Medición del flujo de sustrato mitocondrial en células perfrendolisaminas o-permeabilizadas recombinantes

Resumen

En este trabajo, describimos un protocolo modificado para probar el flujo del sustrato respiratorio mitocondrial utilizando perfringolisina O recombinante en combinación con respirometría basada en microplacas. Con este protocolo, mostramos cómo la metformina afecta la respiración mitocondrial de dos líneas celulares tumorales diferentes.

Resumen

El flujo de sustrato mitocondrial es una característica distintiva de cada tipo de célula, y los cambios en sus componentes, como transportadores, canales o enzimas, están involucrados en la patogénesis de varias enfermedades. El flujo de sustrato mitocondrial se puede estudiar utilizando células intactas, células permeabilizadas o mitocondrias aisladas. La investigación de células intactas encuentra varios problemas debido a la oxidación simultánea de diferentes sustratos. Además, varios tipos de células contienen almacenes internos de diferentes sustratos que complican la interpretación de los resultados. Métodos como el aislamiento mitocondrial o el uso de agentes permeabilizantes no son fácilmente reproducibles. Aislar mitocondrias puras con membranas intactas en cantidades suficientes a partir de muestras pequeñas es problemático. El uso de permeabilizadores no selectivos causa varios grados de daño inevitable de la membrana mitocondrial. La perfringolisina O recombinante (rPFO) se ofreció como un permeabilizante más apropiado, gracias a su capacidad para permeabilizar selectivamente la membrana plasmática sin afectar la integridad mitocondrial. Cuando se usa en combinación con la respirometría de microplacas, permite probar el flujo de varios sustratos mitocondriales con suficientes réplicas dentro de un experimento mientras se usa un número mínimo de células. En este trabajo, el protocolo describe un método para comparar el flujo de sustrato mitocondrial de dos fenotipos o genotipos celulares diferentes y se puede personalizar para probar varios sustratos o inhibidores mitocondriales.

Introducción

La respirometría basada en microplacas ha revolucionado la investigación mitocondrial al permitir el estudio de la respiración celular de un tamaño de muestra pequeño¹. La respiración celular generalmente se considera como un indicador de la función mitocondrial o "disfunción", a pesar del hecho de que el rango mitocondrial de funciones se extiende más allá de la producción de energía². En condiciones aeróbicas, las mitocondrias extraen la energía almacenada en diferentes sustratos descomponiendo y convirtiendo estos sustratos en intermedios metabólicos que pueden alimentar el ciclo del ácido cítrico³ (Figura 1). El flujo continuo de sustratos es esencial para que el flujo del ciclo del ácido cítrico genere 'donantes de electrones' de alta energía, que entregan electrones a la cadena de transporte de electrones que genera un gradiente de protones a través de la membrana mitocondrial interna, lo que permite que la ATP-sintasa fosforila ADP a ATP^4. Por lo tanto, un diseño experimental para evaluar la respiración mitocondrial debe incluir la naturaleza de la muestra (células intactas, células permeabilizadas o mitocondrias aisladas) y sustratos mitocondriales.

Las células mantienen un almacén de sustratos autóctonos^5,y las mitocondrias oxidan varios tipos de sustratos simultáneamente^6,lo que complica la interpretación de los resultados obtenidos de los experimentos realizados sobre células intactas. Un enfoque común para investigar la capacidad mitocondrial para oxidar un sustrato seleccionado es aislar las mitocondrias o permeabilizar las células investigadas⁵. Aunque las mitocondrias aisladas son ideales para estudios cuantitativos, el proceso de aislamiento es laborioso. Se enfrenta a dificultades técnicas como la necesidad de un gran tamaño de muestra, la pureza del rendimiento y la reproducibilidad de la técnica⁵. Las células permeabilizadas ofrecen una solución para las desventajas del aislamiento mitocondrial; sin embargo, los agentes permeabilizantes rutinarios de naturaleza detergente no son específicos y pueden dañar las membranas mitocondriales⁵.

La perfringolisina O recombinante (rPFO) se ofreció como agente permeabilizante selectivo de la membrana plasmática^7,y se utilizó con éxito en combinación con un analizador de flujo extracelular en varios estudios^7,8,9,10. Hemos modificado un protocolo utilizando rPFO para detectar el flujo de sustrato mitocondrial utilizando el analizador de flujo extracelular XFe96. En este protocolo, se comparan cuatro vías oxidantes de sustrato diferentes en dos fenotipos celulares mientras se tienen suficientes réplicas y el control adecuado para cada material probado.

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Protocolo

1. Un día antes del ensayo

1. Preparación de reactivos y sustratos.
   1. Solución de ensayo mitocondrial (MAS): Preparar soluciones madre de todos los reactivos como se describe en la Tabla 1. Caliente las existencias de manitol y sacarosa a 37 °C para disolverlas por completo. Mezcle los reactivos para preparar 2x MAS, luego caliente la mezcla a 37 ° C. Ajuste el pH con 5N KOH a 7.4 (~ 7 mL), luego agregue agua para llevar el volumen hasta 1 L. Filtre-esterilice y almacene las alícuotas a -20 ° C hasta el día de la medición.
   2. Albúmina sérica bovina (5% BSA): Disolver 5 g de BSA en 90 ml de agua estéril precalentada en un agitador magnético y evitar temblores. Ajuste el pH a 7.4 con 5 N KOH, y luego agregue agua para llevar el volumen hasta 100 ml. Filtrar-esterilizar y almacenar las alícuotas a -20 °C hasta el día de la medición.
   3. Sustratos mitocondriales: Prepare soluciones madre de 1 M de succinato de sodio, piruvato de sodio y glutamato de sodio en agua estéril. Prepare una solución madre de 100 mM de malato de sodio en agua estéril y use agua estéril precalentada para preparar una solución madre de 10 mM de palmitoil carnitina. Ajuste el pH de cada solución a 7.4 por 5 N KOH y esterilice el filtro. Conservar los sustratos a 2-8 °C. En el momento de su uso, caliente palmitoyl carnitina a 37 ° C para disolver cualquier precipitado. Para su uso posterior, conservar las alícuotas de todos los sustratos excepto el piruvato a -20 °C.
   4. Inhibidores mitocondriales: Use dimetilsulfóxido (DMSO) para preparar soluciones madre de 25 mM de oligomicina, 50 mM de cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP), 20 mM de rotenona y 20 mM de antimicina A. Guarde las alícuotas a -20 °C.
2. Siembra y tratamiento de las células: Como se muestra en la Figura 2,sembra las células en las columnas 2-11. Las columnas 1 y 12 deben dejarse vacías para que sirvan como pozos de fondo. En este trabajo se utilizaron células HepG2 y A549.
   1. Sembrar las células a una densidad de 20.000 células por pozo. Utilice 50-80 μL de medio de cultivo celular para la siembra.
   2. Llene los pocillos en blanco con un volumen igual de medio de cultivo celular e incube las células a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO_2. Deje que las células se adhieran durante 3-4 horas y luego agregue 100 μL de medio de cultivo celular a todos los pocillos.
   3. Con esa adición final del medio, aplique el tratamiento en las columnas 7-11. En este trabajo, el grupo experimental fue tratado con 1 mM de clorhidrato de metformina durante 16 horas, y el grupo de control fue tratado con un volumen igual de agua destilada estéril como un control de vehículo.
3. Hidratación de los sensores: Pipete 200 μL de agua estéril por pozo en la placa de servicio, luego devuelva cuidadosamente el cartucho del sensor mientras sumerge los sensores en agua. Incubar el cartucho en una incubadora libre de_CO2a 37 °C hasta el día siguiente.
4. La plantilla de protocolo de ensayo: Encienda el analizador (consulte la Tabla de materiales)y la unidad controladora. Inicie el software de control de instrumentos y adquisición de datos y diseñe el protocolo de ensayo como se describe en la Tabla 2. En Definiciones degrupo, cree cuatro estrategias de inyección donde el puerto A difiere según el sustrato inyectado(Figura 3). Nombra las estrategias después de los sustratos o sus abreviaturas.
5. A los puertos B, C y D, asigne los compuestos oligomicina, FCCP y rotenona/antimicina A, respectivamente. Cree ocho grupos y asígneles el nombre que se muestra en la Figura 4. En Mapa de placas, asigne los grupos a los pozos correspondientes y, a continuación, guarde el protocolo como una plantilla lista para usar. Deje el analizador encendido para permitir que la temperatura se estabilice durante la noche. Mantenga el analizador en un lugar con una temperatura estable para evitar cambios bruscos de temperatura.

2. El día del ensayo

1. Sustitución del agua por el calibrante: Deseche el agua de la placa de servicios públicos y bombee 200 μL de calibrante precalentado por pozo en la placa de servicio. Devuelva el cartucho a la incubadora libre de CO₂hasta el momento del ensayo. Para evitar la evaporación rápida del calibrante, mantenga una fuente de humedad dentro de la incubadora y apague o reduzca la velocidad del ventilador al mínimo.
2. Preparación de las soluciones de trabajo: Comience calentando 2x MAS, 5% BSA y agua estéril a 37 ° C. Mientras tanto, permita que las existencias de inhibidores alcancen la temperatura ambiente. Utilice 2x MAS caliente y agua destilada estéril para preparar 5 ml de la concentración de trabajo de los sustratos e inhibidores como se describe en la Tabla 3.
3. Carga de los puertos de inyección: Como se muestra en la Figura 3,cargue 20 μL de los sustratos en el puerto A. Cargue la mezcla de succinato/rotenona en el puerto A de las filas A y B. Cargue la mezcla de piruvato/malato en el puerto A de las filas C y D. Cargue la mezcla de glutamato/malato en el puerto A de las filas E y F. Cargue la mezcla de palmitoil carnitina/malato en el puerto A de las filas G y H. Para toda la placa, puerto de carga B con 22 μL de preparación de oligomicina, puerto C con 25 μL de preparación fccP y puerto D con 27 μL de mezcla de rotenona/antimicina A.
4. Inicio del paso de calibración: En la pestaña Ejecutar ensayo, haga clic en Iniciar ejecución para iniciar el ensayo. Inserte el cartucho del sensor cargado e inicie el paso de calibración. Espere a que se complete la calibración antes de continuar con el siguiente paso.
5. Preparación del medio de ensayo (MAS-BSA-rPFO): Para preparar 20 mL del medio de ensayo, mezcle 10 mL de 2x MAS, 9.2 mL de agua estéril y 0.8 mL de BSA al 5% en un tubo de 50 mL. Añadir 2 μL de rPFO de 10 μM para alcanzar una concentración de 1 nM y volver a suspender la mezcla con pipeteo suave. Evite agitar y no use un mezclador de vórtice para mezclar. Incubar el tubo a 37 °C hasta el momento de su uso.
6. Lavado de las células: Lave las células y los pozos vacíos en blanco dos veces con solución salina tamponada (PBS) sin fosfato libre de calcio y magnesio precalentada con una pipeta multicanal. Evite reutilizar los mismos consejos para desechar el medio de cultivo celular y agregar PBS. Realice este paso fuera del flujo laminar para proteger las células de la desecación por el flujo de aire.
7. Permeabilización celular en medio de ensayo: Utilizando una pipeta multicanal, deseche el PBS y reemplácelo por 180 μL del medio de ensayo precalentado (MAS-BSA-rPFO).
8. Inicio de la medición: Inmediatamente después de la permeabilización, reemplace la placa de utilidad del cartucho del sensor calibrado con la placa de celda e inicie la medición.

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Resultados

Comience por normalizar los resultados a la segunda medición de la respiración basal para mostrar los valores como porcentaje de tasa de consumo de oxígeno (OCR%). Los resultados del ensayo se muestran en las Figuras 5,Figura 6, Figura 7 y Figura 8. Es importante asignar los pozos de fondo adecuados para cada grupo e inactivar los pozos de fondo de otros grupos.

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Discusión

Este protocolo es una modificación de los estudios publicados previamente^7,8,9,10 y la guía del usuario del producto. En contraste con el protocolo del fabricante, se utiliza 2x MAS en lugar de 3x MAS, ya que 2× MAS es más fácil de disolver y no forma precipitaciones después de la congelación. Las alícuotas MAS congeladas 2x se pueden almacenar hasta seis meses y muestran resultados con...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate	Merck	A5285	store at -20 °C
Antimycin A	Merck	A8674	store at -20 °C
Bovine serum albumin	Merck	A3803	store at 2 - 8 °C
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Merck	C2920	store at -20 °C
Dimethyl sulfoxide	Merck	D8418	store at RT
D-Mannitol	Merck	63559	store at RT
Dulbecco's phosphate buffered saline	Gibco	14190-144	store at RT
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid	Merck	03777	store at RT
HEPES	Merck	H7523	store at RT
L(-)Malic acid disodium salt	Merck	M9138	store at RT
L-Glutamic acid sodium salt hydrate	Merck	G5889	store at RT
Magnesium chloride hexahydrate	Merck	M2670	store at RT
Oligomycin	Merck	O4876	store at -20 °C
Palmitoyl-DL-carnitine chloride	Merck	P4509	store at -20 °C
Potassium hydroxide	Merck	484016	store at RT
Potassium phosphate monobasic	Merck	P5655	store at RT
Rotenone	Merck	R8875	store at -20 °C
Seahorse Wave Desktop Software	Agilent technologies		Download from www.agilent.com
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent technologies
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent technologies	102416-100	XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates
Sodium pyruvate	Merck	P2256	store at 2 - 8 °C
Sodium succinate dibasic hexahydrate	Merck	S2378	store at RT
Sucrose	Merck	S7903	store at RT
Water	Merck	W3500	store at RT
XF calibrant	Agilent technologies	100840-000	store at RT
XF Plasma membrane permeabilizer	Agilent technologies	102504-100	Recombinant perfringolysin O (rPFO) - Aliquot and store at -20 °C