Messung des mitochondrialen Substratflusses in rekombinanten Perfringolysin O-permeabilisierten Zellen

Zusammenfassung

In dieser Arbeit beschreiben wir ein modifiziertes Protokoll zum Testen des mitochondrialen respiratorischen Substratflusses unter Verwendung von rekombinantem Perfringolysin O in Kombination mit mikroplattenbasierter Respirometrie. Mit diesem Protokoll zeigen wir, wie Metformin die mitochondriale Atmung von zwei verschiedenen Tumorzelllinien beeinflusst.

Zusammenfassung

Der mitochondriale Substratfluss ist ein Unterscheidungsmerkmal jedes Zelltyps, und Veränderungen seiner Komponenten wie Transporter, Kanäle oder Enzyme sind an der Pathogenese mehrerer Krankheiten beteiligt. Mitochondrialer Substratfluss kann mit intakten Zellen, permeabilisierten Zellen oder isolierten Mitochondrien untersucht werden. Die Untersuchung intakter Zellen stößt aufgrund der gleichzeitigen Oxidation verschiedener Substrate auf mehrere Probleme. Außerdem enthalten mehrere Zelltypen interne Speicher verschiedener Substrate, die die Interpretation der Ergebnisse erschweren. Methoden wie die mitochondriale Isolierung oder die Verwendung von Permeabilisatoren sind nicht leicht reproduzierbar. Die Isolierung reiner Mitochondrien mit intakten Membranen in ausreichenden Mengen aus kleinen Proben ist problematisch. Die Verwendung von nicht-selektiven Permeabilisatoren verursacht verschiedene Grade unvermeidlicher mitochondrialer Membranschäden. Rekombinantes Perfringolysin O (rPFO) wurde dank seiner Fähigkeit, die Plasmamembran selektiv zu permeabilisieren, ohne die mitochondriale Integrität zu beeinträchtigen, als geeigneterer Permeabilisator angeboten. In Kombination mit der Mikroplatten-Respirometrie ermöglicht es, den Fluss mehrerer mitochondrialer Substrate mit genügend Replikaten innerhalb eines Experiments unter Verwendung einer minimalen Anzahl von Zellen zu testen. In dieser Arbeit beschreibt das Protokoll eine Methode zum Vergleich des mitochondrialen Substratflusses von zwei verschiedenen zellulären Phänotypen oder Genotypen und kann angepasst werden, um verschiedene mitochondriale Substrate oder Inhibitoren zu testen.

Einleitung

Die Mikroplatten-basierte Respirometrie hat die mitochondriale Forschung revolutioniert, indem sie die Untersuchung der Zellatmung einer kleinen Stichprobengröße^{ermöglicht 1}. Die Zellatmung wird im Allgemeinen als Indikator für die mitochondriale Funktion oder "Dysfunktion" angesehen, obwohl der mitochondriale Funktionsumfang über die Energieproduktion hinausgeht². Unter aeroben Bedingungen extrahieren Mitochondrien die in verschiedenen Substraten gespeicherte Energie, indem sie diese Substrate abbauen und in metabolische Zwischenprodukte umwandeln, die den Zitronensäurezyklus³ antreiben können (Abbildung 1). Der kontinuierliche Fluss von Substraten ist essentiell für den Fluss des Zitronensäurezyklus, um hochenergetische "Elektronendonatoren" zu erzeugen, die Elektronen an die Elektronentransportkette liefern, die einen Protonengradienten über die innere mitochondriale Membran erzeugt, so dass die ATP-Synthase ADP zu ATP⁴phosphorylieren kann. Daher muss ein experimentelles Design zur Untersuchung der mitochondrialen Atmung die Probennatur (intakte Zellen, permeabilisierte Zellen oder isolierte Mitochondrien) und mitochondriale Substrate umfassen.

Zellen halten einen Vorrat an einheimischen Substraten⁵, und Mitochondrien oxidieren mehrere Arten von Substraten gleichzeitig⁶, was die Interpretation von Ergebnissen aus Experimenten an intakten Zellen erschwert. Ein gängiger Ansatz zur Untersuchung der mitochondrialen Fähigkeit, ein ausgewähltes Substrat zu oxidieren, besteht darin, Mitochondrien zu isolieren oder die untersuchten Zellen zu permeabilisieren⁵. Obwohl isolierte Mitochondrien ideal für quantitative Studien sind, ist der Isolationsprozess mühsam. Es steht vor technischen Schwierigkeiten wie der Notwendigkeit eines großen Stichprobenumfangs, der Reinheit der Ausbeute und der Reproduzierbarkeit der Technik⁵. Permeabilisierte Zellen bieten eine Lösung für die Nachteile der mitochondrialen Isolierung; Routinemäßige Permeabilisatoren der Detergenziennatur sind jedoch nicht spezifisch und können die mitochondrialen Membranen schädigen⁵.

Rekombinantes Perfringolysin O (rPFO) wurde als selektives Plasmamembranpermeabilisierungsmittel⁷angeboten und in mehreren Studien⁷,^8,9,10erfolgreich in Kombination mit einem extrazellulären Flussmittelanalysator eingesetzt . Wir haben ein Protokoll mit rPFO modifiziert, um den mitochondrialen Substratfluss mit dem extrazellulären Flussanalysator XFe96 zu screenen. In diesem Protokoll werden vier verschiedene Substratoxidationswege in zwei zellulären Phänotypen verglichen, während ausreichende Replikate und die richtige Kontrolle für jedes getestete Material vorhanden sind.

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Protokoll

1. Einen Tag vor dem Assay

1. Herstellung von Reagenzien und Substraten.
   1. Mitochondriale Assay-Lösung (MAS): Herstellung von Stammlösungen aller Reagenzien wie in Tabelle 1beschrieben. Erwärmen Sie die Bestände an Mannitol und Saccharose auf 37 °C, um sich vollständig aufzulösen. Mischen Sie die Reagenzien, um 2x MAS vorzubereiten, dann erwärmen Sie die Mischung auf 37 ° C. Stellen Sie den pH-Wert mit 5N KOH auf 7,4 (~ 7 ml) ein, fügen Sie dann Wasser hinzu, um das Volumen auf 1 L zu bringen. Filtern Sie die Aliquots und lagern Sie die Aliquots bis zum Messtag bei -20 ° C.
   2. Rinderserumalbumin (5% BSA): 5 g BSA in 90 ml vorgewärmtem sterilem Wasser auf einem Magnetrührer auflösen und Schütteln vermeiden. Stellen Sie den pH-Wert mit 5 N KOH auf 7,4 ein und fügen Sie dann Wasser hinzu, um das Volumen auf 100 ml zu bringen. Filtriern-sterilisieren und lagern Sie die Aliquots bei -20 °C bis zum Messtag.
   3. Mitochondriale Substrate: Bereiten Sie 1 M Stammlösungen von Natriumsuccinat, Natriumpyruvat und Natriumglutamat in sterilem Wasser vor. Bereiten Sie 100 mM Stammlösung von Natriummalat in sterilem Wasser vor und verwenden Sie vorgewärmtes steriles Wasser, um eine 10 mM Stammlösung von Palmitoylcarnitin herzustellen. Stellen Sie den pH-Wert jeder Lösung auf 7,4 x 5 N KOH ein und filtern Sie ihn. Lagern Sie die Substrate bei 2-8 °C. Zum Zeitpunkt der Anwendung Palmitoylcarnitin auf 37 °C erwärmen, um etwaige Ausscheidungen aufzulösen. Zur späteren Verwendung aliquots aller Substrate außer Pyruvat bei -20 °C lagern.
   4. Mitochondriale Inhibitoren: Dimethylsulfoxid (DMSO) zur Herstellung von Stammlösungen aus 25 mM Oligomycin, 50 mM Carbonylcyanid 4-(Trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP), 20 mM Rotenon und 20 mM Antimycin A. Lagern Sie die Aliquots bei -20 °C.
2. Seeding und Behandlung der Zellen: Wie in Abbildung 2gezeigt, säen Sie die Zellen in den Spalten 2-11. Die Spalten 1 und 12 müssen leer gelassen werden, um als Hintergrundschächte zu dienen. In dieser Arbeit wurden HepG2- und A549-Zellen verwendet.
   1. Säen Sie die Zellen mit einer Dichte von 20.000 Zellen pro Vertiefung aus. Verwenden Sie 50-80 μL Zellkulturmedium für die Aussaat.
   2. Füllen Sie die leeren Vertiefungen mit einem gleichen Volumen Zellkulturmedium und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5%_CO2. Lassen Sie die Zellen für 3-4 Stunden anhaften und geben Sie dann 100 μL Zellkulturmedium zu allen Vertiefungen hinzu.
   3. Wenden Sie mit dieser letzten mittleren Zugabe die Behandlung in den Spalten 7–11 an. In dieser Arbeit wurde die experimentelle Gruppe 16 Stunden lang mit 1 mM Metforminhydrochlorid behandelt, und die Kontrollgruppe wurde mit einem gleichen Volumen sterilen destillierten Wassers als Vehikelkontrolle behandelt.
3. Hydratisierung der Sensoren: 200 μL steriles Wasser pro Vertiefung in die Versorgungsplatte pipettieren und dann die Sensorpatrone vorsichtig zurückgeben, während die Sensoren in Wasser eingetaucht werden. Inkubieren Sie die Kartusche in_{einem CO2-freien}Inkubator bei 37 °C bis zum nächsten Tag.
4. Die Assay-Protokollvorlage: Schalten Sie den Analysator (siehe Materialtabelle)und die Controller-Einheit ein. Starten Sie die Gerätesteuerungs- und Datenerfassungssoftware, und entwerfen Sie das Assay-Protokoll wie in Tabelle 2beschrieben. Erstellen Sie unter Gruppendefinitionenvier Injektionsstrategien, bei denen sich Port A je nach injiziertem Substrat unterscheidet (Abbildung 3). Benennen Sie die Strategien nach den Substraten oder deren Abkürzungen.
5. Weisen Sie den Ports B, C und D die Verbindungen Oligomycin, FCCP bzw. Rotenon/Antimycin A zu. Erstellen Sie acht Gruppen, und benennen Sie sie wie in Abbildung 4 dargestellt. Weisen Sie unter Plate Map die Gruppen den entsprechenden Wells zu und speichern Sie das Protokoll dann als gebrauchsfertige Vorlage. Lassen Sie den Analysator eingeschaltet, damit sich die Temperatur über Nacht stabilisieren kann. Bewahren Sie den Analysator an einem Ort mit einer stabilen Temperatur auf, um plötzliche Temperaturänderungen zu vermeiden.

2. Der Tag des Assays

1. Ersetzen von Wasser durch den Kalifrant: Entsorgen Sie das Wasser von der Versorgungsplatte und pipettieren Sie 200 μL vorgewärmtes Calibrant pro Vertiefung in die Versorgungsplatte. Geben Sie die Kartusche bis zum Zeitpunkt des Assays in den_CO2-freienInkubator zurück. Um eine schnelle Verdunstung des Kalifrants zu vermeiden, halten Sie eine Feuchtigkeitsquelle im Inneren des Inkubators aufrecht und schalten Sie die Lüfterdrehzahl aus oder reduzieren Sie sie auf ein Minimum.
2. Vorbereitung der Arbeitslösungen: Beginnen Sie mit dem Erwärmen von 2x MAS, 5% BSA und sterilem Wasser auf 37 °C. In der Zwischenzeit lassen Sie die Inhibitorvorräte Raumtemperatur erreichen. Verwenden Sie warmes 2x MAS und steriles destilliertes Wasser, um 5 ml der Arbeitskonzentration der Substrate und Inhibitoren wie in Tabelle 3beschrieben herzustellen.
3. Laden der Injektionsöffnungen: Wie in Abbildung 3gezeigt, laden Sie 20 μL der Substrate in Port A. Laden Sie das Succinat/Rotenon-Gemisch in Port A der Reihen A und B. Laden Sie das Pyruvat/Malat-Gemisch in Port A der Reihen C und D. Laden Sie das Glutamat/Malat-Gemisch in Port A der Reihen E und F. Laden Sie das Palmitoylcarnitin/Malat-Gemisch in port A der Zeilen G und H. Für die gesamte Platte laden Sie Port B mit 22 μL Oligomycin-Vorbereitung, Port C mit 25 μL FCCP-Vorbereitung und Port D mit 27 μL Rotenon/Antimycin A-Gemisch.
4. Starten des Kalibrierungsschritts: Klicken Sie auf der Registerkarte Run Assay auf Start Run, um den Assay zu starten. Setzen Sie die geladene Sensorkassette ein und starten Sie den Kalibrierungsschritt. Warten Sie, bis die Kalibrierung abgeschlossen ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
5. Herstellung des Assay-Mediums (MAS-BSA-rPFO): Um 20 ml des Assay-Mediums herzustellen, mischen Sie 10 ml 2x MAS, 9,2 ml steriles Wasser und 0,8 ml 5% BSA in einem 50-ml-Röhrchen. Fügen Sie 2 μL 10 μM rPFO hinzu, um eine Konzentration von 1 nM zu erreichen, und resuspenieren Sie die Mischung mit schonender Pipettung. Vermeiden Sie Schütteln und verwenden Sie keinen Wirbelmischer zum Mischen. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 °C bis zum Zeitpunkt der Verwendung.
6. Waschen der Zellen: Waschen Sie die Zellen und die leeren Rohlinge zweimal mit vorgewärmter kalzium- und magnesiumfreier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einer Mehrkanalpipette. Vermeiden Sie es, die gleichen Spitzen wiederzuverwenden, um das Zellkulturmedium zu verwerfen und PBS hinzuzufügen. Führen Sie diesen Schritt außerhalb der laminaren Strömung durch, um die Zellen vor dem Austrocknen durch den Luftstrom zu schützen.
7. Zellpermeabilisierung im Assay-Medium: Verwerfen Sie das PBS mit einer Mehrkanalpipette und ersetzen Sie es durch 180 μL des vorgewärmten Assay-Mediums (MAS-BSA-rPFO).
8. Beginn der Messung: Ersetzen Sie unmittelbar nach der Permeabilisierung die Versorgungsplatte der kalibrierten Sensorpatrone durch die Zellplatte und starten Sie die Messung.

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Ergebnisse

Beginnen Sie mit der Normalisierung der Ergebnisse auf die zweite Messung der Baseline-Atmung, um Werte als Prozentsatz der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) anzuzeigen. Die Ergebnisse des Assays sind in abbildung 5, Abbildung 6, Abbildung 7 und Abbildung 8 dargestellt. Es ist wichtig, jeder Gruppe die richtigen Hintergrundbohrungen zuzuweisen und die Hintergrundbohrungen...

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Diskussion

Dieses Protokoll ist eine Modifikation der zuvor veröffentlichten Studien^7,8,9,10 und des Produkt-Benutzerhandbuchs. Im Gegensatz zum Protokoll des Herstellers wird anstelle von 3x MAS 2x MAS verwendet, da 2× MAS leichter aufzulösen ist und nach dem Einfrieren keine Ausfällungen bildet. Gefrorene 2x MAS Aliquots können bis zu sechs Monate gelagert werden und zeigen konsistente Ergebnisse. ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate	Merck	A5285	store at -20 °C
Antimycin A	Merck	A8674	store at -20 °C
Bovine serum albumin	Merck	A3803	store at 2 - 8 °C
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Merck	C2920	store at -20 °C
Dimethyl sulfoxide	Merck	D8418	store at RT
D-Mannitol	Merck	63559	store at RT
Dulbecco's phosphate buffered saline	Gibco	14190-144	store at RT
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid	Merck	03777	store at RT
HEPES	Merck	H7523	store at RT
L(-)Malic acid disodium salt	Merck	M9138	store at RT
L-Glutamic acid sodium salt hydrate	Merck	G5889	store at RT
Magnesium chloride hexahydrate	Merck	M2670	store at RT
Oligomycin	Merck	O4876	store at -20 °C
Palmitoyl-DL-carnitine chloride	Merck	P4509	store at -20 °C
Potassium hydroxide	Merck	484016	store at RT
Potassium phosphate monobasic	Merck	P5655	store at RT
Rotenone	Merck	R8875	store at -20 °C
Seahorse Wave Desktop Software	Agilent technologies		Download from www.agilent.com
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent technologies
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent technologies	102416-100	XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates
Sodium pyruvate	Merck	P2256	store at 2 - 8 °C
Sodium succinate dibasic hexahydrate	Merck	S2378	store at RT
Sucrose	Merck	S7903	store at RT
Water	Merck	W3500	store at RT
XF calibrant	Agilent technologies	100840-000	store at RT
XF Plasma membrane permeabilizer	Agilent technologies	102504-100	Recombinant perfringolysin O (rPFO) - Aliquot and store at -20 °C