Imágenes intravitales multifotónicas para la monitorización del reclutamiento de leucocitos durante la arteriogénesis en un modelo de extremidades posteriores murinas

Resumen

El reclutamiento de leucocitos y plaquetas constituye un componente esencial necesario para el crecimiento efectivo de las arterias colaterales durante la arteriogénesis. La microscopía multifotónica es una herramienta eficiente para rastrear la dinámica celular con alta resolución espacio-temporal in vivo y menos fototoxicidad para estudiar el reclutamiento y extravasación de leucocitos durante la arteriogénesis.

Resumen

La arteriogénesis depende en gran medida del reclutamiento de leucocitos y plaquetas en el espacio perivascular de los vasos colaterales en crecimiento. El enfoque estándar para analizar arterias colaterales y leucocitos en arteriogénesis es la metodología histológica ( inmuno) ex vivo. Sin embargo, esta técnica no permite la medición de procesos dinámicos como el flujo sanguíneo, el esfuerzo cortante, las interacciones célula-célula y la velocidad de las partículas. Este artículo presenta un protocolo para monitorear los procesos in vivo en el crecimiento de arterias colaterales durante la arteriogénesis utilizando imágenes intravitales. El método descrito aquí es una herramienta confiable para la medición dinámica y ofrece un análisis de alto contraste con fotocitotoxicidad mínima, proporcionada por microscopía de excitación multifotónica. Antes de analizar las arterias colaterales en crecimiento, se indujo arteriogénesis en el músculo aductor de ratones mediante ligadura unilateral de la arteria femoral.

Después de la ligadura, las arterias colaterales preexistentes comenzaron a crecer debido al aumento del esfuerzo cortante. Veinticuatro horas después de la cirugía, se eliminó la piel y la grasa subcutánea por encima de las arterias colaterales, construyendo un bolsillo para análisis adicionales. Para visualizar el flujo sanguíneo y las células inmunes durante las imágenes in vivo , se inyectaron anticuerpos contra el isotiocianato de fluoresceína CD41 (FITC) (plaquetas) y la CD45-ficoeritrina (PE) (leucocitos) por vía intravenosa (IV) a través de un catéter colocado en la vena de la cola de un ratón. Este artículo presenta la imagen multifotónica intravital como una alternativa o complementación in vivo a los análisis histológicos estáticos ex vivo (inmuno) comúnmente utilizados para estudiar procesos relevantes para la arteriogénesis. En resumen, este artículo describe un método in vivo novedoso y dinámico para investigar el tráfico de células inmunes, el flujo sanguíneo y el estrés de cizallamiento en un modelo de arteriogénesis de las extremidades posteriores, lo que mejora notablemente las posibilidades de evaluación.

Introducción

A pesar del intenso interés de la investigación durante los últimos años, las enfermedades cardiovasculares, por ejemplo, la cardiopatía isquémica y el accidente cerebrovascular, siguen siendo la principal causa mundial de muerte¹. Los tratamientos actuales para estas enfermedades son terapias altamente invasivas como la angioplastia transluminal percutánea, la angioplastia coronaria transluminal percutánea o la cirugía de derivación². Por lo tanto, se necesita urgentemente el desarrollo de opciones terapéuticas alternativas y no invasivas. El cuerpo puede crear derivaciones naturales alrededor de un vaso estenosado u ocluido para redirigir el flujo sanguíneo interrumpido a la parte distal de la estenosis. Este proceso se llama arteriogénesis². Muchos estudios recientes han demostrado que el aumento del cizallamiento del líquido afecta el reclutamiento de leucocitos, que desempeña un papel importante durante la arteriogénesis³. Las principales opciones actuales para analizar el reclutamiento de leucocitos durante la arteriogénesis son los análisis (inmuno) histológicos ex vivo o la metodología de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)⁴. Para permitir la evaluación de la dinámica de los leucocitos durante la arteriogénesis, este artículo presenta un protocolo de imagen intravital con microscopía multifotónica.

Los leucocitos son las principales células sanguíneas reclutadas durante el proceso de arteriogénesis³. Este protocolo utiliza imágenes multifotónicas para mostrar el rastreo de leucocitos adherentes marcados con anticuerpos anti-CD45-PE inyectados en arterias colaterales, 24 h después de la inducción de la arteriogénesis por ligadura de la arteria femoral (FAL) empleando un modelo de isquemia murina de las extremidades posteriores ^5,6. Alternativamente, las células inmunes pueden etiquetarse ex vivo e inyectarse cuidadosamente en ratones, como se muestra en estudios sobre angiogénesis utilizando microscopía intravital⁷. El flujo sanguíneo dentro de los vasos y arterias puede ser visualizado por CD41-FITC (para etiquetar plaquetas), dextrano-FITC (plasma), o por la segunda generación armónica (SHG), que visualiza el colágeno tipo 1 presente en la membrana basal de alguna parte del árbol vascular. SHG es un efecto único de etiquetado libre de la excitación multifotónica. Las imágenes multifotónicas permiten el seguimiento celular a largo plazo sin dañar el tejido y activar las células mediante la excitación de potencia láser. La microscopía multifotónica es el método de imagen de elección para visualizar células y estructuras marcadas con fluorescencia en animales vivos debido a su capacidad para excitar los fluoróforos más profundamente en el tejido / órganos con una fototoxicidad mínima⁸.

El uso de láseres infrarrojos sintonizados con pulsos entregados dentro de intervalos de femtosegundos excita el fluorocromo solo en el plano focal, sin excitación por encima y por debajo del plano focal⁸. Por lo tanto, la microscopía multifotónica permite una alta resolución espacio-temporal, menos fotodaño y una mayor penetración de imágenes de tejido para estudiar eventos biológicos dinámicos dentro de los órganos. Es una herramienta de microscopía ideal para imágenes de animales vivos. Sin embargo, el multifotón y cualquier otro arte de la microscopía intravital está limitado por el movimiento del tejido debido a los latidos del corazón, la respiración, los movimientos peristálticos, la tonalidad muscular y otras funciones fisiológicas, lo que perturba la adquisición y el análisis de imágenes. Como estos movimientos perjudican la resolución temporal y espacial y, a veces, incluso prohíben el análisis posterior, deben abordarse adecuadamente para permitir un análisis e interpretación precisos de los datos. Se han desarrollado varias estrategias para reducir o prevenir el movimiento de los artefactos del tejido. Este protocolo aplica un software de corrección de deriva in situ llamado VivoFollow⁹ para corregir la deriva del tejido durante la adquisición de imágenes. Este enfoque proporciona la estabilización de imagen requerida, lo que permite el análisis de imágenes y seguimiento celular a largo plazo.

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Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Baviera (aprobado por el código ético: ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99); estos experimentos se llevaron a cabo en estricta conformidad con las directrices de la legislación animal alemana.

1. Los animales y la ligadura de la arteria femoral (FAL)

NOTA: Para inducir inflamación estéril y arteriogénesis, se utilizaron ratones machos C57BL / 6J de 8-10 semanas de edad. Ninguno de los ratones murió o sufrió de infección de la herida o alteración de la cicatrización de la herida durante o después de la cirugía FAL o simulada, respectivamente.

1. Anestesia
   NOTA: Antes de la inyección de la anestesia MMF-mix, se recomienda anestesiar primero con isoflurano al 5% hasta que el ratón esté durmiendo.
   1. Pesar el ratón y preparar la mezcla de MMF con una dosis de midazolam 5,0 mg/kg, medetomidina 0,5 mg/kg y fentanilo 0,05 mg/kg.
   2. Llene una jeringa de 1 ml con MMF-mix e inyecte un volumen final de 100 μL s.c. usando una aguja de 30 G (después de la anestesia con isoflurano al 5%).
   3. Coloque el mouse en una almohadilla caliente y espere hasta que el mouse esté completamente anestesiado. Ajuste el temporizador a 35 min. Después de este tiempo, inyecte s.c. la mitad de la dosis (50 μL) de la mezcla MMF.
   4. Verifique la profundidad de la anestesia probando el pedal y los reflejos interdigitales (pellizcando el dedo firme del pie) del mouse.
      NOTA: La ausencia de respuesta indica una profundidad adecuada de analgesia.
2. Ligadura de la arteria femoral (FAL)
   NOTA: Use instrumentos quirúrgicos y suturas estériles. Desinfecte la piel con desinfectante antes de abrir y después de cerrar.
   1. Coloque el ratón anestesiado en una placa calefactora (35-37 °C) para mantener la temperatura corporal fisiológica. Aplique crema para los ojos (dexpantenol) en cada ojo para evitar la sequedad de los ojos bajo anestesia.
   2. Transfiera el ratón anestesiado a una cámara de imágenes Doppler láser (LDI) antes y después de FAL para verificar el flujo sanguíneo y la perfusión (Figura 1A-C).
   3. Retire el vello, desinfecte la piel y haga un corte para acceder a la arteria femoral. Bajo un microscopio quirúrgico, ligar la arteria femoral derecha de la extremidad posterior del ratón utilizando una sutura de seda trenzada (7-0) y realizar una operación simulada en la arteria femoral izquierda para que sirva como control interno como se describió anteriormente⁶ (Figura 1D-K).
      NOTA: La incisión en la piel se hizo con tijeras pequeñas para evitar lesiones directas a los vasos sanguíneos cercanos a la piel.
   4. Cerrar la piel con una sutura de seda trenzada (6-0). Administrar buprenorfina (0,1 mg/kg) s.c. cada 12 h, comenzando 10 min antes de antagonizar la anestesia para aliviar el dolor. Observe al animal en busca de señales de dolor, es decir, actividad de aseo reducida, renuencia a moverse o postura encorvada durante 24 horas después de la cirugía.
   5. Inyecte (s.c.) una combinación de naloxona (1.2 mg/kg), flumazenil (0.5 mg/kg) y atipamezol (2.5 mg/kg) para antagonizar la anestesia después de terminar el FAL y cerrar la piel.
   6. Después de la cirugía, mantenga al ratón en la almohadilla caliente y monitoree continuamente al animal hasta que pueda mantener una postura erguida y comience a caminar normalmente alrededor de la jaula.
   7. Cuando el ratón esté completamente despierto, colóquelo de nuevo en la jaula junto con los otros ratones y devuelva la jaula a la habitación de alojamiento de animales.

2. Preparación tisular para imágenes intravitales multifotónicas

1. Inyección de venas de la cola
   NOTA: El animal debe estar bajo anestesia antes de comenzar la preparación para la imagen intravital. Antes de introducir la aguja del catéter venoso, se recomienda aplicar un desinfectante para la piel en la cola. Esto también ayudará a visualizar los vasos.
   1. Prepare un catéter de inyección de vena de la cola con una aguja de 2 x 30 G, 10 cm de un tubo de polietileno de diámetro fino (0,28 mm de diámetro interno y 0,61 mm de diámetro exterior), una jeringa de 1 ml y un pegamento de histoacrilo para fijar el catéter en la cola del ratón para inyecciones intravenosas adicionales durante las imágenes (Figura 2A, B y Figura 2F).
   2. Preparar la solución de anticuerpos para inyección intravenosa: CD45-PE y CD41-FITC (20 μg/ratón) a un volumen final de 100 μL.
   3. Revise la cola en busca de venas de la cola ubicadas lateralmente y represa la vena para identificar la vena de la cola. Desinfecte la cola, inserte el catéter venoso y fíjelo con pegamento de histoacrilo tisular (Figura 2B).
   4. Inyecte los anticuerpos antes de la obtención de imágenes (al menos 15 minutos antes) y después de terminar la preparación del tejido.
2. Preparación de tejidos
   NOTA: Siempre use una almohadilla caliente y administre una gota de crema para los ojos (dexpantenol) en cada ojo antes de preparar el tejido. Use instrumentos quirúrgicos estériles y suturas. Desinfecte la piel con desinfectante antes de abrir y después de cerrar.
   1. Coloque el ratón anestesiado en una almohadilla estable y portátil. Fije el ratón en posición supina con una fijación de 4 puntos en la almohadilla con cinta adhesiva (Figura 2B).
   2. Moldee dos piezas de arcilla para modelar y coloque las piezas debajo de la extremidad posterior superior del ratón para asegurar una posición plana del músculo aductor (Figura 2B, indicada por flechas rojas).
   3. Para garantizar una temperatura corporal estable de 37 °C del ratón, coloque la almohadilla con el ratón en una placa calefactora bajo un microscopio quirúrgico con un zoom de 0,64-4,0 veces (Figura 1L).
   4. Retire el vello de ambas piernas, desinfecte la piel y corte la piel en un círculo alrededor de la cicatriz de la ligadura anterior de la arteria femoral de la extremidad posterior derecha (Figura 1M).
   5. Retire la piel y la capa de grasa de la parte superior de la pierna (Figura 1N, O) y retire la piel restante con suturas para crear un bolsillo alrededor del músculo aductor (Figura 1P, Q).
   6. Retire la grasa subcutánea para obtener una visión clara del músculo aductor y la arteria / vena profunda, así como los vasos colaterales (Figura 1Q, R).
   7. Comience a retirar cuidadosamente la capa muscular superficial en la parte superior de los vasos colaterales diseccionándola cuidadosamente con pinzas finas (Figura 1R).
      NOTA: La arteria colateral y la vena colateral son claramente visibles y están listas para obtener imágenes (Figura 1S).
   8. Llene el bolsillo preparado con solución salina para evitar el secado del tejido y continúe con el mismo procedimiento para la extremidad posterior izquierda operada de forma simulada. Antes de la obtención de imágenes, agregue gel ultrasónico en ambos bolsillos, lo que evita el secado y sirve como medio de inmersión para el acoplamiento óptico con el objetivo (Figura 2C y Figura 2F).

3. Microscopía multifotónica intravital

1. Preparación
   NOTA: Mantenga una jeringa con gel ultrasónico dentro de la cámara de la incubadora del microscopio para mantener una temperatura cálida para rellenar las bolsas durante las imágenes a largo plazo.
   1. Retire la solución salina de los dos bolsillos preparados y reemplácela con gel ultrasónico para cubrir los vasos colaterales (Figura 2C).
   2. Inyecte la solución de anticuerpos a través del catéter de la vena de la cola. 15 min después de la inyección de anticuerpos, transfiera la almohadilla con el ratón fijo a la cámara de imágenes multifotónica calentada (Figura 2F).
   3. Después de completar la adquisición de la imagen, eutanasia al ratón por dislocación cervical bajo narcosis profunda.
2. Adquisición de imágenes por microscopía multifotónica
   NOTA: Encienda el microscopio 30 minutos antes de obtener imágenes para permitir la estabilización láser. Para obtener la mejor estabilidad óptica del microscopio, se recomienda mantener la cámara del microscopio permanentemente calentada.
   1. Encienda la llave de la caja láser Ti:Sapphire, las cajas de interfaces electrónicas, la unidad de calentamiento de la cámara de incubación, la lámpara fluorescente y el ordenador (Figura 2D,E).
   2. Inicie el software de adquisición (software Inspector). Ajuste la longitud de onda a 800 nm y abra el obturador del microscopio (Figura 3A ii).
   3. En el cuadro de diálogo Asistente de medición, elija el Modo de instrumento (haz único) y en Modo de medición (lapso de tiempo de escaneo 3D) (Figura 3A i).
   4. Transfiera el ratón anestesiado a la cámara de incubación precalentada del microscopio. Coloque el área con el gel ultrasónico (paso 2.2.8) directamente en contacto con la lente frontal del objetivo (Figura 2F).
   5. Abra el obturador del microscopio de epifluorescencia, elija un filtro / ajuste dicroico adecuado para la visualización FITC (4) para encontrar el área de interés siguiendo el flujo sanguíneo bajo iluminación de epifluorescencia. Después de llevar el área de interés al campo de visión central, cierre el obturador del microscopio de epifluorescencia.
   6. En el cuadro de diálogo xy-Scanner, defina los siguientes parámetros: Tamaño de imagen (554x554), Pixel (512x512), Frecuencia (400), Promedio de línea (1) (Figura 3A iii). Ajuste la potencia del láser (5%) (Figura 3A iv) y ajuste la ganancia del fotomultiplicador (PMT) para los canales verde (66), rojo (66) y azul (63) (Figura 3A v).
   7. Seleccione un objetivo adecuado para los ajustes de imagen intravital y corrección de deriva (ver detalles en 3.2.11).
      NOTA: Aquí, el objetivo seleccionado fue la Nikon LWD 16x (Figura 3A vi).
   8. Defina el rango de la pila de imágenes iniciando el modo de adquisición de vista previa presionando el botón rojo en la esquina superior derecha de la ventana de diálogo del Asistente de medición (Figura 3A i).
   9. Definir el área y estructura de interés enfocando para obtener una buena imagen. Luego, mientras observa la pantalla, cambie el enfoque moviendo el objetivo hacia arriba hasta que la imagen desaparezca y configúrelo como cero (primero = 0). Cambie el enfoque en la dirección opuesta moviendo el objetivo hacia abajo hasta que la imagen desaparezca de la pantalla nuevamente, y configúrelo como la última posición (final = 40 μm) en la dirección axial (Figura 3A vii).
   10. Establezca el tamaño del paso en 2 μm. Haga clic en el botón rojo de la esquina superior derecha del cuadro de diálogo Asistente de medición para detener la vista previa del escaneo.
       NOTA: El número de imágenes se calculará y establecerá automáticamente (21 imágenes), como se indica en la Figura 3A vii.
   11. Si el microscopio está equipado con corrección de deriva viva⁹, inicie el software de corrección de deriva (por ejemplo, VivoFollow) y siga los pasos que se describen a continuación.
       1. En el cuadro de diálogo Asistente de medición, elija el eje Python (Python Ax) (Figura 3A viii) como primer dispositivo de eje; NO active el modo de guardado automático. Marque la casilla de guardado automático (AS) solo en el eje de tiempo ( Time Time). Presione el icono de Python en la ventana Dispositivos disponibles (Figura 3A ix) para abrir la ventana de diálogo de Python .
       2. En la configuración del eje del cuadro de diálogo de Python , escriba Desde (0 cero) y Hasta (-40). Introduzca Número de pasos (21) como se indica en la figura 3A x.
       3. Vaya a la ventana de diálogo xyz Stage Z y amplíe el rango de escaneo en 200 μm en ambos extremos: en Inicio, enter (200 μm) y en End, enter (-240 μm), el rango se establecerá automáticamente (-440 μm). Mantenga el tamaño del paso (2 μm) como se muestra en la Figura 3A xi.
       4. Abra el cuadro de diálogo VivoFollow Frontend y haga clic en el cuadro Perfil de movimiento (Figura 3A xii).
       5. Inicie la adquisición de imágenes pulsando la punta de flecha verde situada en la esquina superior izquierda del cuadro de diálogo Asistente de medición del software Inspector (Figura 3A i).
       6. Si se utiliza la corrección de deriva viva, busque un cuadro de diálogo para que aparezca la configuración de corrección de deriva como se muestra en la Figura 3A xiii. Establezca el canal de adquisición que se utilizará como referencia de punto de referencia inmóvil (para este protocolo, elija el canal 2, donde se registrará la señal del trazador vascular). Introduzca el desplazamiento de corrección máximo en μm que se agregó a la primera y última posición z (aquí, 200 μm) y haga clic en Aceptar.
       7. Supervise el desplazamiento de la deriva actual en x, y y z en tiempo real durante la adquisición de imágenes en la ventana de diálogo frontal de VivoFollow Figura 3A xiv.
       8. Detenga la adquisición de imágenes después de ~ 35 minutos cuando se requiere otro ciclo de reinyección de anestesia. Inyectar media dosis de la mezcla MMF (50 μl s.c) y reiniciar la adquisición de imágenes presionando de nuevo la punta de flecha verde (paso 3.2.11.5).
       9. Repita este procedimiento hasta que finalice el experimento.

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Resultados

La microscopía multifotónica ofrece una alta resolución espacio-temporal para el seguimiento de leucocitos, en la que los pasos y la velocidad de la migración celular pueden ser rastreados y monitoreados (Figura 4A, B). Sin embargo, el movimiento fisiológico de la muestra plantea un desafío, especialmente para las adquisiciones de imágenes de microscopía intravital a largo plazo. Por lo tanto, se requiere una buena preparación de tejido y soportes para fijar el teji...

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Discusión

El método descrito de análisis multifotón in vivo del reclutamiento de leucocitos representa una adición a las herramientas comúnmente utilizadas para los estudios de reclutamiento de leucocitos, como los análisis (inmuno) histológicos o FACS. Con este método de imagen, es posible visualizar con mayor detalle los procesos dinámicos en la adhesión leucocitaria y extravasación durante la arteriogénesis¹⁰. A pesar del valor agregado de este método, el protocolo ofrecido incluye ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mL Syringe	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	309628	syringe for injection
3M Durapore Surgical Tape 1538-0	3M, St. Paul, MN, USA	1538-0	fixation tape
Atipamezole	Zoetis, Berlin, Germany		antagonize anesthesia
Buprenorphine	Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK		antagonize anesthesia
C57/B6J mouse	Charles River, Sulzfeld, Germany		used animals for surgery/imaging
CD41-FITC ab	Biolegend	133904	Platelet labeling in vivo
CD45-PE ab	Biolegend	368510	Leukocytes labelling in vivo
Disinfectant Cutasept	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland	AK64.2	Disinfection
Eye cream (Bepanthen)	Bayer Vital GmbH	5g
Fentanyl	CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany		anesthesia
Flumazenile	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland		antagonize anesthesia
Fine bore polythene tubing	Smiths medical	Lot 278316	0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter
Histoacryl flexible	BRAUM	1050052	tissue glue
Imaris software	Oxford Instruments	version 9.2	Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection
Laser Doppler Imaging instrument	Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany
LEICA KL300 LED	Leica, Solms, Germany		light for microscope
Leica M60	Leica, Solms, Germany		microscope for surgery
LEICA MC120 HD	Leica, Solms, Germany		camera for microscope
Medetomidine	Pfizer Pharma, Berlin, Germany		anesthesia
Midazolam	Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany		anesthesia
Multiphoton microscope	Lavision	TRIMScope II	WL 820 nm
NaCl 0.9%	Braun, Melsungen, Deutschland	3570310	saline for pocket
Naloxone	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland		antagonize anesthesia
Needle 30 G	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	305128	needle for i.v. catheter
Silk braided suture (7-0)	Pearsalls Ltd., Taunton, UK	SUT-S 103	suture for femoral artery ligation
Ultrason Gel	SONOSID-ASID BONZ 250 mL	782012	gel for imaging
Vicryl 6.0 suture	Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA	NW-2347	suture to build pocket
VivoFollow drift correction software	Developed by Mykhailo Vladymyrov		Reference 9