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要約

我々は、組織形質転換と染色の新たな進歩と軸走査型ライトシート顕微鏡の開発を組み合わせることにより、マウス心臓全体のメゾスコピック再構成法を報告する。

要約

遺伝性および非遺伝性の両方の心臓病は、心臓に重度のリモデリングプロセスを引き起こす可能性があります。コラーゲン沈着(線維症)や細胞のずれなどの構造リモデリングは、電気伝導に影響を及ぼし、電気機械的機能障害を引き起こし、最終的には不整脈を引き起こす可能性があります。これらの機能変化の現在の予測モデルは、統合されていない低解像度の構造情報に基づいています。このフレームワークを異なる桁数に配置することは、大規模な組織で高解像度イメージングを実行する際の標準的なイメージング方法の非効率性のために困難です。この研究では、マイクロメートル分解能でマウス心臓全体をイメージングできる方法論的フレームワークについて説明します。この目標を達成するには、組織形質転換とイメージング方法の進歩を組み合わせた技術的努力が必要でした。まず、無傷の心臓をナノポーラスでヒドロゲルハイブリダイズした脂質フリーの形態に変換できる最適化されたCLARITYプロトコルについて説明し、高い透明性と深い染色を可能にします。次に、ミクロンスケールの分解能でメゾスコピック視野(mmスケール)の画像を高速に取得できる蛍光光シート顕微鏡について説明する。mesoSPIMプロジェクトに続いて、考案された顕微鏡は、1回の断層撮影スキャンでマイクロメートル分解能でマウス心臓全体を再構築することを可能にします。この方法論的枠組みにより、電気機能障害における細胞構造の混乱の関与を明らかにし、機能データと構造データの両方を考慮した包括的なモデルへの道を開き、組織リモデリング後の電気的および機械的変化につながる構造的原因の統一的な調査が可能になると考えています。

概要

心疾患に関連する構造リモデリングは、電気伝導に影響を及ぼし、臓器の電気機械的機能障害を引き起こす可能性があります1,2。機能的変化を予測するために使用される現在のアプローチは、一般的にMRIおよびDT-MRIを使用して、心臓の線維症沈着、血管樹、および線維分布の全体的な再構成を取得し、それらは臓器を横切る優先活動電位伝播(APP)経路をモデル化するために使用されます3,4。これらの戦略は、心臓組織の美しい概要を提供することができます。しかし、それらの空間分解能は、細胞レベルでの心機能に対する構造リモデリングの影響を調べるには不十分です。

このフレームワークを、単一の細胞が活動電位の伝播において個々の役割を果たすことができる異なる桁に配置することは困難です。主な制限は、大規模な(センチメートルサイズの)組織で高解像度のイメージング(マイクロメートル分解能)を実行するための標準的なイメージング方法の非効率性です。実際、高解像度で3Dで生物学的組織をイメージングすることは、組織が不透明であるため非常に複雑です。臓器全体で3D再構成を実行するための最も一般的なアプローチは、薄い切片を準備することです。ただし、正確なセクショニング、組み立て、およびイメージングには、多大な労力と時間が必要です。サンプルを切断する必要のない別のアプローチは、透明な組織を生成することです。過去数年間、組織を透明化するためのいくつかの方法論が提案されてきた5、6、7、8。巨大で透明で蛍光標識された組織を製造するという課題は、真の組織形質転換アプローチ(CLARITY9、SHIELD10)を開発することによって最近達成されました。特に、CLARITY法は、無傷の組織をナノポーラスのヒドロゲルハイブリダイズした脂質フリー形態に変換することに基づいており、膜脂質二重層の選択的除去によって高い透明性を付与することができます。注目すべきことに、この方法は心臓調製物においても成功していることが見出されている11、12、13、14。ただし、心臓は脆弱すぎて能動的な清算には適さないため、受動的なアプローチを使用して清算する必要があり、完全な透明性を付与するには長い時間がかかります。

ライトシート顕微鏡などの高度なイメージング技術と組み合わせることで、CLARITYはマイクロメートルの解像度で3Dの巨大な心臓組織をイメージングする可能性があります。ライトシート顕微鏡では、サンプルの照明は、検出対物レンズの焦点面に閉じ込められた薄いシートの光で行われます。蛍光発光は、照明面15に垂直な軸に沿って収集される。検出アーキテクチャは広視野顕微鏡に似ており、レーザー走査型顕微鏡よりもはるかに高速に取得できます。ライトシートを通してサンプルを移動することで、センチメートルサイズまでの大きな標本の完全な断層撮影が可能になります。しかしながら、ガウシアンビームの本質的な性質のために、限られた空間拡張のためだけに非常に薄い(数ミクロンのオーダーの)ライトシートを得ることが可能であり、したがって視野(FoV)を大幅に制限する。最近、この制限を克服するために新しい励起スキームが導入され、脳イメージングに適用され、等方性分解能16の3D再構成が可能になりました。

この論文では、パッシブクリアリングアプローチを提示し、CLARITYプロトコルに必要なクリアリングタイミングを大幅に短縮できるようにします。ここで説明する方法論的枠組みは、分オーダーの取得時間を有する単一の断層撮影スキャンにおいて、マイクロメートル分解能でマウス心臓全体を再構築することを可能にする。

プロトコル

すべての動物の取り扱いと手順は、科学的目的で使用される動物の保護に関する欧州議会の指令2010/63 / EUのガイドラインに従って実行され、イタリア保健省の原則と規制に準拠しました。実験プロトコルは、イタリア保健省によって承認されました(プロトコル番号647/2015-PR)。すべての動物はイタリアのENVIGOによって提供されました。これらの実験には、生後6か月の5匹の雄C57BL / 6Jマウスを使用しました。

1. 溶液調製

  1. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(pH 7.6)でケミカルフードに調製します。4%PFAアリコートを-20°Cで数ヶ月間保管します。
  2. ヒドロゲル溶液の調製:4%アクリルアミド、0.05%ビスアクリルアミド、0.25%イニシエティオールAV-044を0.01 M PBSに化学フードで混合します。準備全体を通して試薬と溶液を氷上に保管してください。ヒドロゲルアリコートを-20°Cで数ヶ月間保存します。
  3. 清澄化溶液の調製:200 mMホウ酸、4%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を脱イオン水に混合します。化学フード内のpH 8.6。SDS沈殿を避けるために、溶液を21〜37°Cで保管してください。
  4. 実験当日に新鮮なタイロード溶液を調製する:10 mM グルコース、10 mM HEPES、113 mM NaCl、1.2 mM MgCl2、および4.7 mM KClを追加します。1 M NaOHを用いてpH 7.4に滴定する。

2.心臓の隔離

  1. 心臓隔離手順の30分前に0.1mLの500I.U.ヘパリンを皮下注射します。
  2. 30 mLシリンジと3つの6 cmペトリ皿に新しいタイロード溶液を入れます。ペトリ皿の1つの境界に小さな裂け目(深さ3〜4 mm)を作り、実体顕微鏡の下に置きます。
  3. 直径1mmのカニューレをシリンジに固定し、ペトリ皿の裂け目に挿入します。シリンジに気泡がないことを確認してください。
  4. 20 mLシリンジに4%PFAを満たし、ケミカルフードに入れます。フードの下に空のペトリ皿を用意します。
  5. マウスを3%イソフルラン/酸素で1.0 L / minの流速で麻酔し、施行されている動物福祉規則に従って頸部脱臼によって犠牲にします。
  6. 犠牲の後、胸の上の毛皮を取り除き、胸を開いて心臓に完全にアクセスできるようにします。
  7. 心臓を分離し、以前に50 mLのタイロード溶液で満たされたペトリ皿に浸します。外科用ハサミを使用して大動脈弓のすぐ近くの大動脈を切断し、心臓を露出させます。
  8. 実体顕微鏡下で心臓を移し、慎重にカニューレ挿入を行う。組織の損傷を避けるために、カニューレを大動脈の奥深く(2 mm以下)に挿入しないでください。
  9. 小さなクランプと縫合糸(サイズ5/0)を使用して、心臓をカニューレに固定します。
  10. 心臓に30 mLのタイロード溶液を10 mL / minの一定圧力で灌流し、血管から血液を取り除きます。
  11. カニューレをシリンジから取り外し、心臓をタイロード溶液で満たされたペトリ皿に入れます。カニューレに気泡が入らないように注意してください。それ以外の場合は、気泡を適切に除去してください。
  12. 冷たい4%PFAで満たされた20mLシリンジをカニューレに取り付け、同じ一定の圧力で心臓に灌流します。
  13. 心臓を10 mLの4%PFAで4°Cで一晩インキュベートします(O / N)。組織の劣化を避けるために、可能な限り短い時間で手順2.6〜2.13を実行します。

3.ハートクリアリング

  1. 翌日、心臓を0.01 M PBSで4°Cで15分間3回洗浄します。
    注:このステップの後、心臓はPBS + 0.01%アジ化ナトリウム(NaN3)に4°Cで数か月間保存できます。
  2. 心臓を30 mLのヒドロゲル溶液中で4°Cで3日間振とう(15 rpm)インキュベートします。
  3. 乾燥機、真空ポンプ、および乾燥機をポンプと窒素パイプラインの両方に接続するチューブシステムを使用して、室温でサンプルを脱気します。
    1. サンプルを乾燥機に入れ、バイアルを開き、キャップをかぶせたままにします。
    2. 乾燥機を閉じ、窒素パイプラインを開いてチューブから酸素を取り除きます。
    3. 真空ポンプをオンにして、乾燥機から酸素を10分間除去します。
    4. ポンプの電源を切り、乾燥機のノブを使用して窒素パイプラインを開きます。圧力が大気圧に等しくなったら、乾燥機を慎重に開き、バイアルをすばやく閉じます。
  4. 心臓を脱気したヒドロゲル溶液に37°Cで3時間安静に保ちます。
  5. ハイドロゲルが適切に重合され、完全にゼラチン状に見えたら、心臓を慎重に取り外してサンプルホルダーに入れます。
  6. 心臓付きのサンプルホルダーを透明化チャンバーの1つに挿入し、透明化溶液の漏れを防ぐために適切に閉じます。
  7. 透明化溶液容器が置かれている水浴と蠕動ポンプのスイッチを入れて、清澄溶液の再循環を開始します。
  8. 清澄化手順をスピードアップするために、週に一度容器内の清算液を交換してください。

4. 細胞膜染色

  1. 心臓が完全に透明になったら、サンプルホルダーから取り出し、50 mLのウォームアップPBSで24時間洗浄します。50 mLのPBS + 1%のトリトン-X(PBS-T 1x)で24時間再度洗浄します。
  2. サンプルを0.01 mg/mLの小麦胚芽凝集素(WGA)-Alexa Fluor 633を3 mLのPBS-T 1x中で室温で7日間振とう(50 rpm)インキュベートします。
  3. 7日間のインキュベーション後、50 mLのPBS-T 1xでサンプルを室温で24時間振とうしながら洗浄します。
  4. サンプルを4%PFA中で15分間インキュベートし、PBSでそれぞれ5分間3回洗浄します。
    注:このステップの後、心臓はPBS + 0.01%NaN3に4°Cで数か月間保存できます。
  5. 心臓を0.01 M PBS(20%および47%TDE / PBS)中の2,2'-チオジエタノール(TDE)の濃度をそれぞれ8時間インキュベートし、0.01 M PBS中の68%TDEの最終濃度までインキュベートして、必要な屈折率(RI = 1.46)を提供します。画像16を取得するRIマッチング媒体(RI-medium)である。

5.心臓の取り付けと取得

注意: 光学系のすべてのコンポーネントは、 材料の表に詳細に記載されています。

  1. 外部キュベット(石英、45 mm×45 mm×42.5 mm)の約80%をRI培地で静かに満たします。
    注:ここでは、1.46のRIを保証するさまざまな不揮発性ソリューションを使用できます。
  2. 内部キュベット(石英、45 mm×12.5 mm×12.5 mm)に同じRI培地をそっと充填します。
  3. サンプルを内部キュベット内に浸します。上記のサンプルインキュベーションにより、サンプルは保持されることなくRI培地内で安定な状態を保つことができます。
  4. 細いピンセットを使用してサンプルをキュベットの底にそっと移動し、縦軸がキュベットの主軸に平行になるように心臓を配置して、スキャン中の組織を横切る励起光路を最小限に抑えます。
  5. 2本のネジで内部キュベットの上に調整されたプラグをそっと固定します。
  6. 磁石を使用してサンプルを顕微鏡ステージに取り付けます。
  7. 垂直サンプルステージを手動で移動して、内部キュベットを外部キュベットに浸します。
  8. 励起光源(波長638nm)をオンにし、低電力(3mW程度)に設定します。
  9. 電動トランスレータを使用してサンプルを移動し、組織の内面を照らします。
  10. イメージングソフトウェア(HCImageLive)の電源を入れ、カメラのトリガーを外部(ライトシート)モードに設定して、セットアップ全体を制御するカスタムソフトウェアによってカメラの取得トリガーを駆動します。
  11. [スキャン設定]パネルで[自動保存]を有効にし、画像を保存する必要がある出力フォルダーを設定します。
  12. リニアトランスレータを使用してXY平面内のサンプル位置を手動で調整し、サンプルをカメラセンサーのFoVの中心に移動します。
  13. リニア電動トランスレータを使用してサンプルをZ軸に沿って移動し、断層撮影再構成のための心臓の境界を特定します。
  14. レーザー出力を~20 mWに増やし、イメージングセッションの準備を整えます。
  15. 断層撮影を開始し、イメージングソフトウェアのシーケンスパネルにある開始ボタンをクリックすると同時に、電動トランスレータを使用してサンプルをZ軸に沿って6μm/sの等速で移動します。

結果

開発されたパッシブクリアリングセットアップにより、約3ヶ月でクリアされた成体マウスの心臓(オーダー10mm x 6mm x 6mm)を得ることができます。セットアップのすべてのコンポーネントは、 図 1 に示すようにマウントされます。各クリアリングチャンバー間の温度勾配はごくわずか(3°C程度)であるため、すべてのチャンバーで適切な範囲の温度を維持することができま?...

ディスカッション

この研究では、マウスの心臓全体を高解像度でクリア、染色、および画像化するアプローチの成功を紹介しました。まず、組織形質転換プロトコル(CLARITY)を最適化して実行し、心臓組織への適用のためにわずかに変更しました。実際、心臓全体の3次元で効率的な再構成を得るためには、光散乱の現象を防ぐことが不可欠です。CLARITYの方法論により、透明度の高い無傷の心臓を得ることがで?...

開示事項

開示するものは何もありません。

謝辞

このプロジェクトは、助成金契約第952166号(REPAIR)に基づく欧州連合のホライズン2020研究およびイノベーションプログラム、FISRプログラムに基づくMUR、プロジェクトFISR2019_00320およびトスカーナ地域、バンドーリセルカ敬礼2018、PERCAREプロジェクトから資金提供を受けています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
2-2’ ThiodiethanolSigma-Aldrich166782
AcrylamideBio-Rad61-0140
AV-044 InitiatorWako ChemicalsAVP5874
Bis-AcrylamideBio-Rad161-042
Boric AcidSigma-AldrichB7901
CameraHamamatsuOrca flash 4.0 v3
Camera softwareHamamatsuHC Image
Collimating lensThorlabsAC254-050-A-ML
Detection armIntegrated optics0638L-15A-NI-PT-NF
Excitation lensNikon91863
Exteraìnal quartz cuvettePortmann InstrumentsUQ-753
Fold mirrorsThorlabsBBE1-E02
Galvanometric mirrorThorlabsGVS211/M
GlucoseSigma-AldrichG8270
HCImage LiveHamamatsu4.6.1.19
HEPESSigma-AldrichH3375
Internal quartz cuvettePortmann InstrumentsUQ-204
KClSigma-AldrichP4504
Laser sourceIntegrated Optics0638L-15A-NI-PT-NF
Long-pass filterThorlabsFELH0650
Magnetic baseThorlabsKB25/M
MgCl2Chem-LabCI-1316-0250
Motorized traslatorPhysisk InstrumentM-122.2DD
NaClSigma-Aldrich59888
ObjectiveThorlabsTL2X-SAP
ParaformaldehydeAgar ScientificR1018
Phosphate Buffer SolutionSigma-AldrichP4417
Polycap ASWhatman2606T
Relay lensQioptiqG063200000
Sodium Dodecyl SulfateSigma-AldrichL3771
Tube lensThorlabsACT508-200-A-ML
Tunable lensOptotuneEL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
Vacuum pumpKNF Neuberger IncN86KT.18
Water bathMemmertWTB

参考文献

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