Imagem Intravital Multifóton para Monitoramento do Recrutamento de Leucócitos durante a Arteriogênese em Modelo de Membro Posterior Murino

Resumo

O recrutamento de leucócitos e plaquetas constitui um componente essencial necessário para o crescimento efetivo das artérias colaterais durante a arteriogênese. A microscopia multifóton é uma ferramenta eficiente para rastrear a dinâmica celular com alta resolução espaço-temporal in vivo e menor fototoxicidade para estudar o recrutamento e extravasamento de leucócitos durante a arteriogênese.

Resumo

A arteriogênese depende fortemente do recrutamento de leucócitos e plaquetas para o espaço perivascular dos vasos colaterais em crescimento. A abordagem padrão para análise de artérias colaterais e leucócitos na arteriogênese é a metodologia histológica ex vivo (imuno-). No entanto, essa técnica não permite a mensuração de processos dinâmicos como fluxo sanguíneo, tensão de cisalhamento, interações célula-célula e velocidade das partículas. Este trabalho apresenta um protocolo para monitorar processos in vivo em artérias colaterais em crescimento durante a arteriogênese utilizando imagens intravitais. O método aqui descrito é uma ferramenta confiável para medição dinâmica e oferece uma análise de alto contraste com mínima fotocitotoxicidade, fornecida por microscopia de excitação multifóton. Antes da análise das artérias colaterais em crescimento, a arteriogênese foi induzida no músculo adutor de camundongos por ligadura unilateral da artéria femoral.

Após a ligadura, as artérias colaterais preexistentes começaram a crescer devido ao aumento da tensão de cisalhamento. Vinte e quatro horas após a cirurgia, a pele e a gordura subcutânea acima das artérias colaterais foram removidas, construindo-se uma bolsa para análises posteriores. Para visualizar o fluxo sanguíneo e as células imunes durante exames de imagem in vivo , anticorpos CD41-fluoresceína isotiocianato (FITC) (plaquetas) e CD45-ficoeritrina (PE) (leucócitos) foram injetados por via intravenosa (i.v.) através de um cateter colocado na veia caudal de um camundongo. Este artigo apresenta imagens intravitais de múltiplos fótons como uma complementação alternativa ou in vivo às análises histológicas estáticas ex vivo (imuno-) comumente usadas para estudar processos relevantes para a arteriogênese. Em resumo, este artigo descreve um novo e dinâmico método in vivo para investigar o tráfego de células imunes, o fluxo sanguíneo e o estresse de cisalhamento em um modelo de arteriogênese de membros posteriores, o que aumenta notavelmente as possibilidades de avaliação.

Introdução

Apesar do intenso interesse em pesquisa nos últimos anos, as doenças cardiovasculares, por exemplo, doença isquêmica do coração e acidente vascular cerebral, ainda são a principal causa global de morte¹. Os tratamentos atuais para essas doenças são terapias altamente invasivas, como angioplastia transluminal percutânea, angioplastia coronariana transluminal percutânea ou cirurgia de revascularização miocárdica². Portanto, o desenvolvimento de opções terapêuticas alternativas e não invasivas é urgentemente necessário. O corpo pode criar desvios naturais em torno de um vaso estenosado ou ocluído para redirecionar o fluxo sanguíneo interrompido para a parte distal da estenose. Esse processo é denominado arteriogênese². Muitos estudos recentes têm demonstrado que o aumento do cisalhamento de fluidos afeta o recrutamento leucocitária, que desempenha um papel importante durante a arteriogênese³. As principais opções atuais para analisar o recrutamento de leucócitos durante a arteriogênese são análises histológicas ex vivo (imuno-) ou a metodologia de classificação celular ativada por fluorescência (FACS)⁴. Para permitir a avaliação da dinâmica leucocitária durante a arteriogênese, este trabalho apresenta um protocolo de imagem intravital com microscopia multifóton.

Os leucócitos são as principais células sanguíneas recrutadas durante o processo de arteriogênese³. Esse protocolo utiliza imagens multifótons para mostrar o rastreamento de leucócitos aderentes marcados com anticorpos anti-CD45-PE injetados em artérias colaterais, 24 h após a indução da arteriogênese por ligadura da artéria femoral (IFA), empregando um modelo de isquemia murina^{dos membros posteriores5,6}. Alternativamente, células imunes podem ser marcadas ex vivo e cuidadosamente injetadas em camundongos, como demonstrado em estudos sobre angiogênese usando microscopia intravital⁷. O fluxo sanguíneo no interior de vasos e artérias pode ser visualizado por CD41-FITC (para marcar plaquetas), dextran-FITC (plasma) ou pela segunda geração harmônica (SHG), que visualiza o colágeno tipo 1 presente na membrana basal de alguma parte da árvore vascular. SHG é um efeito de marcação livre único da excitação multifóton. A imagem multifóton permite o rastreamento celular a longo prazo sem agredir o tecido e ativar as células por excitação de potência do laser. A microscopia multifóton é o método de imagem de escolha para a visualização de células e estruturas marcadas fluorescentemente em animais vivos, devido à sua capacidade de excitar os fluoróforos mais profundamente no tecido/órgãos com mínima fototoxicidade⁸.

O uso de lasers infravermelhos sintonizados com pulsos liberados em intervalos de femtossegundos excita o fluorocromo apenas no plano focal, sem excitação acima e abaixo do plano focal⁸. Assim, a microscopia multifóton permite alta resolução espaço-temporal, menor fotodano e maior penetração tecidual para o estudo de eventos biológicos dinâmicos no interior dos órgãos. É uma ferramenta de microscopia ideal para imagens de animais vivos. No entanto, o multifóton e qualquer outra arte da microscopia intravital é limitada pelo movimento do tecido devido aos batimentos cardíacos, respiração, movimentos peristálticos, tonalidade muscular e outras funções fisiológicas, o que perturba a aquisição e análise de imagens. Como esses movimentos prejudicam a resolução temporal e espacial e, às vezes, até proíbem análises posteriores, eles devem ser abordados adequadamente para permitir a análise e interpretação precisa dos dados. Várias estratégias têm sido desenvolvidas para diminuir ou impedir a movimentação dos artefatos dos tecidos. Este protocolo aplica um software de correção de deriva in situ chamado VivoFollow⁹ para corrigir a deriva tecidual durante a aquisição das imagens. Essa abordagem fornece a estabilização de imagem necessária, permitindo imagens de longo prazo e análise de rastreamento celular.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Baviera (aprovado pelo código de ética: ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99); esses experimentos foram realizados em estrita conformidade com as diretrizes da legislação animal alemã.

1. Animais e ligadura da artéria femoral (IFF)

NOTA: Para induzir inflamação estéril e arteriogênese, camundongos C57BL/6J machos com 8-10 semanas de idade foram usados. Nenhum dos camundongos morreu ou sofreu de infecção da ferida ou distúrbio de cicatrização da ferida durante ou pós-FAL ou cirurgia simulada, respectivamente.

1. Anestesia
   NOTA: Antes da injeção da anestesia MMF-mix, recomenda-se primeiro anestesiar com isoflurano a 5% até que o rato esteja dormindo.
   1. Pesar o rato e preparar a mistura de MMF com uma dose de midazolam 5,0 mg/kg, medetomidina 0,5 mg/kg e fentanil 0,05 mg/kg.
   2. Encher uma seringa de 1 mL com MMF-mix e injetar um volume final de 100 μL s.c. usando uma agulha de 30 G (após anestesia com isoflurano a 5%).
   3. Coloque o mouse em uma almofada quente e aguarde até que o mouse esteja completamente anestesiado. Ajuste o temporizador para 35 min. Após esse tempo, injetar s.c. metade da dose (50 μL) da mistura de MMF.
   4. Verifique a profundidade da anestesia testando os reflexos pediosos e interdigitais (por pinça firme dos dedos) do mouse.
      NOTA: A ausência de resposta indica uma profundidade adequada de analgesia.
2. Ligadura da artéria femoral (IFF)
   OBS: Utilizar instrumentos cirúrgicos estéreis e suturas. Desinfete a pele com desinfetante antes de abrir e depois de fechar.
   1. Coloque o rato anestesiado numa placa de aquecimento (35-37 °C) para manter a temperatura corporal fisiológica. Aplique creme para os olhos (dexpantenol) em cada olho para evitar o ressecamento dos olhos sob anestesia.
   2. Transfira o camundongo anestesiado para uma câmara de Laser Doppler (LDI) antes e após o FAL para verificar o fluxo sanguíneo e a perfusão (Figura 1A-C).
   3. Retire os pelos, desinfete a pele e faça um corte para acessar a artéria femoral. Sob microscópio cirúrgico, ligadura da artéria femoral direita do membro posterior de camundongo com fio trançado em seda (7-0) e simula-se operação na artéria femoral esquerda para controle interno, conforme descrito^{anteriormente6} (Figura 1D-K).
      OBS: A incisão na pele foi feita com pequena tesoura para evitar lesão direta nos vasos sanguíneos próximos à pele.
   4. Fechar a pele com fio de seda trançado (6-0). Administrar buprenorfina (0,1 mg/kg) s.c. a cada 12 h, iniciando 10 min antes de antagonizar a anestesia para alívio da dor. Observe o animal para sinais de dor, ou seja, atividade de tosa reduzida, relutância em se mover ou postura curvada por 24 h após a cirurgia.
   5. Injetar (s.c.) uma combinação de naloxona (1,2 mg/kg), flumazenile (0,5 mg/kg) e atipamezol (2,5 mg/kg) para antagonizar a anestesia após terminar o FAL e fechar a pele.
   6. Após a cirurgia, mantenha o mouse sobre a almofada aquecida e monitore continuamente o animal até que ele possa manter uma postura ereta e começar a andar normalmente ao redor da gaiola.
   7. Quando o rato estiver totalmente acordado, coloque-o de volta na gaiola juntamente com os outros ratos e devolva a gaiola à sala de alojamento de animais.

2. Preparo tecidual para imagens intravitais multifótons;

1. Injeção da veia da cauda
   OBS: O animal precisa estar sob anestesia antes de iniciar o preparo para exames intravitais. Antes de introduzir a agulha do cateter venoso, recomenda-se aplicar um desinfetante de pele na cauda. Isso também ajudará a visualizar as embarcações.
   1. Preparar um cateter de injeção da veia caudal usando uma agulha 2 x 30 G, 10 cm de tubo de polietileno de furo fino (0,28 mm de diâmetro interno e 0,61 mm de diâmetro externo), uma seringa de 1 mL e uma cola de histoacrílico para fixar o cateter na cauda do mouse para novas injeções intravenosas durante a aquisição de imagens (Figura 2A,B e Figura 2F).
   2. Preparar a solução de anticorpos para injeção intravenosa: CD45-PE e CD41-FITC (20 μg/rato) num volume final de 100 μL.
   3. Verifique a cauda para as veias caudais localizadas lateralmente e barrar a veia para identificar a veia caudal. Desinfetar a cauda, inserir o cateter venoso e fixá-lo com cola de histoacrílico tecidual (Figura 2B).
   4. Injetar os anticorpos antes da aquisição de imagens (pelo menos 15 minutos antes) e depois de terminar a preparação do tecido.
2. Preparo de tecidos
   NOTA: Use sempre uma almofada quente e administre uma gota de creme para os olhos (dexpantenol) em cada olho antes da preparação do tecido. Use instrumentos cirúrgicos estéreis e suturas. Desinfete a pele com desinfetante antes de abrir e depois de fechar.
   1. Coloque o mouse anestesiado em uma almofada estável e portátil. Fixar o mouse em decúbito dorsal horizontal com fixação de 4 pontos na almofada com fita adesiva (Figura 2B).
   2. Molde duas peças de argila modeladora e coloque as peças sob o membro posterior superior do mouse para garantir uma posição plana do músculo adutor (Figura 2B, indicada por setas vermelhas).
   3. Para garantir uma temperatura corporal estável de 37 °C do mouse, coloque a almofada com o mouse em uma placa de aquecimento sob um microscópio cirúrgico com zoom de 0,64-4,0 vezes (Figura 1L).
   4. Retirar os pelos de ambas as pernas, desinfetar a pele e cortar a pele em círculo ao redor da cicatriz da ligadura da artéria femoral anterior do membro posterior direito (Figura 1M).
   5. Remova a pele e a camada de gordura do topo da perna (Figura 1N,O) e afaste a pele restante com suturas para criar uma bolsa ao redor do músculo adutor (Figura 1P,Q).
   6. Remover a gordura subcutânea para ter uma visão clara do músculo adutor e da artéria/veia profunda, bem como dos vasos colaterais (Figura 1Q,R).
   7. Iniciar cuidadosamente a remoção da camada muscular superficial no topo dos vasos colaterais, dissecando-a cuidadosamente com pinça fina (Figura 1R).
      NOTA: A artéria colateral e a veia colateral são claramente visíveis e prontas para exames de imagem (Figura 1S).
   8. Encha a bolsa preparada com soro fisiológico para evitar o ressecamento do tecido e continue com o mesmo procedimento para o membro posterior esquerdo operado por simulação. Antes da aquisição de imagens, adicionar gel ultrassônico em ambas as bolsas, o que evita o ressecamento e serve como meio de imersão para acoplamento óptico com a objetiva (Figura 2C e Figura 2F).

3. Microscopia multifóton intravital

1. Preparação
   NOTA: Mantenha uma seringa com gel ultra-sônico dentro da câmara incubadora do microscópio para manter uma temperatura quente para reencher as bolsas durante a aquisição de imagens de longo prazo.
   1. Retire o soro fisiológico das duas bolsas preparadas e substitua-o por gel ultrassônico para cobrir os vasos colaterais (Figura 2C).
   2. Injete a solução de anticorpos através do cateter da veia caudal. 15 min após a injeção do anticorpo, transferir a almofada com o mouse fixo para a câmara de imagem multifóton aquecida (Figura 2F).
   3. Após o término da aquisição das imagens, sacrificar o camundongo por deslocamento cervical sob narcose profunda.
2. Aquisição de imagens em microscopia multifóton
   NOTA: Ligue o microscópio 30 minutos antes da obtenção de imagens para permitir a estabilização a laser. Para a melhor estabilidade óptica do microscópio, recomenda-se manter a câmara do microscópio permanentemente aquecida.
   1. Ligue a chave da caixa laser Ti:Safira, as caixas de interfaces eletrônicas, a unidade de aquecimento da câmara de incubação, a lâmpada fluorescente e o computador (Figura 2D,E).
   2. Inicie o software de aquisição (software Inspector). Ajuste o comprimento de onda para 800 nm e abra o obturador do microscópio (Figura 3A ii).
   3. Na caixa de diálogo Assistente de medição, escolha o Modo de instrumento (feixe único) e o Modo de medição (lapso de tempo de varredura 3D) (Figura 3A i).
   4. Transfira o camundongo anestesiado para a câmara de incubação pré-aquecida do microscópio. Posicionar a área com o gel ultra-sônico (passo 2.2.8) diretamente em contato com a lente frontal objetiva (Figura 2F).
   5. Abra o obturador do microscópio de epifluorescência, escolha um filtro/dicroico adequado para visualização do FITC (4) para encontrar a área de interesse seguindo o fluxo sanguíneo sob iluminação de epifluorescência. Depois de trazer a área de interesse para o campo de visão central, feche o obturador do microscópio de epifluorescência.
   6. Na caixa de diálogo xy-Scanner, defina os seguintes parâmetros: Tamanho da imagem (554x554), Pixel (512x512), Frequência (400), Média de linha (1) (Figura 3A iii). Ajuste a potência do laser (5%) (Figura 3A iv) e ajuste o ganho do fotomultiplicador (PMT) para os canais verde (66), vermelho (66) e azul (63) (Figura 3A v).
   7. Seleccionar um objectivo adequado para as definições de imagem intravital e de correcção de deriva (ver pormenores no ponto 3.2.11).
      OBS: Aqui, o objetivo selecionado foi o Nikon LWD 16x (Figura 3A vi).
   8. Defina o intervalo de pilha de imagens iniciando o modo de aquisição de visualização pressionando o botão vermelho no canto superior direito da janela de diálogo do Assistente de Medição (Figura 3A i).
   9. Defina a área e a estrutura de interesse, focando para obter uma boa imagem. Em seguida, ao observar a tela, mude o foco movendo a objetiva para cima até que a imagem desapareça, e defina-a como zero (primeiro= 0). Mude o foco na direção oposta movendo a objetiva para baixo até que a imagem desapareça da tela novamente, e coloque-a como a última posição (final = 40 μm) na direção axial (Figura 3A vii).
   10. Defina o tamanho do passo para 2 μm. Clique no botão vermelho no canto superior direito da caixa de diálogo Assistente de Medição para interromper a verificação de visualização.
       OBS: O número de imagens será calculado e ajustado automaticamente (21 imagens), conforme indicado na Figura 3A vii.
   11. Se o microscópio estiver equipado com correção de deriva ao vivo⁹, inicie o software de correção de deriva (por exemplo, VivoFollow) e siga as etapas descritas abaixo.
       1. Na caixa de diálogo Assistente de Medição, escolha o eixo Python (Python Ax) (Figura 3A viii) como o primeiro dispositivo de eixo; NÃO ative o modo de salvamento automático. Marque a caixa de salvamento automático (AS) somente no eixo de tempo (Time Time). Pressione o ícone Python na janela Available Devices (Figura 3A ix) para abrir a janela de diálogo Python.
       2. Na caixa de diálogo Configurações do eixo do Python , insira De (0 zero) e Para (-40). Insira Número de etapas (21) conforme indicado na Figura 3A x.
       3. Vá para a janela de diálogo xyz Estágio Z e amplie o Intervalo de varredura em 200 μm em ambas as extremidades: em Iniciar, digite (200 μm) e em Final, digite (-240 μm), o intervalo será definido automaticamente (-440 μm). Mantenha o tamanho do passo (2 μm) como mostrado na Figura 3A xi.
       4. Abra a caixa de diálogo Frontend do VivoFollow e clique na caixa Perfil de movimento (Figura 3A xii).
       5. Inicie a aquisição da imagem pressionando a ponta de seta verde no canto superior esquerdo da caixa de diálogo Assistente de Medição do Inspector Software (Figura 3A i).
       6. Se a correção de desvio ao vivo for usada, procure uma caixa de diálogo para que a configuração de correção de desvio apareça como mostrado na Figura 3A xiii. Defina o canal de aquisição que será usado como referência de ponto imóvel (para este protocolo, escolha o canal 2, onde o sinal do traçador vascular deve ser gravado). Insira o deslocamento de correção máxima em μm que foi adicionado à primeira e à última posição z (aqui, 200 μm) e clique em OK.
       7. Monitore o deslocamento de desvio atual em x, y e z em tempo real durante a aquisição da imagem na janela de diálogo frontal do VivoFollow Figura 3A xiv.
       8. Pare a aquisição de imagens após ~35 minutos quando outro ciclo de reinjeção de anestesia for necessário. Injetar meia dose da mistura de MMF (50 μl s.c.) e reiniciar a aquisição da imagem pressionando novamente a ponta de seta verde (passo 3.2.11.5).
       9. Repita este procedimento até que o experimento seja concluído.

Resultados

A microscopia multifóton oferece uma alta resolução espaço-temporal para o rastreamento de leucócitos, em que as etapas e a velocidade de migração celular podem ser rastreadas e monitoradas (Figura 4A,B). No entanto, o movimento fisiológico da amostra representa um desafio, especialmente para aquisições de imagens de microscopia intravital a longo prazo. Portanto, um bom preparo tecidual e suportes para fixação do tecido e ferramentas, como correção de imagens ...

Discussão

O método descrito de análise in vivo de multifótons do recrutamento leucocitário representa uma adição às ferramentas comumente usadas para estudos de recrutamento de leucócitos, tais como análises (imuno-) histológicas ou FACS. Com esse método de imagem, é possível visualizar com maior detalhe os processos dinâmicos de aderência e extravasamento de leucócitos durante a arteriogênese¹⁰. Apesar do valor agregado desse método, o protocolo oferecido inclui algumas etapas cr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mL Syringe	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	309628	syringe for injection
3M Durapore Surgical Tape 1538-0	3M, St. Paul, MN, USA	1538-0	fixation tape
Atipamezole	Zoetis, Berlin, Germany		antagonize anesthesia
Buprenorphine	Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK		antagonize anesthesia
C57/B6J mouse	Charles River, Sulzfeld, Germany		used animals for surgery/imaging
CD41-FITC ab	Biolegend	133904	Platelet labeling in vivo
CD45-PE ab	Biolegend	368510	Leukocytes labelling in vivo
Disinfectant Cutasept	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland	AK64.2	Disinfection
Eye cream (Bepanthen)	Bayer Vital GmbH	5g
Fentanyl	CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany		anesthesia
Flumazenile	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland		antagonize anesthesia
Fine bore polythene tubing	Smiths medical	Lot 278316	0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter
Histoacryl flexible	BRAUM	1050052	tissue glue
Imaris software	Oxford Instruments	version 9.2	Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection
Laser Doppler Imaging instrument	Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany
LEICA KL300 LED	Leica, Solms, Germany		light for microscope
Leica M60	Leica, Solms, Germany		microscope for surgery
LEICA MC120 HD	Leica, Solms, Germany		camera for microscope
Medetomidine	Pfizer Pharma, Berlin, Germany		anesthesia
Midazolam	Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany		anesthesia
Multiphoton microscope	Lavision	TRIMScope II	WL 820 nm
NaCl 0.9%	Braun, Melsungen, Deutschland	3570310	saline for pocket
Naloxone	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland		antagonize anesthesia
Needle 30 G	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	305128	needle for i.v. catheter
Silk braided suture (0/7)	Pearsalls Ltd., Taunton, UK	SUT-S 103	suture for femoral artery ligation
Ultrason Gel	SONOSID-ASID BONZ 250 mL	782012	gel for imaging
Vicryl 6.0 suture	Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA	NW-2347	suture to build pocket
VivoFollow drift correction software	Developed by Mykhailo Vladymyrov		Reference 9