מדידת שטף מצע מיטוכונדריאלי בתאים פרומינגוליסין O-פרמיבילים

Summary

בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקול שונה כדי לבדוק שטף מצע נשימתי מיטוכונדריאלי באמצעות רקומביננטי perfringolysin O בשילוב עם רזפירומטריה מבוססת מיקרופלסטיק. עם פרוטוקול זה, אנו מראים כיצד מטפורמין משפיע על נשימה מיטוכונדריאלית של שני קווי תאים סרטניים שונים.

Abstract

שטף מצע מיטוכונדריאלי הוא מאפיין בולט של כל סוג תא, ושינויים במרכיביו כגון מובילים, ערוצים או אנזימים מעורבים בפתוגנזה של מספר מחלות. ניתן לחקור שטף מצע מיטוכונדריאלי באמצעות תאים שלמים, תאים מחלחלים או מיטוכונדריה מבודדת. חקירת תאים שלמים נתקלת במספר בעיות עקב חמצון סימולטני של מצעים שונים. חוץ מזה, מספר סוגי תאים מכילים מאגרים פנימיים של מצעים שונים שמסבך את פרשנות התוצאות. שיטות כגון בידוד מיטוכונדריאלי או שימוש בסוכנים מחלחלים אינם ניתנים לשחזור בקלות. בידוד המיטוכונדריה הטהורה עם ממברנות שלמות בכמויות מספיקות מדגימות קטנות הוא בעייתי. שימוש permeabilizers לא סלקטיבי גורם דרגות שונות של נזק ממברנה מיטוכונדריאלית בלתי נמנע. רקומביננטי perfringolysin O (rPFO) הוצע כמו permeabilizer מתאים יותר, הודות ליכולתו באופן סלקטיבי permeabilize קרום פלזמה מבלי להשפיע על שלמות המיטוכונדריה. כאשר נעשה שימוש בשילוב עם respirometry microplate, זה מאפשר בדיקת השטף של כמה מצעים מיטוכונדריאליים עם מספיק שכפולים בתוך ניסוי אחד תוך שימוש במספר מינימלי של תאים. בעבודה זו, הפרוטוקול מתאר שיטה להשוות שטף מצע מיטוכונדריאלי של שני פנוטיפים תאיים שונים או גנוטיפים וניתן להתאים אישית כדי לבדוק מצעים או מעכבים מיטוכונדריאליים שונים.

Introduction

ספירומטריה מבוססת מיקרופלסטיק חוללה מהפכה במחקר המיטוכונדריאלי בכך שאפשרה את חקר הנשימה התאית בגודל מדגם קטן¹. נשימה תאית נחשבת בדרך כלל כאינדיקטור לתפקוד מיטוכונדריאלי או "תפקוד לקוי", למרות העובדה כי טווח הפונקציות המיטוכונדריאלי משתרע מעבר לייצור^{אנרגיה 2}. בתנאים אירוביים, המיטוכונדריה מחלצים את האנרגיה המאוחסנת במצעים שונים על ידי פירוק והמרת מצעים אלה למתווכים מטבוליים שיכולים לתדלק את מחזור חומצת לימון³ (איור 1). השטף המתמשך של המצעים חיוני לזרימה של מחזור חומצת לימון כדי ליצור אנרגיה גבוהה 'תורמי אלקטרונים', אשר מספקים אלקטרונים לשרשרת הובלת האלקטרונים המייצר שיפוע פרוטונים על פני הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית, ומאפשר ATP-סינתאז לזרחן ADP ל- ATP⁴. לכן, עיצוב ניסיוני כדי לעצור נשימה מיטוכונדריאלית חייב לכלול את טבע המדגם (תאים שלמים, תאים מחלחלים, או מיטוכונדריה מבודדת) ומצעים מיטוכונדריאליים.

תאים לשמור על מאגר של מצעים ילידים⁵, ומיטוכונדריה לחמצן כמה סוגים של מצעים בו זמנית⁶, אשר מסבך את הפרשנות של תוצאות המתקבלות מניסויים שבוצעו על תאים שלמים. גישה נפוצה לחקור את היכולת המיטוכונדריאלית לחמצן מצע נבחר היא לבודד את המיטוכונדריה או לחלחל לתאים הנחקרים⁵. למרות המיטוכונדריה מבודדת הם אידיאליים עבור מחקרים כמותיים, תהליך הבידוד הוא מייגע. הוא מתמודד עם קשיים טכניים כגון הצורך בגודל מדגם גדול, טוהר התשואה, ושחזור של הטכניקה⁵. תאים מחלחלים מציעים פתרון לחסרונות של בידוד מיטוכונדריאלי; עם זאת, חומרים מחלחלים שגרתיים של טבע דטרגנט אינם ספציפיים ועלולים לפגוע בממברנות המיטוכונדריאליות⁵.

רקומביננטי perfringolysin O (rPFO) הוצע כקרום פלזמה סלקטיבי מחלחל סוכן⁷, והוא שימש בהצלחה בשילוב עם מנתח שטף חוץ תאי במספר מחקרים^7,8,9,10. שינינו פרוטוקול באמצעות rPFO כדי לסנן שטף מצע מיטוכונדריאלי באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי XFe96. בפרוטוקול זה, ארבעה מסלולים שונים חמצון מצע בשני פנוטיפים הסלולר משווים תוך שיש מספיק שכפולים ואת השליטה הנכונה עבור כל חומר נבדק.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. יום אחד לפני ההסתה

1. הכנת ריאגנטים ומצעים.
   1. פתרון בדיקת מיטוכונדריאלי (MAS): הכן פתרונות מלאי של כל הריאגנטים כמתואר בטבלה 1. מחממים את המניות של מניטול סוכרוז ל 37 °C (50 °F) להתמוסס לחלוטין. מערבבים את הריאגנטים כדי להכין 2x MAS, ולאחר מכן לחמם את התערובת ל 37 °C (50 °F). התאימו את ה-pH עם 5N KOH ל-7.4 (~7 מ"ל), ולאחר מכן הוסיפו מים כדי להביא את הנפח עד 1 ליטר. מסננים-לעקר ולאחסן את aliquots ב -20 °C עד יום המדידה.
   2. אלבומין בסרום בקר (5% BSA): יש להמיס 5 גרם BSA ב-90 מ"ל של מים סטריליים עם וורטר על מערבל מגנטי ולהימנע מרעד. התאימו את ה-pH ל-7.4 עם 5 N KOH ולאחר מכן הוסיפו מים כדי להביא את הנפח עד 100 מ"ל. מסנן-לחטא ולאחסן את aliquots ב -20 °C (50 °F) עד יום המדידה.
   3. מצעים מיטוכונדריאליים: הכינו 1 M פתרונות מלאי של נתרן תמציתי, נתרן פירובט ונתרן גלוטמט במים סטריליים. הכן פתרון מלאי 100 mM של נתרן malate במים סטריליים ולהשתמש במים סטריליים מוארים מראש כדי להכין פתרון מלאי 10 mM של קרניטין פלמיטויל. כוונן את רמת ה-pH של כל פתרון ל-7.4 על 5 N KOH וחטא מסנן. לאחסן את המצעים ב 2-8 °C (5 °F). בזמן השימוש, קרניטין פלמיטויל חם ל 37 °C (50 °F) כדי להמיס כל משקעים. לשימוש מאוחר יותר, יש לאחסן עליקוטים של כל המצעים למעט פירובט ב-20 מעלות צלזיוס.
   4. מעכבי מיטוכונדריאליים: השתמש דימתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי להכין פתרונות מלאי של 25 mM אוליגומיצין, 50 mM קרבוניל ציאניד 4-(טריפלואורומתוקסי) פניל הידרוזון (FCCP), 20 mM רוטנון, ו 20 mM עתיקות A. לאחסן את aliquots ב -20 °C.
2. זריעה וטיפול בתאים: כפי שמוצג באיור 2, זרעו את התאים בעמודות 2-11. יש להשאיר עמודות 1 ו- 12 ריקות כדי לשמש כבארות רקע. בעבודה זו, נעשה שימוש בתאי HepG2 ו- A549.
   1. זרע את התאים בצפיפות של 20,000 תאים לבאר. השתמש 50-80 μL של תרבית התא בינוני עבור זריעה.
   2. מלא את הבארות הריקות בנפח שווה של תרבית תאים בינוני ודגר את התאים ב 37 °C בחממה לחה עם 5% CO₂. אפשר לתאים להתחבר במשך 3-4 שעות ולאחר מכן הוסף 100 μL של תרבית תאים בינונית לכל בארות.
   3. עם תוספת בינונית סופית זו, יש למרוח את הטיפול בעמודות 7-11. בעבודה זו, קבוצת הניסוי טופלה עם 1 mM מטפורמין הידרוכלוריד במשך 16 שעות, וקבוצת הביקורת טופלה בנפח שווה של מים מזוקקים סטריליים כבקרה לרכב.
3. לחות החיישנים: Pipette 200 μL של מים סטריליים לבאר לתוך צלחת השירות, ולאחר מכן בזהירות להחזיר את מחסנית החיישן תוך טבילת החיישנים במים. לדגור את המחסנית באינקובטור_{CO 2-חינם}ב 37 °C (50 °F) עד למחרת.
4. תבנית פרוטוקול ה- assay: עבור את המנתח (ראה טבלת חומרים) ויחידת הבקר. הפעל את תוכנת בקרת המכשירים ורכישת הנתונים ותכנן את פרוטוקול בדיקת ה- assay כמתואר בטבלה 2. תחת הגדרות קבוצה, צור ארבע אסטרטגיות הזרקה שבהן יציאה A שונה בהתאם למצע המוזרק ( איור3). תן שם לאסטרטגיות על שם המצעים או הקיצורים שלהן.
5. ליציאות B, C ו- D, הקצה את התרכובות אוליגומיצין, FCCP, ורוטנון / אנטימיצין A, בהתאמה. צרו שמונה קבוצות ותנו להן שם כפי שמוצג באיור 4. תחת מפת לוחות הקצה את הקבוצות לבארות המתאימות ולאחר מכן שמור את הפרוטוקול כתבנית מוכנה לשימוש. השאר את המנתח מופעל כדי לאפשר את הטמפרטורה להתייצב לילה. שמור את המנתח במקום עם טמפרטורה יציבה כדי למנוע שינויי טמפרטורה פתאומיים.

2. יום ההסתה

1. החלפת מים עם הכיול: להשליך את המים מצלחת השירות ו pipette 200 μL של כיול מוזהר מראש לכל באר לתוך צלחת השירות. החזר את המחסנית לאינקובטור_{CO 2-חינם}עד למועד ההסתה. כדי למנוע אידוי מהיר של הכיול, לשמור על מקור לחות בתוך האינקובטור ולכבה או להפחית את מהירות המאוורר למינימום.
2. הכנת פתרונות העבודה: התחל על ידי חימום 2x MAS, 5% BSA, ומים סטריליים ל 37 °C (5 °F). בינתיים, לאפשר את מלאי המעכב להגיע לטמפרטורת החדר. השתמש 2X MAS חם ומים מזוקקים סטריליים כדי להכין 5 מ"ל של ריכוז העבודה של המצעים והמעכבים כמתואר בטבלה 3.
3. טעינת יציאות ההזרקה: כפי שמוצג באיור 3, טען 20 μL של המצעים ליציאה A. טען תערובת תמציתית / רוטנון לתוך יציאה A של שורות A ו- B. לטעון תערובת pyruvate / malate לתוך יציאה A של שורות C ו- D. לטעון גלוטמט / תערובת malate לתוך יציאה A של שורות E ו- F. לטעון תערובת פלמיטויל קרניטין / malate לתוך יציאה A של שורות G ו- H. עבור כל הצלחת, לטעון יציאה B עם 22 μL של הכנת אוליגומיצין, יציאה C עם 25 μL של הכנת FCCP, ופורט D עם 27 μL של תערובת רוטנון / אנטימיצין A.
4. התחלת שלב הכיול: תחת הכרטיסיה הפעל את הכרטיסיה 'הפעלה של 'הפעלה', לחץ על 'התחל לרוץ' כדי להתחיל בבדיקה. הכנס את מחסנית החיישן הטעון והתחל את שלב הכיול. המתן להשלמת הכיול לפני שתמשיך לשלב הבא.
5. הכנת מדיום ה-assay (MAS-BSA-rPFO): להכנת 20 מ"ל של מדיום ה-assay, יש לערבב 10 מ"ל של 2x MAS, 9.2 מ"ל של מים סטריליים ו-0.8 מ"ל של 5% BSA בצינור 50 מ"ל. הוסף 2 μL של 10 rPFO μM כדי להשיג ריכוז של 1 ננומטר ו resuspend התערובת עם pipetting עדין. יש להימנע מרעדים ואין להשתמש במערבל מערבולת לערבוב. לדגור על הצינור ב 37 °C (55 °F) עד זמן השימוש.
6. שטיפת התאים: לשטוף את התאים ואת בארות ריקות ריק פעמיים עם סידן מוזהם מראש ללא סידן ומגנזיום ללא תמיסת מלח (PBS) באמצעות פיפטה רב ערוצית. הימנע משימוש חוזר באותן עצות כדי להשליך את המדיום של תרבית התא ולהוסיף PBS. בצע שלב זה מחוץ לזרימת למינאר כדי להגן על התאים מפני התייבשות על ידי זרימת האוויר.
7. חלחלות תאים במדיום אסאי: באמצעות פיפטה רב-ערוצית, השלך את ה-PBS והחלף אותו ב-180 מיקרו-אל של מדיום ה-assay המואר מראש (MAS-BSA-rPFO).
8. התחלת המדידה: מיד לאחר ההחלמה, החלף את צלחת השירות של מחסנית החיישן המכוילת בלוח התא והתחל את המדידה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

התחל על ידי נרמול התוצאות למדידה השנייה של נשימה בסיסית כדי להציג ערכים כאחוז צריכת חמצן (OCR%). תוצאות ההסתה מוצגות באיורים 5, איור 6, איור 7 ואיור 8 . חשוב להקצות את בארות הרקע המתאימות לכל קבוצה ולהנטרל את באר...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרוטוקול זה הוא שינוי של מחקרים שפורסמו בעבר^7,8,9,10 ואת מדריך המשתמש במוצר. בניגוד לפרוטוקול היצרן, 2x MAS משמש במקום 3x MAS, שכן 2× MAS קל יותר להתמוסס ואינו יוצר משקעים לאחר הקפאה. ניתן לאחסן עד שישה חודשים ולהראות תוצאות עקביות...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate	Merck	A5285	store at -20 °C
Antimycin A	Merck	A8674	store at -20 °C
Bovine serum albumin	Merck	A3803	store at 2 - 8 °C
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Merck	C2920	store at -20 °C
Dimethyl sulfoxide	Merck	D8418	store at RT
D-Mannitol	Merck	63559	store at RT
Dulbecco's phosphate buffered saline	Gibco	14190-144	store at RT
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid	Merck	03777	store at RT
HEPES	Merck	H7523	store at RT
L(-)Malic acid disodium salt	Merck	M9138	store at RT
L-Glutamic acid sodium salt hydrate	Merck	G5889	store at RT
Magnesium chloride hexahydrate	Merck	M2670	store at RT
Oligomycin	Merck	O4876	store at -20 °C
Palmitoyl-DL-carnitine chloride	Merck	P4509	store at -20 °C
Potassium hydroxide	Merck	484016	store at RT
Potassium phosphate monobasic	Merck	P5655	store at RT
Rotenone	Merck	R8875	store at -20 °C
Seahorse Wave Desktop Software	Agilent technologies		Download from www.agilent.com
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent technologies
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent technologies	102416-100	XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates
Sodium pyruvate	Merck	P2256	store at 2 - 8 °C
Sodium succinate dibasic hexahydrate	Merck	S2378	store at RT
Sucrose	Merck	S7903	store at RT
Water	Merck	W3500	store at RT
XF calibrant	Agilent technologies	100840-000	store at RT
XF Plasma membrane permeabilizer	Agilent technologies	102504-100	Recombinant perfringolysin O (rPFO) - Aliquot and store at -20 °C