Мезоскопическая оптическая визуализация всего сердца мыши

Резюме

Мы сообщаем о методе мезоскопической реконструкции всего сердца мыши, сочетая новые достижения в области трансформации и окрашивания тканей с разработкой осевого сканируемого светового листового микроскопа.

Аннотация

Как генетические, так и негенетические сердечные заболевания могут вызывать тяжелые процессы ремоделирования в сердце. Структурное ремоделирование, такое как отложение коллагена (фиброз) и клеточное смещение, может повлиять на электрическую проводимость, привести к электромеханическим дисфункциям и, в конечном итоге, привести к аритмии. Современные прогностические модели этих функциональных изменений основаны на неинтегрированной структурной информации с низким разрешением. Размещение этой структуры на другом порядке величины является сложной задачей из-за неэффективности стандартных методов визуализации при выполнении визуализации высокого разрешения в массивной ткани. В этой работе мы описываем методологическую основу, которая позволяет визуализировать целые сердца мыши с микрометрическим разрешением. Достижение этой цели потребовало технологических усилий, в которых были объединены достижения в области трансформации тканей и методов визуализации. Во-первых, мы описываем оптимизированный протокол CLARITY, способный превращать неповрежденное сердце в нанопористую, гидрогеле-гибридизированную, безлипидную форму, которая обеспечивает высокую прозрачность и глубокое окрашивание. Затем описывается флуоресцентный световой микроскоп, способный быстро получать изображения мезоскопического поля зрения (в масштабе мм) с микронным разрешением. Следуя проекту mesoSPIM, задуманный микроскоп позволяет реконструировать все сердце мыши с микрометрическим разрешением в одном томографическом сканировании. Мы считаем, что эта методологическая основа позволит прояснить участие цитоархитектуры в электрических дисфункциях и проложить путь к комплексной модели, которая учитывает как функциональные, так и структурные данные, что позволит провести единое исследование структурных причин, которые приводят к электрическим и механическим изменениям после ремоделирования тканей.

Введение

Структурное ремоделирование, связанное с сердечными заболеваниями, может влиять на электропроводность и вводить электромеханические дисфункции органа ^1,2. Современные подходы, используемые для прогнозирования функциональных изменений, обычно используют МРТ и DT-МРТ для получения общей реконструкции отложения фиброза, сосудистого дерева и распределения волокон сердца, и они используются для моделирования путей распространения потенциала предпочтительного действия (APP) через орган ^3,4. Эти стратегии могут дать прекрасный обзор организации сердца. Однако их пространственное разрешение недостаточно для исследования влияния структурного ремоделирования на сердечную функцию на клеточном уровне.

Размещение этой структуры в другом порядке величины, где отдельные клетки могут играть индивидуальные роли в распространении потенциала действия, является сложной задачей. Основным ограничением является неэффективность стандартных методов визуализации для выполнения визуализации с высоким разрешением (микрометрическое разрешение) в массивных (сантиметровых) тканях. На самом деле, визуализация биологических тканей в 3D с высоким разрешением очень сложна из-за непрозрачности тканей. Наиболее распространенным подходом к выполнению 3D-реконструкций целых органов является подготовка тонких срезов. Однако точное секционирование, сборка и визуализация требуют значительных усилий и времени. Альтернативный подход, который не требует разрезания образца, заключается в создании прозрачной ткани. За последние годы было предложено несколько методик осветления тканей 5,6,7,8. Задача производства массивных, прозрачных и флуоресцентно меченых тканей была недавно достигнута путем разработки истинных подходов к трансформации тканей (CLARITY⁹, SHIELD¹⁰). В частности, метод CLARITY основан на превращении интактной ткани в нанопористую, гидрогелегибридизированную, безлипидную форму, что позволяет придать высокую прозрачность путем селективного удаления мембранных липидных бислоев. Примечательно, что этот метод был признан успешным также в кардиологической подготовке 11,12,13,14. Однако, поскольку сердце слишком хрупко, чтобы быть пригодным для активного очищения, оно должно быть очищено с использованием пассивного подхода, который требует длительного времени для придания полной прозрачности.

В сочетании с передовыми методами визуализации, такими как микроскопия светового листа, CLARITY имеет потенциал для изображения 3D-массивных тканей сердца с микрометрическим разрешением. В световой микроскопии освещение образца выполняется тонким листом света, ограниченным в фокальной плоскости объекта обнаружения. Флуоресцентное излучение собирается вдоль оси, перпендикулярной плоскости^{15 освещения}. Архитектура обнаружения похожа на широкоугольную микроскопию, что делает сбор намного быстрее, чем лазерные сканирующие микроскопы. Перемещение образца по световому листу позволяет получить полную томографию крупных образцов, размером до сантиметра. Однако из-за внутренних свойств пучка Гаусса можно получить очень тонкий (порядка нескольких микрон) световой лист только для ограниченного пространственного расширения, тем самым резко ограничивая поле зрения (FoV). Недавно была введена новая схема возбуждения для преодоления этого ограничения и применена для визуализации мозга, позволяющая проводить 3D-реконструкции с изотропным разрешением¹⁶.

В настоящем документе представлен пассивный клиринговый подход, позволяющий значительно сократить сроки клиринга, необходимые в соответствии с протоколом CLARITY. Описанная здесь методологическая основа позволяет реконструировать целое сердце мыши с микрометрическим разрешением в одном томографическом сканировании со временем получения порядка минут.

протокол

Все процедуры по обращению с животными были выполнены в соответствии с руководящими принципами Директивы 2010/63/ЕС Европейского парламента о защите животных, используемых в научных целях, и соответствовали принципам и правилам Министерства здравоохранения Италии. Протокол эксперимента был одобрен Министерством здравоохранения Италии (протокол No 647/2015-PR). Все животные были предоставлены КОМПАНИЕЙ ENVIGO, Италия. Для этих экспериментов использовались 5 самцов мышей C57BL/6J 6-месячного возраста.

1. Приготовление раствора

1. Приготовьте 4% параформальдегида (PFA) в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) (pH 7,6) в химической вытяжке. Храните 4% аликвоты PFA при -20 °C в течение нескольких месяцев.
2. Приготовить раствор гидрогеля: смешать 4% акриламид, 0,05% бис-акриламид, 0,25% инициатор AV-044 в 0,01 М PBS в химической вытяжке. Держите реагенты и раствор на льду в течение всего приготовления. Хранить гидрогелевые аликвоты при -20 °C в течение нескольких месяцев.
3. Приготовление очищающего раствора: Смешайте 200 мМ борной кислоты, 4% додецилсульфата натрия (SDS) в деионизированной воде; pH 8,6 в химической вытяжке. Храните раствор при температуре от 21 до 37 °C, чтобы избежать осаждения SDS.
4. Готовят свежий раствор тирода в день эксперимента: добавляют 10 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES, 113 мМ NaCl, 1,2 мМ MgCl₂ и 4,7 мМ KCl; титровать до рН 7,4 с помощью 1 М NaOH.

2. Изоляция сердца

1. Вводят 0,1 мл 500 МЕ гепарина подкожно за 30 мин до процедуры изоляции сердца.
2. Наполните шприц объемом 30 мл и три 6-сантиметровые чашки Петри свежим раствором Tyrode. Сделайте небольшой разлом (глубиной 3-4 мм) на границе одной из чашек Петри и поместите его под стереоскопический микроскоп.
3. Прикрепите к шприцу канюлю диаметром 1 мм и вставьте ее в разлом чашки Петри. Убедитесь, что в шприце нет пузырьков воздуха.
4. Наполните шприц объемом 20 мл 4% PFA и держите его в химической вытяжке. Приготовьте пустую чашку Петри под капотом.
5. Обезболить мышь 3% изофлураном/кислородом со скоростью потока 1,0 л/мин и принести его в жертву при вывихе шейки матки в соответствии с действующими правилами благополучия животных.
6. После жертвоприношения удалите мех над грудью и откройте грудь, чтобы иметь полный доступ к сердцу.
7. Изолируйте сердце, погрузите его в чашку Петри, предварительно заполненную 50 мл раствора тирода. Используйте хирургические ножницы, чтобы разрезать аорту непосредственно возле дуги аорты, чтобы обнажить сердце.
8. Перенесите сердце под стереоскопический микроскоп и аккуратно выполните канюляцию. Не вставляйте канюлю слишком глубоко в аорту (не более 2 мм), чтобы избежать повреждения тканей.
9. Используйте небольшой зажим и шов (размер 5/0), чтобы зафиксировать сердце к канюле.
10. Перфузируйте сердце 30 мл раствора Тирода с постоянным давлением 10 мл/мин для удаления крови из сосудов.
11. Отсоедините канюлю от шприца и поместите сердце в чашку Петри, наполненную раствором Тирода. Будьте осторожны, чтобы в канюле не было пузырьков воздуха; в противном случае удалите пузырьки воздуха должным образом.
12. Прикрепите шприц объемом 20 мл, наполненный холодным 4% PFA, к канюле и перфузируйте сердце при том же постоянном давлении.
13. Инкубируют сердце в 10 мл 4% PFA при 4 °C в течение ночи (O/N). Чтобы избежать деградации тканей, выполните шаги 2.6-2.13 в кратчайшие сроки.

3. Очищение сердца

1. На следующий день промыть сердце по 0,01 М PBS 3 раза при 4 °C в течение 15 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После этого этапа сердце можно хранить в PBS + 0,01% азида натрия (NaN3) при 4 °C в течение нескольких месяцев.
2. Инкубируют сердце в 30 мл раствора гидрогеля в тряске (15 об/мин) при 4 °C в течение 3 дней.
3. Дегазация образца при комнатной температуре с помощью сушилки, вакуумного насоса и трубчатой системы, которая соединяет сушилку как с насосом, так и с азотным трубопроводом.
   1. Поместите образец в сушилку и откройте флакон, держа на нем колпачок.
   2. Закройте сушилку и извлеките кислород из трубки, открыв азотный трубопровод.
   3. Включите вакуумный насос, чтобы удалить кислород из сушилки на 10 минут.
   4. Выключите насос и используйте ручку сушилки, чтобы открыть азотный трубопровод. Как только давление сравняется с атмосферным, осторожно откройте сушилку и быстро закройте флакон.
4. Держите сердце в дегазированном растворе гидрогеля при 37 °C в течение 3 ч в состоянии покоя.
5. Когда гидрогель будет правильно полимеризован и окажется полностью желатиновым, осторожно извлеките из него сердце и поместите его в держатель для образцов.
6. Вставьте держатель образца с сердцем в одну из очистительных камер и закройте его должным образом, чтобы избежать утечки раствора для очистки.
7. Включите водяную баню, где размещен контейнер для очищающего раствора, и перистальтический насос, чтобы начать рециркуляцию очищающего раствора.
8. Меняйте очищающий раствор в контейнере раз в неделю, чтобы ускорить процедуру осветления.

4. Окрашивание клеточной мембраны

1. Как только сердце полностью прояснится, извлеките его из держателя образца и промыте в 50 мл разогретого PBS в течение 24 часов. Снова промыть в 50 мл PBS + 1% Triton-X (PBS-T 1x) в течение 24 ч.
2. Инкубируют образец в 0,01 мг/мл агглютинина зародышей пшеницы (WGA) - Alexa Fluor 633 в 3 мл PBS-T 1x в тряске (50 об/мин) при комнатной температуре в течение 7 дней.
3. После 7-дневной инкубации промыть образец в 50 мл PBS-T 1x при комнатной температуре при встряхивании в течение 24 ч.
4. Инкубируйте образец в 4% PFA в течение 15 мин, а затем промывайте его 3 раза в PBS в течение 5 минут каждый.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После этого шага сердце можно хранить в PBS + 0,01% NaN3 при 4 °C в течение нескольких месяцев.
5. Инкубируют сердце в возрастающих концентрациях 2,2'-тиодиэтанола (ТДЭ) в 0,01 М PBS (20% и 47% TDE/PBS) в течение 8 ч каждый, до конечной концентрации 68% TDE в 0,01 М PBS для обеспечения требуемого показателя преломления (RI = 1,46). Это ri-соответствующая среда (RI-среда) для получения изображений¹⁶.

5. Монтаж и приобретение сердца

ПРИМЕЧАНИЕ: Все компоненты оптической системы подробно перечислены в Таблице материалов.

1. Аккуратно заполните около 80% наружной кюветы (кварцевая, 45 мм × 45 мм × 42,5 мм) RI-средой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь можно использовать различные энергонезависимые решения, которые гарантируют RI 1,46.
2. Аккуратно наполните внутреннюю кювету (кварцевую, 45 мм × 12,5 мм × 12,5 мм) той же RI-средой.
3. Погрузите образец внутрь внутренней кюветы. Инкубации образцов, описанные выше, позволяют образцу оставаться стабильным внутри RI-среды без удержания.
4. Осторожно переместите образец в нижнюю часть кюветы с помощью тонкого пинцета и расположите сердце с его продольной осью параллельно главной оси кюветы, чтобы свести к минимуму световой путь возбуждения через ткань во время сканирования.
5. Аккуратно закрепите специальную заглушку над внутренней кюветой двумя винтами.
6. Установите образец на ступень микроскопа с помощью магнитов.
7. Переведите вертикальный этап образца вручную, чтобы погрузить внутреннюю кювету во внешнюю.
8. Включите источник света возбуждения (длина волны 638 нм), установив низкую мощность (порядка 3 мВт).
9. Переместите образец с помощью моторизованного транслятора, чтобы осветить внутреннюю плоскость ткани.
10. Включите программное обеспечение для обработки изображений (HCImageLive) и установите триггер камеры во внешний (световой лист) режим, чтобы управлять триггером сбора данных камеры пользовательским программным обеспечением, управляющим всей настройкой.
11. Включите функцию «Автосохранения » на панели «Параметры сканирования» и задайте выходную папку, в которой необходимо сохранить изображения.
12. Вручную отрегулируйте положение образца в плоскости XY с помощью линейных трансляторов, чтобы переместить образец в центр FoV датчика камеры.
13. Переместите образец вдоль оси Z с помощью линейного моторизованного транслятора для определения границ сердца для томографической реконструкции.
14. Увеличьте мощность лазера до ~20 мВт, готового к сеансу визуализации.
15. Запустите томографическое получение, нажмите кнопку «Пуск» на панели последовательностей программного обеспечения для визуализации и одновременно переместите образец по оси Z с постоянной скоростью 6 мкм/с с помощью моторизованного транслятора.

Результаты

Разработанная пассивная очистительная установка позволяет получить очищенное сердце взрослой мыши (размером порядка 10 мм х 6 мм х 6 мм) примерно за 3 месяца. Все компоненты установки монтируются, как показано на рисунке 1. Незначительный температурный градиент между кажд...

Обсуждение

В этой работе был представлен успешный подход к очистке, окрашиванию и изображению целого сердца мыши в высоком разрешении. Сначала был оптимизирован и выполнен протокол трансформации тканей (CLARITY), слегка модифицированный для его применения на сердечной ткани. Действительно, чтобы по?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-2’ Thiodiethanol	Sigma-Aldrich	166782
Acrylamide	Bio-Rad	61-0140
AV-044 Initiator	Wako Chemicals	AVP5874
Bis-Acrylamide	Bio-Rad	161-042
Boric Acid	Sigma-Aldrich	B7901
Camera	Hamamatsu	Orca flash 4.0 v3
Camera software	Hamamatsu	HC Image
Collimating lens	Thorlabs	AC254-050-A-ML
Detection arm	Integrated optics	0638L-15A-NI-PT-NF
Excitation lens	Nikon	91863
Exteraìnal quartz cuvette	Portmann Instruments	UQ-753
Fold mirrors	Thorlabs	BBE1-E02
Galvanometric mirror	Thorlabs	GVS211/M
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HCImage Live	Hamamatsu	4.6.1.19
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Internal quartz cuvette	Portmann Instruments	UQ-204
KCl	Sigma-Aldrich	P4504
Laser source	Integrated Optics	0638L-15A-NI-PT-NF
Long-pass filter	Thorlabs	FELH0650
Magnetic base	Thorlabs	KB25/M
MgCl2	Chem-Lab	CI-1316-0250
Motorized traslator	Physisk Instrument	M-122.2DD
NaCl	Sigma-Aldrich	59888
Objective	Thorlabs	TL2X-SAP
Paraformaldehyde	Agar Scientific	R1018
Phosphate Buffer Solution	Sigma-Aldrich	P4417
Polycap AS	Whatman	2606T
Relay lens	Qioptiq	G063200000
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
Tube lens	Thorlabs	ACT508-200-A-ML
Tunable lens	Optotune	EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
Vacuum pump	KNF Neuberger Inc	N86KT.18
Water bath	Memmert	WTB