Misurazione del flusso del substrato mitocondriale in cellule ricombinanti perfringolisina O-permeabilizzate

Riepilogo

In questo lavoro, descriviamo un protocollo modificato per testare il flusso del substrato respiratorio mitocondriale utilizzando la perfringolisina O ricombinante in combinazione con la respirometria basata su micropiastre. Con questo protocollo, mostriamo come la metformina influisce sulla respirazione mitocondriale di due diverse linee cellulari tumorali.

Abstract

Il flusso del substrato mitocondriale è una caratteristica distintiva di ciascun tipo di cellula e i cambiamenti nei suoi componenti come trasportatori, canali o enzimi sono coinvolti nella patogenesi di diverse malattie. Il flusso del substrato mitocondriale può essere studiato utilizzando cellule intatte, cellule permeabilizzate o mitocondri isolati. Lo studio delle cellule intatte incontra diversi problemi a causa dell'ossidazione simultanea di diversi substrati. Inoltre, diversi tipi di cellule contengono depositi interni di diversi substrati che complicano l'interpretazione dei risultati. Metodi come l'isolamento mitocondriale o l'uso di agenti permeabilizzanti non sono facilmente riproducibili. Isolare i mitocondri puri con membrane intatte in quantità sufficienti da piccoli campioni è problematico. L'uso di permeabilizzanti non selettivi provoca vari gradi di inevitabile danno alla membrana mitocondriale. La perfringolisina ricombinante O (rPFO) è stata offerta come permeabilizzante più appropriato, grazie alla sua capacità di permeabilizzare selettivamente la membrana plasmatica senza compromettere l'integrità mitocondriale. Se utilizzato in combinazione con la respirometria a micropiastre, consente di testare il flusso di diversi substrati mitocondriali con abbastanza repliche all'interno di un esperimento utilizzando un numero minimo di cellule. In questo lavoro, il protocollo descrive un metodo per confrontare il flusso del substrato mitocondriale di due diversi fenotipi cellulari o genotipi e può essere personalizzato per testare vari substrati o inibitori mitocondriali.

Introduzione

La respirometria basata su micropiastre ha rivoluzionato la ricerca mitocondriale consentendo lo studio della respirazione cellulare di un campione di piccole dimensioni¹. La respirazione cellulare è generalmente considerata un indicatore della funzione mitocondriale o "disfunzione", nonostante il fatto che la gamma di funzioni mitocondriali si estenda oltre la produzione di energia². In condizioni aerobiche, i mitocondri estraggono l'energia immagazzinata in diversi substrati scomponendo e convertendo questi substrati in intermedi metabolici che possono alimentare il ciclo dell'acido citrico³ (Figura 1). Il flusso continuo di substrati è essenziale per il flusso del ciclo dell'acido citrico per generare "donatori di elettroni" ad alta energia, che forniscono elettroni alla catena di trasporto degli elettroni che genera un gradiente protonico attraverso la membrana mitocondriale interna, consentendo all'ATP-sintasi di fosforilare ADP in ATP⁴. Pertanto, un progetto sperimentale per analizzare la respirazione mitocondriale deve includere la natura del campione (cellule intatte, cellule permeabilizzate o mitocondri isolati) e substrati mitocondriali.

Le cellule mantengono una riserva di substrati indigeni⁵e i mitocondri ossidano diversi tipi di substrati contemporaneamente^6,il che complica l'interpretazione dei risultati ottenuti da esperimenti eseguiti su cellule intatte. Un approccio comune per studiare la capacità mitocondriale di ossidare un substrato selezionato è quello di isolare i mitocondri o permeabilizzare le cellule studiate⁵. Sebbene i mitocondri isolati siano ideali per studi quantitativi, il processo di isolamento è laborioso. Affronta difficoltà tecniche come la necessità di grandi dimensioni del campione, la purezza della resa e la riproducibilità della tecnica⁵. Le cellule permeabilizzate offrono una soluzione per gli svantaggi dell'isolamento mitocondriale; tuttavia, gli agenti permeabilizzanti di routine di natura detergente non sono specifici e possono danneggiare le membrane mitocondriali⁵.

La perfringolisina ricombinante O (rPFO) è stata offerta come agente permeabilizzante selettivo della membrana plasmatica⁷ed è stata utilizzata con successo in combinazione con un analizzatore di flusso extracellulare in diversi studi^7,8,9,10. Abbiamo modificato un protocollo che utilizza rPFO per lo screening del flusso del substrato mitocondriale utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare XFe96. In questo protocollo, vengono confrontate quattro diverse vie ossidanti del substrato in due fenotipi cellulari pur avendo repliche sufficienti e il controllo adeguato per ciascun materiale testato.

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Protocollo

1. Un giorno prima del test

1. Preparazione di reagenti e substrati.
   1. Soluzione per saggio mitocondriale (MAS): preparare le soluzioni stock di tutti i reagenti come descritto nella Tabella 1. Riscaldare le scorte di mannitolo e saccarosio a 37 °C per sciogliere completamente. Mescolare i reagenti per preparare 2 MAS, quindi riscaldare la miscela a 37 °C. Regolare il pH con 5N KOH a 7,4 (~7 mL), quindi aggiungere acqua per portare il volume fino a 1 L. Filtrare e conservare le aliquote a -20 °C fino al giorno della misurazione.
   2. Albumina sierica bovina (5% BSA): Sciogliere 5 g di BSA in 90 ml di acqua sterile preriscaldata su un agitatore magnetico ed evitare di agitare. Regolare il pH a 7,4 con 5 N KOH, quindi aggiungere acqua per portare il volume a 100 ml. Filtrare e conservare le aliquote a -20 °C fino al giorno della misurazione.
   3. Substrati mitocondriali: Preparare 1 M soluzioni stock di succinato di sodio, piruvato di sodio e glutammato di sodio in acqua sterile. Preparare 100 mM di soluzione madre di malato di sodio in acqua sterile e utilizzare acqua sterile preriscaldata per preparare una soluzione madre da 10 mM di palmitoil carnitina. Regolare il pH di ciascuna soluzione a 7,4 per 5 N KOH e sterilizzare con filtro. Conservare i substrati a 2-8 °C. Al momento dell'uso, riscaldare la palmitoil carnitina a 37 °C per sciogliere eventuali precipitati. Per un uso successivo, conservare le aliquote di tutti i substrati ad eccezione del piruvato a -20 °C.
   4. Inibitori mitocondriali: utilizzare il dimetilsolfossido (DMSO) per preparare soluzioni stock di 25 mM di oligomicina, 50 mM di carbonil cianuro 4-(trifluorometosi) fenilidrazone (FCCP), 20 mM di rotenone e 20 mM di antimicina A. Conservare le aliquote a -20 °C.
2. Semina e trattamento delle cellule: come mostrato nella Figura 2, semina le celle nelle colonne 2-11. Le colonne 1 e 12 devono essere lasciate vuote per fungere da pozzetti di sfondo. In questo lavoro sono state utilizzate celle HepG2 e A549.
   1. Semina le cellule ad una densità di 20.000 cellule per pozzetto. Utilizzare 50-80 μL di terreno di coltura cellulare per la semina.
   2. Riempire i pozzetti vuoti con un volume uguale di terreno di coltura cellulare e incubare le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO_2. Lasciare che le cellule si attacchino per 3-4 ore, quindi aggiungere 100 μL di terreno di coltura cellulare a tutti i pozzetti.
   3. Con l'aggiunta finale del mezzo, applicare il trattamento nelle colonne 7-11. In questo lavoro, il gruppo sperimentale è stato trattato con 1 mM di metformina cloridrato per 16 ore e il gruppo di controllo è stato trattato con un volume uguale di acqua distillata sterile come controllo del veicolo.
3. Idratazione dei sensori: pipettare 200 μL di acqua sterile per pozzo nella piastra di utilità, quindi restituire con attenzione la cartuccia del sensore durante l'immersione dei sensori in acqua. Incubare la cartuccia in un incubatore privo di CO₂a 37 °C fino al giorno successivo.
4. Il modello di protocollo di analisi: accendere l'analizzatore (vedere Tabella dei materiali)e l'unità di controllo. Avviare il software di controllo dello strumento e di acquisizione dati e progettare il protocollo di analisi come descritto nella Tabella 2. In Definizioni di gruppo, creare quattro strategie di iniezione in cui la porta A differisce in base al substrato iniettato ( Figura3). Assegna alle strategie il nome dei substrati o delle loro abbreviazioni.
5. Alle porte B, C e D, assegnare rispettivamente i composti oligomicina, FCCP e rotenone/antimicina A. Create otto gruppi e denominateli come illustrato nella Figura 4. In Plate Map assegnare i gruppi ai pozzetti corrispondenti, quindi salvare il protocollo come modello pronto all'uso. Lasciare l'analizzatore acceso per consentire alla temperatura di stabilizzarsi durante la notte. Tenere l'analizzatore in un luogo con una temperatura stabile per evitare improvvisi sbalzi di temperatura.

2. Il giorno del test

1. Sostituzione dell'acqua con il calibrante: scartare l'acqua dalla piastra di utilità e dalla pipetta 200 μL di calibrante preribalizzato per pozzo nella piastra di utilità. Riportare la cartuccia all'incubatore privo di CO₂fino al momento del test. Per evitare una rapida evaporazione del calibrante, mantenere una fonte di umidità all'interno dell'incubatore e spegnere o ridurre al minimo la velocità della ventola.
2. Preparazione delle soluzioni di lavoro: iniziare riscaldando 2x MAS, 5% BSA e acqua sterile a 37 °C. Nel frattempo, consentire alle scorte di inibitori di raggiungere la temperatura ambiente. Utilizzare 2 MAS caldo e acqua distillata sterile per preparare 5 ml della concentrazione di lavoro dei substrati e degli inibitori come descritto nella Tabella 3.
3. Caricamento delle porte di iniezione: come mostrato nella Figura 3, caricare 20 μL dei substrati nella porta A. Caricare la miscela di succinato/rotenone nella porta A delle file A e B. Caricare la miscela di piruvato/malato nella porta A delle file C e D. Caricare la miscela di glutammato/malato nella porta A delle file E e F. Caricare la miscela palmitoil carnitina/malato nella porta A delle file G e H. Per l'intera piastra, porta di carico B con 22 μL di preparazione di oligomicina, porta C con 25 μL di preparazione FCCP e porta D con 27 μL di miscela di rotenone/antimicina A.
4. Avvio della fase di calibrazione: nella scheda Esegui test, fare clic su Avvia esecuzione per avviare il test. Inserire la cartuccia del sensore caricata e avviare la fase di calibrazione. Attendere il completamento della calibrazione prima di procedere al passaggio successivo.
5. Preparazione del mezzo di saggio (MAS-BSA-rPFO): per preparare 20 mL del mezzo di analisi, mescolare 10 mL di 2x MAS, 9,2 mL di acqua sterile e 0,8 mL di BSA al 5% in un tubo da 50 mL. Aggiungere 2 μL di 10 μM rPFO per ottenere una concentrazione di 1 nM e risospesciare la miscela con un pipettaggio delicato. Evitare di agitare e non utilizzare un miscelatore a vortice per la miscelazione. Incubare il tubo a 37 °C fino al momento dell'uso.
6. Lavare le cellule: lavare le cellule e i pozzetti vuoti vuoti due volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza calcio e magnesio preriscaldata utilizzando una pipetta multicanale. Evitare di riutilizzare le stesse punte per scartare il terreno di coltura cellulare e aggiungere PBS. Eseguire questa fase al di fuori del flusso laminare per proteggere le celle dall'essiccazione da parte del flusso d'aria.
7. Permeabilizzazione cellulare in mezzo di saggio: utilizzando una pipetta multicanale, scartare il PBS e sostituirlo con 180 μL del mezzo di saggio preriscaldato (MAS-BSA-rPFO).
8. Avvio della misurazione: immediatamente dopo la permeabilizzazione, sostituire la piastra di utilità della cartuccia del sensore calibrata con la piastra cellulare e avviare la misurazione.

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Risultati

Inizia normalizzando i risultati alla seconda misurazione della respirazione al basale per mostrare i valori come percentuale del tasso di consumo di ossigeno (OCR%). I risultati del test sono mostrati nelle Figure 5, Figura 6, Figura 7 e Figura 8. È importante assegnare i pozzetti di sfondo appropriati per ciascun gruppo e inattivare i pozzetti di sfondo di altri grup...

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Discussione

Questo protocollo è una modifica degli studi precedentemente pubblicati^7,8,9,10 e della guida per l'utente del prodotto. A differenza del protocollo del produttore, viene utilizzato 2x MAS invece di 3x MAS, poiché 2× MAS è più facile da sciogliere e non forma precipitazioni dopo il congelamento. Le aliquote MAS congelate 2x possono essere conservate fino a sei mesi e mostrare risultati coe...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate	Merck	A5285	store at -20 °C
Antimycin A	Merck	A8674	store at -20 °C
Bovine serum albumin	Merck	A3803	store at 2 - 8 °C
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Merck	C2920	store at -20 °C
Dimethyl sulfoxide	Merck	D8418	store at RT
D-Mannitol	Merck	63559	store at RT
Dulbecco's phosphate buffered saline	Gibco	14190-144	store at RT
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid	Merck	03777	store at RT
HEPES	Merck	H7523	store at RT
L(-)Malic acid disodium salt	Merck	M9138	store at RT
L-Glutamic acid sodium salt hydrate	Merck	G5889	store at RT
Magnesium chloride hexahydrate	Merck	M2670	store at RT
Oligomycin	Merck	O4876	store at -20 °C
Palmitoyl-DL-carnitine chloride	Merck	P4509	store at -20 °C
Potassium hydroxide	Merck	484016	store at RT
Potassium phosphate monobasic	Merck	P5655	store at RT
Rotenone	Merck	R8875	store at -20 °C
Seahorse Wave Desktop Software	Agilent technologies		Download from www.agilent.com
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent technologies
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent technologies	102416-100	XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates
Sodium pyruvate	Merck	P2256	store at 2 - 8 °C
Sodium succinate dibasic hexahydrate	Merck	S2378	store at RT
Sucrose	Merck	S7903	store at RT
Water	Merck	W3500	store at RT
XF calibrant	Agilent technologies	100840-000	store at RT
XF Plasma membrane permeabilizer	Agilent technologies	102504-100	Recombinant perfringolysin O (rPFO) - Aliquot and store at -20 °C