Kanüle nicht zu tief in die Aorta ein (nicht mehr als 2 mm), um Gewebeschäden zu vermeiden.
9. Verwenden Sie eine kleine Klemme und eine Naht (Größe 5/0), um das Herz an der Kanüle zu befestigen.
10. Durchbluten Sie das Herz mit 30 ml der Tyrode-Lösung mit einem konstanten Druck von 10 ml / min, um Blut aus den Gefäßen zu entfernen.
11. Lösen Sie die Kanüle von der Spritze und legen Sie das Herz in die mit Tyrodenlösung gefüllte Petrischale. Achten Sie darauf, keine Luftblasen in der Kanüle zu haben; Andernfalls entfernen Sie die Luftblasen ordnungsgemäß.
12. Befestigen Sie die 20-ml-Spritze, die mit kaltem 4% PFA gefüllt ist, an der Kanüle und perfundiert Sie das Herz mit dem gleichen konstanten Druck.
13. Inkubieren Sie das Herz in 10 ml 4% PFA bei 4 °C über Nacht (O/N). Um einen Gewebeabbau zu vermeiden, führen Sie die Schritte 2.6-2.13 in kürzester Zeit durch.

3. Herzreinigung

1. Am nächsten Tag das Herz in 0,01 M PBS 3 mal bei 4 °C für 15 min waschen.
   HINWEIS: Nach diesem Schritt kann das Herz in PBS + 0,01% Natriumazid (NaN3) bei 4 °C für mehrere Monate gelagert werden.
2. Das Herz in 30 ml Hydrogel-Lösung unter Schütteln (15 U/min) bei 4 °C für 3 Tage inkubieren.
3. Entgasen Sie die Probe bei Raumtemperatur mit einem Trockner, einer Vakuumpumpe und einem Rohrsystem, das den Trockner sowohl mit der Pumpe als auch mit einer Stickstoffleitung verbindet.
   1. Legen Sie die Probe in den Trockner und öffnen Sie die Durchstechflasche, wobei Sie die Kappe darauf halten.
   2. Schließen Sie den Trockner und entfernen Sie den Sauerstoff aus dem Rohr, indem Sie die Stickstoffleitung öffnen.
   3. Schalten Sie die Vakuumpumpe ein, um den Sauerstoff für 10 Minuten aus dem Trockner zu entfernen.
   4. Schalten Sie die Pumpe aus und verwenden Sie den Knopf des Trockners, um die Stickstoffleitung zu öffnen. Sobald der Druck dem atmosphärischen Druck entspricht, öffnen Sie vorsichtig den Trockner und schließen Sie die Durchstechflasche schnell.
4. Halten Sie das Herz in der entgasten Hydrogel-Lösung bei 37 °C für 3 h in Ruhe.
5. Wenn das Hydrogel richtig polymerisiert ist und vollständig gallertartig erscheint, entfernen Sie vorsichtig das Herz davon und legen Sie es in den Probenhalter.
6. Führen Sie den Probenhalter mit dem Herzen in eine der Clearingkammern ein und schließen Sie ihn ordnungsgemäß, um ein Auslaufen der Clearing-Lösung zu vermeiden.
7. Schalten Sie das Wasserbad ein, in dem sich der Klärlösungsbehälter befindet, und die Schlauchpumpe, um die Rezirkulation der Klärlösung zu starten.
8. Wechseln Sie die Clearinglösung im Behälter einmal pro Woche, um den Klärungsprozess zu beschleunigen.

4. Zellmembranfärbung

1. Sobald das Herz vollständig geklärt erscheint, nehmen Sie es aus dem Probenhalter und waschen Sie es in 50 ml aufgewärmtem PBS für 24 Stunden. Erneut in 50 ml PBS + 1% Triton-X (PBS-T 1x) für 24 h waschen.
2. Inkubieren Sie die Probe in 0,01 mg/ml Weizenkeimagglutinin (WGA) - Alexa Fluor 633 in 3 ml PBS-T 1x im Schütteln (50 U/min) bei Raumtemperatur für 7 Tage.
3. Nach der 7-tägigen Inkubation waschen Sie die Probe in 50 ml PBS-T 1x bei Raumtemperatur in Schütteln für 24 h.
4. Inkubieren Sie die Probe in 4% PFA für 15 min und waschen Sie sie dann 3 mal in PBS für jeweils 5 min.
   HINWEIS: Nach diesem Schritt kann das Herz in PBS + 0,01% NaN3 bei 4 °C für mehrere Monate gelagert werden.
5. Das Herz wird in steigenden Konzentrationen von 2,2′-Thiodiethanol (TDE) in 0,01 M PBS (20% und 47% TDE/PBS) für jeweils 8 h bis zur Endkonzentration von 68% TDE in 0,01 M PBS inkubiert, um den erforderlichen Brechungsindex (RI = 1,46) zu erhalten. Dies ist das RI-Matching-Medium (RI-Medium) zur Aufnahme von Bildern¹⁶.

5. Herzmontage und -erfassung

HINWEIS: Alle Komponenten des optischen Systems sind in der Materialtabelle detailliert aufgeführt.

1. Füllen Sie ca. 80% der äußeren Küvette (Quarz, 45 mm × 45 mm × 42,5 mm) vorsichtig mit dem RI-Medium.
   HINWEIS: Hier ist es möglich, verschiedene nichtflüchtige Lösungen zu verwenden, die eine RI von 1,46 garantieren.
2. Füllen Sie die interne Küvette (Quarz, 45 mm × 12,5 mm × 12,5 mm) vorsichtig mit dem gleichen RI-Medium.
3. Tauchen Sie die Probe in die interne Küvette. Die oben beschriebenen Probeninkubationen ermöglichen es, dass die Probe im RI-Medium stabil bleibt, ohne gehalten zu werden.
4. Bewegen Sie die Probe vorsichtig mit einer dünnen Pinzette auf den Boden der Küvette und ordnen Sie das Herz mit seiner Längsachse parallel zur Hauptachse der Küvette an, um den Anregungslichtweg über das Gewebe während des Scannens zu minimieren.
5. Befestigen Sie den maßgeschneiderten Stecker vorsichtig mit zwei Schrauben über der Innenküvette.
6. Montieren Sie die Probe mit den Magneten auf dem Mikroskoptisch.
7. Übersetzen Sie den vertikalen Probentisch manuell, um die interne Küvette in die externe einzutauchen.
8. Schalten Sie die Anregungslichtquelle (Wellenlänge von 638 nm) ein und stellen Sie eine niedrige Leistung ein (in der Größenordnung von 3 mW).
9. Bewegen Sie die Probe mit dem motorisierten Übersetzer, um eine innere Ebene des Gewebes zu beleuchten.
10. Schalten Sie die Imaging-Software (HCImageLive) ein und stellen Sie den Kamera-Trigger auf External (Light-Sheet) - Modus ein, um den Erfassungstrigger der Kamera durch die benutzerdefinierte Software zu steuern, die das gesamte Setup steuert.
11. Aktivieren Sie die automatische Speicherung im Bedienfeld " Scaneinstellungen " und legen Sie den Ausgabeordner fest, in dem die Bilder gespeichert werden sollen.
12. Stellen Sie die Probenposition in der XY-Ebene manuell mit den linearen Übersetzern ein, um die Probe in die Mitte des FoV des Kamerasensors zu bewegen.
13. Bewegen Sie die Probe mit dem linearen motorisierten Übersetzer entlang der Z-Achse, um Herzgrenzen für die tomographische Rekonstruktion zu identifizieren.
14. Erhöhen Sie die Laserleistung auf ~20 mW, bereit für die Bildgebungssitzung.
15. Starten Sie die tomographische Erfassung, klicken Sie auf die Schaltfläche Start im Sequence Panel der Imaging-Software und bewegen Sie gleichzeitig die Probe mit der konstanten Geschwindigkeit von 6 μm/s mit dem motorisierten Übersetzer entlang der Z-Achse.

Ergebnisse

Das entwickelte passive Clearing-Setup ermöglicht es, in etwa 3 Monaten ein freies erwachsenes Mausherz (mit einer Dimension der Größenordnung von 10 mm x 6 mm x 6 mm) zu erhalten. Alle Komponenten des Setups sind wie in Abbildung 1 dargestellt montiert. Der vernachlässigbare Temperaturgradient zwischen den einzelnen Räumkammern (in der Größenordnung von 3 °C) ermöglicht es, die Temperatur in einem angemessenen Bereich über alle Kammern hinweg zu halten.

Diskussion

In dieser Arbeit wurde ein erfolgreicher Ansatz vorgestellt, um ein ganzes Mausherz in hoher Auflösung zu klären, zu färben und abzubilden. Zunächst wurde ein Gewebetransformationsprotokoll (CLARITY) optimiert und durchgeführt, leicht modifiziert für seine Anwendung auf das Herzgewebe. Um eine effiziente Rekonstruktion eines ganzen Herzens in 3D zu erhalten, ist es wichtig, das Phänomen der Lichtstreuung zu verhindern. Die CLARITY-Methodik ermöglicht es uns, ein hochtransparentes intaktes Herz zu erhalten, erford...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-2’ Thiodiethanol	Sigma-Aldrich	166782
Acrylamide	Bio-Rad	61-0140
AV-044 Initiator	Wako Chemicals	AVP5874
Bis-Acrylamide	Bio-Rad	161-042
Boric Acid	Sigma-Aldrich	B7901
Camera	Hamamatsu	Orca flash 4.0 v3
Camera software	Hamamatsu	HC Image
Collimating lens	Thorlabs	AC254-050-A-ML
Detection arm	Integrated optics	0638L-15A-NI-PT-NF
Excitation lens	Nikon	91863
Exteraìnal quartz cuvette	Portmann Instruments	UQ-753
Fold mirrors	Thorlabs	BBE1-E02
Galvanometric mirror	Thorlabs	GVS211/M
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HCImage Live	Hamamatsu	4.6.1.19
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Internal quartz cuvette	Portmann Instruments	UQ-204
KCl	Sigma-Aldrich	P4504
Laser source	Integrated Optics	0638L-15A-NI-PT-NF
Long-pass filter	Thorlabs	FELH0650
Magnetic base	Thorlabs	KB25/M
MgCl2	Chem-Lab	CI-1316-0250
Motorized traslator	Physisk Instrument	M-122.2DD
NaCl	Sigma-Aldrich	59888
Objective	Thorlabs	TL2X-SAP
Paraformaldehyde	Agar Scientific	R1018
Phosphate Buffer Solution	Sigma-Aldrich	P4417
Polycap AS	Whatman	2606T
Relay lens	Qioptiq	G063200000
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
Tube lens	Thorlabs	ACT508-200-A-ML
Tunable lens	Optotune	EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
Vacuum pump	KNF Neuberger Inc	N86KT.18
Water bath	Memmert	WTB