組換えペルフリンゴライシンO-透過細胞におけるミトコンドリア基質フラックスの測定

要約

本研究では、マイクロプレートベースの呼吸法と組み合わせて組み換えパーフリンゴライシンOを用いてミトコンドリア呼吸基質フラックスを試験する改変プロトコルについて説明する。このプロトコルを用いて、メトホルミンが2つの異なる腫瘍細胞株のミトコンドリア呼吸にどのように影響するかを示す。

要約

ミトコンドリア基質フラックスは、各細胞型の特徴であり、トランスポーター、チャネル、酵素などの成分の変化が、いくつかの疾患の病因に関与している。ミトコンドリア基質フラックスは、インタクト細胞、透過細胞、または単離ミトコンドリアを用いて研究することができる。無傷の細胞を調査することは、異なる基質の同時酸化のためにいくつかの問題に遭遇する。また、いくつかの細胞タイプは結果解釈を複雑にする異なる基質の内部ストアを含む。ミトコンドリアの分離や透過性の薬剤の使用などの方法は、容易に再現できません。小さいサンプルから十分な量の無傷の膜で純粋なミトコンドリアを分離することは問題である。非選択的パーメアビライザーを使用すると、さまざまな程度の不可避ミトコンドリア膜損傷を引き起こす。組換えペルフリンゴライシンO(rPFO)は、ミトコンドリア完全性に影響を与えることなく、細胞膜を選択的に透過させる能力のおかげで、より適切なパーメアビライザーとして提供された。マイクロプレートの呼吸数と組み合わせて使用すると、最小数の細胞を使用しながら、1回の実験内で十分な反復を伴ういくつかのミトコンドリア基質のフラックスをテストすることができます。本研究では、このプロトコルは、2つの異なる細胞表現型または遺伝子型のミトコンドリア基質フラックスを比較する方法を説明し、様々なミトコンドリア基質または阻害剤を試験するようにカスタマイズすることができる。

概要

マイクロプレートベースの呼吸数は、小さいサンプルサイズ¹の細胞呼吸の研究を可能にすることによってミトコンドリア研究に革命を起こしました。細胞呼吸は、ミトコンドリア機能または「機能不全」の指標として一般的に考えられるが、ミトコンドリアの機能範囲がエネルギー産生を超えて広^{がっている2。}好気条件では、ミトコンドリアは、これらの基質を分解して、クエン酸サイクル³ を燃料とすることができる代謝中間体に変換することによって、異なる基質に蓄えられているエネルギーを抽出する(図1)。基質の連続流束は、クエン酸サイクルの流れに不可欠であり、高エネルギーの「電子ドナー」を生成し、内部ミトコンドリア膜を横切って陽子勾配を生成する電子輸送鎖に電子を送達し、ATP合成酵素がADPをATP⁴にリン酸化することを可能にする。したがって、ミトコンドリア呼吸をアッセイする実験計画には、サンプル性質(無傷細胞、透過細胞、または単離ミトコンドリア)およびミトコンドリア基質を含まなければならない。

細胞は先住民族の基質⁵の貯蔵を維持し、ミトコンドリアは、同時に数種類の基質を酸化する^6、無傷の細胞に対して行われた実験から得られた結果の解釈を複雑にする。選択した基質を酸化するミトコンドリア能力を調査する一般的なアプローチは、ミトコンドリアを単離するか、または調査した細胞⁵を透過させることである。分離ミトコンドリアは定量的研究に理想的ですが、分離プロセスは面倒です。大きなサンプルサイズ、収率の純度、技術⁵の再現性などの技術的な困難に直面しています。透過細胞はミトコンドリアの分離の欠点のためのソリューションを提供します;;しかし、洗剤の日常的な透過性剤は特異的ではなく、ミトコンドリア膜⁵に損傷を与える可能性がある。

組換えペルフリンゴライシンO(rPFO)は、選択的な血漿膜透過性剤⁷として提供され、そして、いくつかの研究^{7、8、9、10}において細胞外フラックス分析装置との併用に成功した。XFe96細胞外フラックス分析装置を用いて、rPFOを用いてミトコンドリア基質フラックスをスクリーニングするプロトコルを改変した。このプロトコルでは、2つの細胞型の4つの異なる基質酸化経路を比較し、試験した各材料に対して十分な反復と適切な制御を有する。

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プロトコル

1. アッセイの前日

1. 試薬および基質の調製。
   1. ミトコンドリアアッセイ溶液(MAS): 表1に記載されている全ての試薬のストック溶液を準備する。マンリトールとスクロースの在庫を37°Cに温め、完全に溶解します。試薬を混合して2倍のMASを調製し、その後、混合物を37°Cに温める。 5N KOHでpHを7.4(〜7 mL)に調整し、水を加え、体積を最大1 L.ろ過滅にし、測定日まで-20°Cでアリコートを保存します。
   2. ウシ血清アルブミン(5%BSA):BSAの5gを90mLのプリウォーム無菌水で磁気攪拌機で溶解し、揺れを避ける。5 N KOH で pH を 7.4 に調整し、水を加え、最大 100 mL のボリュームを持たします。フィルター殺菌し、測定日まで-20°Cでアリコートを保管します。
   3. ミトコンドリア基質:コハク酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウムの1Mストック溶液を滅菌水中で調製します。無菌水中のナトリウムマル酸の100 mMストック溶液を調製し、パルミトイルカルニチンの10 mMストック溶液を調製するために、事前に温めた無菌水を使用します。各溶液のpHを7.4,5 N KOHに調整し、フィルター滅菌します。基板は2~8°Cで保管してください。 使用時に、パルミトイルカルニチンを37°Cに温め、任意の沈殿物を溶解させた。後で使用するために、-20°Cでピルビン酸を除くすべての基質のアリコートを保存する。
   4. ミトコンドリア阻害剤:ジメチルスルホキシド(DMSO)を使用して、25 mMオリゴマイシン、50mMカルボニルシアニド4-(トリフルロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)、20mMロテネン、20mM抗ミシンAのストック溶液を調製します。
2. セルのシード処理と処理: 図 2に示すように、列 2 から 11 にセルをシードします。列 1 と 12 は、背景ウェルとして機能するために空のままにする必要があります。本研究では、HepG2およびA549細胞を用いた。
   1. ウェルあたり20,000個の細胞の密度で細胞を播種します。播種には50~80μLの細胞培養培地を使用してください。
   2. ブランクウェルを等量の細胞培養培地で満たし、5%CO2で加湿インキュベーターで37°Cの細胞をインキュベートする。細胞を3〜4時間取り付け、100μLの細胞培養培地を全てのウェルに加えます。
   3. その最終的な媒体の追加で、列7-11で処理を適用します。本研究では、実験群を1mMメトホルミン塩酸塩で16時間処理し、対照群を車両制御として等量の無菌蒸留水で処理した。
3. センサーのハイドレート:ユーティリティプレートに入れて、滅菌水のピペット200 μLをユーティリティプレートに入れ、センサーを水中に浸しながらセンサーカートリッジを慎重に戻します。次の日まで37°Cで_CO2フリーインキュベーターにカートリッジをインキュベートします。
4. アッセイプロトコルテンプレート:アナライザのスイッチ( 材料表を参照)とコントローラユニット。計測器制御およびデータ取得ソフトウェアを起動し、 表2に記載されているアッセイプロトコルを設計します。 [グループ定義] で、注入された基板に応じてポート A が異なる 4 つの射出方法を作成します (図 3)。基板またはその略称の後に戦略に名前を付けます。
5. ポートB、C、およびDに、それぞれオリゴマイシン、FCCP、ロテロン/アンチマイシンAの化合物を割り当てます。 図 4に示すように、8 つのグループを作成し、名前を付けます。プレート マップ で、対応するウェルにグループを割り当て、すぐに使用できるテンプレートとしてプロトコルを保存します。温度が一晩安定するように、アナライザーの電源を入れたままにしておきます。温度の急激な変化を避けるために、安定した温度の場所に分析装置を保管してください。

2. アッセイの日

1. 水をキャリバートに置き換える:ユーティリティプレートから水を捨て、プリウォームキャリブラントのピペット200 μLをユーティリティプレートに入れます。カートリッジをアッセイの時点まで_CO2-freeインキュベーターに戻します。キャリブラントの急速な蒸発を避けるために、インキュベーター内の湿度の源を維持し、ファンの速度を最小限にオフにするか、または減らします。
2. 作業ソリューションの準備:2x MAS、5%BSA、無菌水を37°Cに温めることから始めます。 一方、阻害剤の在庫が室温に達することを可能にする。表 3に記載されているように、5mLの基質および阻害剤の作業濃度を調製するために、温かい2x MASおよび滅菌蒸留水を使用する。
3. 注入ポートのロード: 図3に示すように、20 μLの基板をポートAにロードし、より小さい方/ロテノン混合物を行AのポートAにロードし、B.行CとD.ロード・グルタミン酸/マレート混合物を行EとF.ロードパルミトイル・カルニチン/マレート混合物を行AとHのポートにロードします。プレート全体では、22 μLのオリゴマイシン調製でポートBをロードし、25 μLのFCCP調製を用いたポートC、ロテノーン/アンチマイシンA混合物の27 μLを用いたポートDをロードします。
4. キャリブレーションステップの開始:[ アッセイの実行 ]タブで、[ 実行開始 ]をクリックしてアッセイを開始します。ロードしたセンサーカートリッジを挿入し、キャリブレーションステップを開始します。キャリブレーションが完了するまで待ってから、次の手順に進みます。
5. アッセイ媒体(MAS-BSA-rPFO)の調製:20mLのアッセイ培地を調製し、2x MASの10mL、無菌水9.2mL、50mLのBSAの0.8mLを50mLチューブに混合します。10 μM rPFOの2 μLを加えて1 nMの濃度を達成し、穏やかなピペットで混合物を再懸濁させます。揺れを避け、混合には渦ミキサーを使用しないでください。使用時まで37°Cでチューブをインキュベートする。
6. 細胞を洗う:マルチチャネルピペットを使用して、細胞と空の空の井戸を、プリウォームカルシウムおよびマグネシウムフリーのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄します。細胞培養培地を廃棄し、PBSを追加するために同じヒントを再利用しないでください。このステップを層流の外側で行い、空気流による乾燥から細胞を保護します。
7. アッセイ媒体中の細胞透過化:マルチチャネルピペットを使用して、PBSを廃棄し、プリウォーム付きアッセイ媒体(MAS-BSA-rPFO)の180 μLに交換します。
8. 測定開始:パーメアビライゼーションの直後に、校正されたセンサカートリッジのユーティリティプレートをセルプレートに交換し、測定を開始します。

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結果

まず、結果をベースライン呼吸の2回目の測定に正規化し、酸素消費率(OCR%)として値を示します。アッセイの結果は、図5、図6、図7、図8に示されています。各グループに適切なバックグラウンドウェルを割り当て、他のグループのバックグラウンドウェルを無効にすることが重?...

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ディスカッション

このプロトコルは、以前に発表された研究^{7、8、9、10}と製品ユーザーガイドの変更です。メーカーのプロトコルとは対照的に、2x MASは3倍MASの代わりに使用され、2×MASは溶解しやすく、凍結後に沈殿物を形成しません。凍結された2x MASアリコートは、最大6ヶ月保存でき、一貫した結果を示すことが...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate	Merck	A5285	store at -20 °C
Antimycin A	Merck	A8674	store at -20 °C
Bovine serum albumin	Merck	A3803	store at 2 - 8 °C
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Merck	C2920	store at -20 °C
Dimethyl sulfoxide	Merck	D8418	store at RT
D-Mannitol	Merck	63559	store at RT
Dulbecco's phosphate buffered saline	Gibco	14190-144	store at RT
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid	Merck	03777	store at RT
HEPES	Merck	H7523	store at RT
L(-)Malic acid disodium salt	Merck	M9138	store at RT
L-Glutamic acid sodium salt hydrate	Merck	G5889	store at RT
Magnesium chloride hexahydrate	Merck	M2670	store at RT
Oligomycin	Merck	O4876	store at -20 °C
Palmitoyl-DL-carnitine chloride	Merck	P4509	store at -20 °C
Potassium hydroxide	Merck	484016	store at RT
Potassium phosphate monobasic	Merck	P5655	store at RT
Rotenone	Merck	R8875	store at -20 °C
Seahorse Wave Desktop Software	Agilent technologies		Download from www.agilent.com
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent technologies
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent technologies	102416-100	XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates
Sodium pyruvate	Merck	P2256	store at 2 - 8 °C
Sodium succinate dibasic hexahydrate	Merck	S2378	store at RT
Sucrose	Merck	S7903	store at RT
Water	Merck	W3500	store at RT
XF calibrant	Agilent technologies	100840-000	store at RT
XF Plasma membrane permeabilizer	Agilent technologies	102504-100	Recombinant perfringolysin O (rPFO) - Aliquot and store at -20 °C