Medindo flux de substrato mitocondrial em células o-permeabilizadas de permeabilized recombinante

Resumo

Neste trabalho, descrevemos um protocolo modificado para testar o flux de substrato respiratório mitocondrial usando perfringolysina recombinante O em combinação com respirometria à base de microplato. Com este protocolo, mostramos como a metformina afeta a respiração mitocondrial de duas linhas diferentes de células tumorais.

Resumo

O flux de substrato mitocondrial é uma característica distintiva de cada tipo de célula, e mudanças em seus componentes como transportadores, canais ou enzimas estão envolvidas na patogênese de várias doenças. Flux de substrato mitocondrial pode ser estudado usando células intactas, células permeabilizadas ou mitocôndrias isoladas. Investigar células intactas encontra vários problemas devido à oxidação simultânea de diferentes substratos. Além disso, vários tipos de células contêm lojas internas de diferentes substratos que complicam a interpretação dos resultados. Métodos como isolamento mitocondrial ou uso de agentes permeabilizantes não são facilmente reprodutíveis. Isolar mitocôndrias puras com membranas intactas em quantidades suficientes de pequenas amostras é problemático. O uso de permeabilizers não seletivos causa vários graus de danos inevitáveis da membrana mitocondrial. A perfringolysina recombinante O (rPFO) foi oferecida como um permeabilizer mais apropriado, graças à sua capacidade de permeabilize seletivamente a membrana plasmática sem afetar a integridade mitocondrial. Quando usado em combinação com respirometria de microplaco, permite testar o fluxo de vários substratos mitocondriais com réplicas suficientes dentro de um experimento enquanto usa um número mínimo de células. Neste trabalho, o protocolo descreve um método para comparar o flux de substrato mitocondrial de dois fenótipos ou genótipos celulares diferentes e pode ser personalizado para testar vários substratos mitocondriais ou inibidores.

Introdução

A respirometria baseada em microplacar revolucionou a pesquisa mitocondrial, permitindo o estudo da respiração celular de um pequeno tamanho amostral¹. A respiração celular é geralmente considerada como um indicador de função mitocondrial ou "disfunção", apesar do fato de que a gama mitocondrial de funções se estende além da produção de energia². Em condições aeróbicas, as mitocôndrias extraem a energia armazenada em diferentes substratos, quebrando e convertendo esses substratos em intermediários metabólicos que podem alimentar o ciclo do ácido cítrico³ (Figura 1). O fluxo contínuo de substratos é essencial para o fluxo do ciclo do ácido cítrico gerar "doadores de elétrons" de alta energia, que fornecem elétrons para a cadeia de transporte de elétrons que gera um gradiente de prótons através da membrana mitocondrial interna, permitindo atp-synthase para fosforilato ADP para ATP⁴. Portanto, um projeto experimental para avaliar a respiração mitocondrial deve incluir a natureza amostral (células intactas, células permeabilizadas ou mitocôndrias isoladas) e substratos mitocondriais.

As células mantêm um estoque de substratos indígenas⁵, e mitocôndrias oxidam vários tipos de substratos simultaneamente⁶, o que complica a interpretação dos resultados obtidos a partir de experimentos realizados em células intactas. Uma abordagem comum para investigar a capacidade mitocondrial de oxidar um substrato selecionado é isolar mitocôndrias ou permeabiliizar as células investigadas⁵. Embora mitocôndrias isoladas sejam ideais para estudos quantitativos, o processo de isolamento é trabalhoso. Enfrenta dificuldades técnicas como a necessidade de grande tamanho amostral, pureza do rendimento e reprodutibilidade da técnica⁵. As células permeabilizadas oferecem uma solução para as desvantagens do isolamento mitocondrial; no entanto, os agentes de permeabilização de rotina da natureza detergente não são específicos e podem danificar as membranas mitocondriais⁵.

A perfringolysina recombinante O (rPFO) foi oferecida como um agente de permeabilizing de membrana plasmática seletiva⁷, e foi utilizada com sucesso em combinação com um analisador de fluxo extracelular em vários estudos^7,8,9,10. Modificamos um protocolo usando rPFO para tela de flux de substrato mitocondrial usando o analisador de fluxo extracelular XFe96. Neste protocolo, quatro diferentes vias oxidantes de substratos em dois fenótipos celulares são comparadas, tendo réplicas suficientes e o controle adequado para cada material testado.

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Protocolo

1. Um dia antes do ensaio

1. Preparação de reagentes e substratos.
   1. Solução de ensaio mitocondrial (MAS): Prepare soluções de estoque de todos os reagentes descritos na Tabela 1. Aqueça os estoques de manitol e sacarose a 37 °C para dissolver completamente. Misture os reagentes para preparar 2x MAS e aqueça a mistura a 37 °C. Ajuste o pH com 5N KOH para 7,4 (~7 mL), depois adicione água para levar o volume até 1 L. Estérilize o filtro e armazene as alíquotas a -20 °C até o dia da medição.
   2. Albumina de soro bovino (5% BSA): Dissolver 5 g de BSA em 90 mL de água estéril pré-armada em um agitador magnético e evitar tremer. Ajuste o pH para 7,4 com KOH de 5 N e, em seguida, adicione água para levar o volume até 100 mL. Esterilize o filtro e armazene as alíquotas a -20 °C até o dia da medição.
   3. Substratos mitocondriais: Prepare 1 M de soluções de estoque de succinato de sódio, piruvato de sódio e glutamato de sódio em água estéril. Prepare a solução de estoque de 100 mM de malato de sódio em água estéril e use água estéril pré-armada para preparar uma solução de estoque de 10 mM de carnitina palmitoyl. Ajuste o pH de cada solução para 7,4 por 5 N KOH e esterilize o filtro. Armazene os substratos a 2-8 °C. No momento do uso, a carnitina palmitoyl quente a 37 °C para dissolver quaisquer precipitados. Para uso posterior, armazene alíquotas de todos os substratos, exceto piruvato a -20 °C.
   4. Inibidores mitocondriais: Use sulfoxida de dimetil (DMSO) para preparar soluções de estoque de oligomicina de 25 mM, cianeto carbonil 4-(trifluorometoxy) fenilhydrazone (FCCP), 20 mM rotenona e 20 mM antimicina A. Armazenar as alíquotas a -20 °C.
2. Semeadura e tratamento das células: Como mostrado na Figura 2, semeou as células nas colunas 2-11. As colunas 1 e 12 devem ser deixadas vazias para servir como poços de fundo. Neste trabalho, foram utilizadas células HepG2 e A549.
   1. Semeou as células a uma densidade de 20.000 células por poço. Use 50-80 μL de meio de cultura celular para semeadura.
   2. Encha os poços em branco com um volume igual de meio de cultura celular e incuba as células a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂. Deixe as células anexar por 3-4 horas e, em seguida, adicione 100 μL de cultura celular ao nível de todos os poços.
   3. Com essa adição final do meio, aplique o tratamento nas colunas 7-11. Neste trabalho, o grupo experimental foi tratado com cloridrato de metformina de 1 mM durante 16 horas, e o grupo controle foi tratado com igual volume de água destilada estéril como controle veicular.
3. Hidratando os sensores: Pipeta 200 μL de água estéril por poço na placa de utilidade, em seguida, devolva cuidadosamente o cartucho do sensor enquanto imergi os sensores na água. Incubar o cartucho em uma incubadora livre de CO₂a 37 °C até o dia seguinte.
4. O modelo de protocolo de ensaio: Ligue o analisador (ver Tabela de Materiais) e a unidade controladora. Inicie o software de controle de instrumentos e aquisição de dados e projete o protocolo de ensaio conforme descrito na Tabela 2. Em Definições de Grupo,crie quatro estratégias de injeção onde a Porta A difere de acordo com o substrato injetado(Figura 3). Nomeie as estratégias após os substratos ou suas abreviaturas.
5. Às portas B, C e D, atribuem os compostos oligomicina, FCCP e rotenona/antimicina A, respectivamente. Crie oito grupos e nomeie-os como mostrado na Figura 4. Em Mapa de placas, atribua os grupos aos poços correspondentes e, em seguida, salve o protocolo como um modelo pronto para uso. Deixe o analisador ligado para permitir que a temperatura se estabilize durante a noite. Mantenha o analisador em um lugar com temperatura estável para evitar mudanças bruscas de temperatura.

2. O dia do ensaio

1. Substituição da água pelo calibrador: Descarte a água da placa de utilidade e a pipeta de 200 μL de calibrante pré-armado por poço na placa de utilidade. Devolva o cartucho à incubadora sem CO₂até o momento do ensaio. Para evitar a evaporação rápida do calibrador, mantenha uma fonte de umidade dentro da incubadora e desligue ou reduza a velocidade do ventilador ao mínimo.
2. Preparando as soluções de trabalho: Comece aquecendo 2x MAS, 5% BSA e água estéril a 37 °C. Enquanto isso, permita que os estoques inibidores atinjam a temperatura ambiente. Use 2x MAS quente e água destilada estéril para preparar 5 mL da concentração de trabalho dos substratos e inibidores conforme descrito na Tabela 3.
3. Carregando as portas de injeção: Como mostrado na Figura 3, carregue 20 μL dos substratos na porta A. Carregue a mistura de succinato/rotenona na porta A das linhas A e B. Carregue a mistura piruvato/malato na porta A das linhas C e D. Carregue a mistura de glutamato/malato na porta A das linhas E e F. Carregue a mistura de carnitina/malato palmitoyl na porta A de linhas G e H. Para toda a placa, carregue a porta B com 22 μL de preparação de oligomicina, a porta C com 25 μL de preparação da FCCP e a porta D com 27 μL de mistura de rotenona/antimicina A.
4. Iniciando a etapa de calibração: Na guia Executar o ensaio, clique em Iniciar a execução para iniciar o ensaio. Insira o cartucho do sensor carregado e inicie a etapa de calibração. Aguarde que a calibração seja concluída antes de prosseguir para a próxima etapa.
5. Preparação do meio de ensaio (MAS-BSA-rPFO): Para preparar 20 mL do meio de ensaio, misture 10 mL de 2x MAS, 9,2 mL de água estéril e 0,8 mL de 5% BSA em um tubo de 50 mL. Adicione 2 μL de 10 μM rPFO para atingir uma concentração de 1 nM e resuspensar a mistura com tubulação suave. Evite tremer e não use uma batedeira de vórtice para misturar. Incubar o tubo a 37 °C até o momento do uso.
6. Lavagem das células: Lave as células e os poços vazios em branco duas vezes com soro fisco pré-cozido e sem fosfato (PBS) usando uma pipeta multicanal. Evite reutilizar as mesmas dicas para descartar o meio de cultura celular e adicionar PBS. Realize este passo fora do fluxo laminar para proteger as células de secar pelo fluxo de ar.
7. Permeabilização celular no meio de ensaio: Utilizando uma pipeta multicanal, descarte o PBS e substitua-o por 180 μL do meio de ensaio pré-armado (MAS-BSA-rPFO).
8. Iniciando a medição: Imediatamente após a permeabilização, substitua a placa de utilidade do cartucho do sensor calibrado pela placa celular e inicie a medição.

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Resultados

Comece pela normalização dos resultados para a segunda medição da respiração da linha de base para mostrar valores como percentual de taxa de consumo de oxigênio (OCR%). Os resultados do ensaio são mostrados nas Figuras 5,Figura 6,Figura 7 e Figura 8. É importante atribuir os poços de fundo adequados para cada grupo e inativar os poços de fundo de outros gru...

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Discussão

Este protocolo é uma modificação dos estudos publicados anteriormente^7,8,9,10 e o guia do usuário do produto. Em contraste com o protocolo do fabricante, o 2x MAS é usado em vez de 3x MAS, uma vez que 2× MAS é mais fácil de dissolver e não forma precipitações após o congelamento. Alíquotas MAS 2x congeladas podem ser armazenadas até seis meses e mostrar resultados consistentes. Ou...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate	Merck	A5285	store at -20 °C
Antimycin A	Merck	A8674	store at -20 °C
Bovine serum albumin	Merck	A3803	store at 2 - 8 °C
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Merck	C2920	store at -20 °C
Dimethyl sulfoxide	Merck	D8418	store at RT
D-Mannitol	Merck	63559	store at RT
Dulbecco's phosphate buffered saline	Gibco	14190-144	store at RT
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid	Merck	03777	store at RT
HEPES	Merck	H7523	store at RT
L(-)Malic acid disodium salt	Merck	M9138	store at RT
L-Glutamic acid sodium salt hydrate	Merck	G5889	store at RT
Magnesium chloride hexahydrate	Merck	M2670	store at RT
Oligomycin	Merck	O4876	store at -20 °C
Palmitoyl-DL-carnitine chloride	Merck	P4509	store at -20 °C
Potassium hydroxide	Merck	484016	store at RT
Potassium phosphate monobasic	Merck	P5655	store at RT
Rotenone	Merck	R8875	store at -20 °C
Seahorse Wave Desktop Software	Agilent technologies		Download from www.agilent.com
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent technologies
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent technologies	102416-100	XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates
Sodium pyruvate	Merck	P2256	store at 2 - 8 °C
Sodium succinate dibasic hexahydrate	Merck	S2378	store at RT
Sucrose	Merck	S7903	store at RT
Water	Merck	W3500	store at RT
XF calibrant	Agilent technologies	100840-000	store at RT
XF Plasma membrane permeabilizer	Agilent technologies	102504-100	Recombinant perfringolysin O (rPFO) - Aliquot and store at -20 °C