Bir Murin Arka Bacak Modelinde Arteriyogenez Sırasında Lökosit Alımını İzlemek için Multifoton İntravital Görüntüleme

Özet

Lökosit ve trombositlerin işe alınması, arteriyogenez sırasında kollateral arterlerin etkili büyümesi için gerekli olan önemli bir bileşeni oluşturur. Multifoton mikroskopisi, arteriyogenez sırasında lökosit alımını ve ekstravazasyonunu incelemek için in vivo yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe ve daha az foto-toksisiteye sahip hücre dinamiklerini izlemek için etkili bir araçtır.

Özet

Arteriyogenez, büyüyen kollateral damarların perivasküler boşluğuna lökosit ve trombosit alımına güçlü bir şekilde bağlıdır. Arteriogenezde kollateral arterlerin ve lökositlerin analizinde standart yaklaşım ex vivo (immüno -) histolojik metodolojidir. Bununla birlikte, bu teknik kan akışı, kayma stresi, hücre-hücre etkileşimleri ve parçacık hızı gibi dinamik süreçlerin ölçülmesine izin vermez. Bu yazıda, intravital görüntüleme kullanılarak arteriyogenez sırasında büyüyen kollateral arterlerde in vivo süreçleri izlemek için bir protokol sunulmaktadır. Burada açıklanan yöntem, dinamik ölçüm için güvenilir bir araçtır ve çoklu foton uyarma mikroskobu tarafından sağlanan minimum foto-sitotoksisiteye sahip yüksek kontrastlı bir analiz sunar. Büyüyen kollateral arterleri analiz etmeden önce, femoral arterin tek taraflı bağlanması ile farelerin adduktör kasında arteriyogenez indüklendi.

Ligasyondan sonra, önceden var olan kollateral arterler, artan kayma stresi nedeniyle büyümeye başladı. Ameliyattan yirmi dört saat sonra, kollateral arterlerin üzerindeki deri ve deri altı yağları çıkarıldı ve daha ileri analizler için bir cep oluşturuldu. İn vivo görüntüleme sırasında kan akışını ve bağışıklık hücrelerini görselleştirmek için, CD41-floresein izotiyosiyanat (FITC) (trombositler) ve CD45-fikoeritrin (PE) (lökositler) antikorları, bir farenin kuyruk damarına yerleştirilen bir kateter aracılığıyla intravenöz olarak (i.v.) enjekte edildi. Bu makalede, arteriyogenez ile ilgili süreçleri incelemek için yaygın olarak kullanılan statik ex vivo (immüno-) histolojik analizlere alternatif veya in vivo kompleman olarak intravital multifoton görüntüleme tanıtılmaktadır. Özetle, bu yazıda immün hücre kaçakçılığını, kan akışını ve kayma stresini arka bacak arteriyogenez modelinde araştırmak için yeni ve dinamik bir in vivo yöntem anlatılmakta ve bu da değerlendirme olanaklarını önemli ölçüde artırmaktadır.

Giriş

Son yıllardaki yoğun araştırma ilgisine rağmen, kardiyovasküler hastalıklar, örneğin iskemik kalp hastalığı ve inme, hala önde gelen küresel ölüm nedenidir¹. Bu hastalıkların güncel tedavileri perkütan transluminal anjiyoplasti, perkütan transluminal koroner anjiyoplasti veya bypass cerrahisi² gibi oldukça invaziv tedavilerdir. Bu nedenle, alternatif, non-invaziv tedavi seçeneklerinin geliştirilmesine acilen ihtiyaç vardır. Vücut, kesilen kan akışını stenozun distal kısmına yönlendirmek için stenozlu veya tıkalı bir damarın etrafında doğal baypaslar oluşturabilir. Bu sürece arteriyogenez² denir. Son zamanlarda yapılan birçok çalışma, artan sıvı kaymasının, arteriyogenez³ sırasında önemli bir rol oynayan lökosit alımını etkilediğini göstermiştir. Arteriyogenez sırasında lökositlerin işe alımını analiz etmek için ana güncel seçenekler ex vivo (immüno -) histolojik analizler veya floresan aktive hücre sıralama (FACS) metodolojisi^4'tür. Arteriyogenez sırasında lökosit dinamiklerinin değerlendirilmesini sağlamak için, bu yazıda multifoton mikroskobu ile intravital bir görüntüleme protokolü sunulmaktadır.

Lökositler, arteriyogenez³ sürecinde işe alınan başlıca kan hücreleridir. Bu protokol, kollateral arterlerde enjekte edilen anti-CD45-PE antikorları ile etiketlenmiş yapışkan lökositlerin taranmasını, bir murin arka ekstremite iskemisi model ^5,6 kullanılarak femoral arter ligasyonu (FAL) ile arteriyogenezin indüksiyonundan 24 saat sonra göstermek için multifoton görüntüleme kullanır. Alternatif olarak, bağışıklık hücreleri ex vivo olarak etiketlenebilir ve intravital mikroskopi⁷ kullanılarak anjiyogenez üzerine yapılan çalışmalarda gösterildiği gibi farelere dikkatlice enjekte edilebilir. Damarlar ve arterler içindeki kan akışı, CD41-FITC (trombositleri etiketlemek için), dekstran-FITC (plazma) veya vasküler ağacın bir kısmının bazal zarında bulunan kollajen tip 1'i görselleştiren ikinci harmonik nesil (SHG) ile görselleştirilebilir. SHG, çoklu foton uyarımının benzersiz bir serbest etiketleme etkisidir. Multifoton görüntüleme, dokuya zarar vermeden ve hücreleri lazer güç uyarımı ile aktive etmeden uzun süreli hücre takibine izin verir. Multifoton mikroskopisi, floroforları doku / organların derinliklerine minimum fototoksisite ile uyarma kabiliyeti nedeniyle canlı hayvanlarda floresan olarak etiketlenmiş hücreleri ve yapıları görselleştirmek için tercih edilen görüntüleme yöntemidir⁸.

Femtosaniye aralıklarla verilen darbelerle ayarlanmış kızılötesi lazerlerin kullanılması, florokromu yalnızca odak düzleminde heyecanlandırır, odak düzlemi^8'in üstünde ve altında uyarma olmaz. Böylece, çoklu foton mikroskopisi, organların içindeki dinamik biyolojik olayları incelemek için yüksek uzaysal-zamansal çözünürlük, daha az foto-hasar ve artan doku penetrasyon görüntülemesine izin verir. Canlı hayvan görüntülemesi için ideal bir mikroskopi aracıdır. Bununla birlikte, multifoton ve diğer intravital mikroskopi sanatları, kalp atışı, solunum, peristaltik hareketler, kas tonalitesi ve görüntüleme edinimini ve analizini bozan diğer fizyolojik fonksiyonlar nedeniyle doku hareketi ile sınırlıdır. Bu hareketler zamansal ve mekansal çözünürlüğü bozduğundan ve hatta bazen sonraki analizleri yasakladığından, doğru veri analizi ve yorumlamasını sağlamak için uygun şekilde ele alınmaları gerekir. Doku hareketinden kaynaklanan artefaktları azaltmak veya önlemek için çeşitli stratejiler geliştirilmiştir. Bu protokol, görüntü alımı sırasında doku kaymasını düzeltmek için VivoFollow⁹ adlı bir yerinde sürüklenme düzeltme yazılımı uygular. Bu yaklaşım, gerekli görüntü sabitlemeyi sağlayarak uzun süreli görüntüleme ve hücre izleme analizine olanak tanır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu çalışma Bavyera Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (etik kodla onaylanmıştır: ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99); Bu deneyler, Alman hayvan mevzuatı yönergelerine sıkı sıkıya bağlı kalınarak gerçekleştirilmiştir.

1. Hayvanlar ve femoral arter ligasyonu (FAL)

NOT: Steril inflamasyon ve arteriyogenezi indüklemek için 8-10 haftalık erkek C57BL/6J fareler kullanıldı. Farelerin hiçbiri, sırasıyla FAL veya sahte ameliyat sırasında veya sonrasında yara enfeksiyonu veya yara iyileşmesi bozukluğundan ölmedi veya acı çekmedi.

1. Anestezi
   NOT: MMF karışımı anestezinin enjeksiyonundan önce, fare uyuyana kadar% 5 izofluran ile anestezi yapılması önerilir.
   1. Fareyi tartın ve MMF karışımını 5.0 mg / kg midazolam 5.0 mg / kg, medetomidin 0.5 mg / kg ve fentanil 0.05 mg / kg ile hazırlayın.
   2. 1 mL'lik bir şırıngayı MMF karışımı ile doldurun ve 30 G'lik bir iğne kullanarak (% 5 izofluran ile anesteziden sonra) son 100 μL s.c. hacmini enjekte edin.
   3. Fareyi sıcak bir pedin üzerine yerleştirin ve fare tamamen uyuşturulana kadar bekleyin. Zamanlayıcıyı 35 dakikaya ayarlayın. Bu süreden sonra, MMF karışımının dozunun yarısını (50 μL) SC enjekte edin.
   4. Farenin pedalını ve interdigital reflekslerini (sıkı ayak parmağı sıkışmasıyla) test ederek anestezinin derinliğini kontrol edin.
      NOT: Yanıt yokluğu, yeterli bir analjezi derinliğini gösterir.
2. Femoral arter ligasyonu (FAL)
   NOT: Steril cerrahi aletler ve dikişler kullanın. Açmadan önce ve kapattıktan sonra cildi dezenfektanla dezenfekte edin.
   1. Fizyolojik vücut ısısını korumak için anestezi uygulanan fareyi bir ısıtma plakasına (35-37 ° C) yerleştirin. Anestezi altında gözlerin kurumasını önlemek için her göze göz kremi (dekspantenol) uygulayın.
   2. Kan akışını ve perfüzyonu kontrol etmek için anestezi uygulanan fareyi FAL'dan önce ve sonra bir Lazer Doppler görüntüleme (LDI) odasına aktarın (Şekil 1A-C).
   3. Saçları çıkarın, cildi dezenfekte edin ve femoral artere erişmek için bir kesim yapın. Cerrahi mikroskop altında, örgülü bir ipek sütür (7-0) kullanarak farenin arka bacağındaki sağ femoral arteri bağlayın ve daha önce tarif edildiği gibi iç kontrol görevi görmek için sol femoral arterde sahte bir operasyon gerçekleştirin⁶ (Şekil 1D-K).
      NOT: Derideki kesi, cilde yakın kan damarlarına doğrudan zarar gelmesini önlemek için küçük makasla yapılmıştır.
   4. Örgülü ipek bir dikiş kullanarak cildi kapatın (6-0). Buprenorfin (0.1 mg / kg) s.c.'yi her 12 saatte bir, ağrı kesici için anesteziyi antagonize etmeden 10 dakika önce başlayarak uygulayın. Hayvanı ağrı sinyalleri, yani azalmış tımar aktivitesi, hareket etme isteksizliği veya ameliyat sonrası 24 saat boyunca kambur duruş için gözlemleyin.
   5. FAL'ı bitirdikten ve cildi kapattıktan sonra anesteziyi antagonize etmek için nalokson (1.2 mg / kg), flumazenil (0.5 mg / kg) ve atipamezol (2.5 mg / kg) kombinasyonunu enjekte edin (s.c.).
   6. Ameliyattan sonra, fareyi sıcak pedin üzerinde tutun ve dik bir duruş sergileyene ve kafesin etrafında normal bir şekilde yürümeye başlayana kadar hayvanı sürekli izleyin.
   7. Fare tamamen uyanıkken, diğer farelerle birlikte kafese geri yerleştirin ve kafesi hayvan barınağı odasına geri getirin.

2. Multifoton intravital görüntüleme için doku hazırlığı

1. Kuyruk damarı enjeksiyonu
   NOT: İntravital görüntüleme için hazırlığa başlamadan önce hayvanın anestezi altında olması gerekir. Damar kateterinin iğnesini sokmadan önce, kuyruğa bir cilt dezenfektanı uygulanması önerilir. Bu aynı zamanda gemileri görselleştirmeye yardımcı olacaktır.
   1. 2 x 30 G iğne, 10 cm ince delikli polietilen boru (0,28 mm iç çap ve 0,61 mm dış çap), 1 mL şırınga ve görüntüleme sırasında daha fazla i.v. enjeksiyonu için kateteri fare kuyruğuna sabitlemek için bir histoacryl yapıştırıcı kullanarak bir kuyruk damarı enjeksiyon kateteri hazırlayın (Şekil 2A, B ve Şekil 2F).
   2. I.v. enjeksiyonu için antikor çözeltisini hazırlayın: CD45-PE ve CD41-FITC (20 μg / fare) 100 μL'lik son hacimde.
   3. Yanal olarak yerleştirilmiş kuyruk damarları için kuyruğu kontrol edin ve kuyruk damarını tanımlamak için damarı barajlayın. Kuyruğu dezenfekte edin, damar kateterini yerleştirin ve doku histoacryl yapıştırıcı kullanarak sabitleyin (Şekil 2B).
   4. Antikorları görüntülemeden önce (en az 15 dakika önce) ve doku hazırlığını bitirdikten sonra enjekte edin.
2. Doku hazırlama
   NOT: Her zaman ılık bir ped kullanın ve doku hazırlamadan önce her göze bir damla göz kremi (dekspantenol) uygulayın. Steril cerrahi aletler ve dikişler kullanın. Açmadan önce ve kapattıktan sonra cildi dezenfektanla dezenfekte edin.
   1. Anestezi uygulanan fareyi sabit ve taşınabilir bir ped üzerine yerleştirin. Yapışkan bant kullanarak fareyi sırtüstü pozisyonda, pedin üzerine 4 noktalı sabitleme ile sabitleyin (Şekil 2B).
   2. İki parça modelleme kili kalıplayın ve adduktör kasının düzlemsel bir pozisyonunu sağlamak için parçaları farenin üst arka bacağının altına yerleştirin (Şekil 2B, kırmızı oklarla gösterilmiştir).
   3. Farenin 37 ° C'lik sabit bir vücut ısısını sağlamak için, pedi fareyle birlikte 0,64-4,0 kat yakınlaştırmalı bir cerrahi mikroskop altında bir ısıtma plakasına yerleştirin (Şekil 1L).
   4. Saçları her iki bacaktan da çıkarın, cildi dezenfekte edin ve cildi sağ arka bacağın daha önceki femoral arter ligasyonunun izi etrafında bir daire şeklinde kesin (Şekil 1M).
   5. Deri ve yağ tabakasını bacağın üstünden çıkarın (Şekil 1N, O) ve adduktör kasının etrafında bir cep oluşturmak için dikişleri kullanarak kalan cildi bir kenara çekin (Şekil 1P, Q).
   6. Adduktör kası ve derin arter / venin yanı sıra kollateral damarların net bir görünümünü elde etmek için deri altı yağını çıkarın (Şekil 1Q, R ).
   7. Kollateral damarların üstündeki yüzeysel kas tabakasını, ince forsepslerle dikkatlice diseke ederek dikkatlice çıkarmaya başlayın (Şekil 1 R).
      NOT: Kollateral arter ve kollateral ven açıkça görülebilir ve görüntülemeye hazırdır (Şekil 1S).
   8. Dokunun kurumasını önlemek için hazırlanan cebi salinle doldurun ve sahte ameliyat edilen sol arka bacak için aynı prosedürle devam edin. Görüntülemeden önce, her iki cebe de ultrasonik jel ekleyin, bu da kurumayı önler ve amaç ile optik bağlantı için daldırma ortamı görevi görür (Şekil 2C ve Şekil 2F).

3. İntravital multifoton mikroskobu

1. Hazırlık
   NOT: Uzun süreli görüntüleme sırasında cepleri yeniden doldurmak için sıcak bir sıcaklığı korumak için mikroskopun inkübatör odasının içinde ultrasonik jelli bir şırınga bulundurun.
   1. Hazırlanan iki cepten salini çıkarın ve kollateral damarları örtmek için ultrasonik jel ile değiştirin (Şekil 2C).
   2. Antikor solüsyonunu kuyruk damarı kateterinden enjekte edin. Antikor enjeksiyonundan 15 dakika sonra, pedi sabit fare ile ısıtılmış multifoton görüntüleme odasına aktarın (Şekil 2F).
   3. Görüntü alımının tamamlanmasından sonra, fareyi derin narkoz altında servikal çıkık ile ötenazi yapın.
2. Multifoton mikroskobu görüntü yakalama
   NOT: Lazer stabilizasyonuna izin vermek için görüntülemeden 30 dakika önce mikroskobu açın. Mikroskobun en iyi optik kararlılığı için, mikroskop odasının kalıcı olarak ısıtılması önerilir.
   1. Ti: Safir lazer kutusunun, elektronik arayüz kutularının, inkübasyon odasının ısıtma ünitesinin, floresan lambanın ve bilgisayarın anahtarını açın (Şekil 2D, E).
   2. Satın alma yazılımını başlatın (Müfettiş yazılımı). Dalga boyunu 800 nm'ye ayarlayın ve mikroskop deklanşörünü açın (Şekil 3A ii).
   3. Ölçüm Sihirbazı iletişim kutusunda, Cihaz Modu'nu (Tek huzme) ve Ölçüm Modu'nu (3B tarama Zaman atlamalı) seçin (Şekil 3A i).
   4. Anestezi uygulanan fareyi mikroskobun önceden ısıtılmış inkübasyon odasına aktarın. Alanı ultrasonik jel (adım 2.2.8) ile objektif ön lensle doğrudan temas halinde konumlandırın (Şekil 2F).
   5. Epifloresan mikroskop deklanşörünü açın, epifloresan aydınlatması altında kan akışını takip ederek ilgi alanını bulmak için FITC görselleştirmesi için yeterli bir filtre / dikroik ayar seçin (4). İlgilenilen alanı orta görüş alanına getirdikten sonra, epifloresan mikroskop deklanşörünü kapatın.
   6. xy-Scanner iletişim kutusunda aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Görüntü boyutu (554x554), Piksel (512x512), Frekans (400), Çizgi ortalaması (1) (Şekil 3A iii). Lazer gücünü (% 5) ayarlayın (Şekil 3A iv) ve yeşil (66), kırmızı (66) ve mavi (63) kanallar için fotoçarpan (PMT) kazancını ayarlayın (Şekil 3A v).
   7. İntravital görüntüleme ve sürüklenme düzeltme ayarları için yeterli hedef seçin (3.2.11'deki ayrıntılara bakın).
      NOT: Burada seçilen objektif Nikon LWD 16x modeliydi (Şekil 3A vi).
   8. Ölçüm Sihirbazı iletişim penceresinin sağ üst köşesindeki kırmızı düğmeye basarak önizleme alma modunu başlatarak görüntü yığını aralığını tanımlayın (Şekil 3A i).
   9. İyi bir görüntü elde etmek için odaklanarak ilgi alanını ve yapısını tanımlayın. Ardından, ekranı gözlemlerken, görüntü kaybolana kadar hedefi yukarı doğru hareket ettirerek odağı değiştirin ve sıfır olarak ayarlayın (first = 0). Görüntü ekrandan tekrar kaybolana kadar hedefi aşağı doğru hareket ettirerek odağı ters yönde değiştirin ve eksenel yönde son (end= 40 μm) konum olarak ayarlayın (Şekil 3A vii).
   10. Adım boyutunu 2 μm olarak ayarlayın. Önizleme taramasını durdurmak için Ölçüm Sihirbazı iletişim kutusunun sağ üst köşesindeki kırmızı düğmeyi tıklatın.
       NOT: Görüntü sayısı Şekil 3A vii'de gösterildiği gibi otomatik olarak hesaplanacak ve ayarlanacaktır (21 resim).
   11. Mikroskop canlı sürüklenme düzeltme⁹ ile donatılmışsa, sürüklenme düzeltme yazılımını (örneğin, VivoFollow) başlatın ve aşağıda açıklanan adımları izleyin.
       1. Ölçüm Sihirbazı iletişim kutusunda, ilk eksen aygıtı olarak Python eksenini (Python Ax) (Şekil 3A viii) seçin; Otomatik kaydetme modunu ETKİNLEŞTİRMEYİN. Otomatik kaydetme (AS) kutusunu yalnızca zaman ekseninde (Zaman Saati) işaretleyin. Python iletişim penceresini açmak için Kullanılabilir Cihazlar penceresindeki Python simgesine basın (Şekil 3A ix).
       2. Python iletişim kutusu Eksen ayarları'nda, Kimden (0 sıfır) ve Kime (-40) girin. Şekil 3A x'te gösterildiği gibi Adım sayısını (21) girin.
       3. xyz Stage Z iletişim penceresine gidin ve Tarama Aralığını her iki uçta da 200 μm büyütün: Başlat'ta (200 μm) girin ve Sonunda (-240 μm) girin, aralık otomatik olarak ayarlanır (-440 μm). Adım boyutunu (2 μm) Şekil 3A xi'de gösterildiği gibi tutun.
       4. VivoFollow Ön Uç iletişim kutusunu açın ve Hareket Profili kutusunu tıklayın (Şekil 3A xii).
       5. Denetçi Yazılımı'nın Ölçüm Sihirbazı iletişim kutusunun sol üst köşesindeki yeşil ok ucuna basarak görüntü yakalamayı başlatın (Şekil 3A i).
       6. Canlı sürüklenme düzeltmesi kullanılıyorsa, sapma düzeltme yapılandırmasının Şekil 3A xiii'de gösterildiği gibi görünmesi için bir iletişim kutusu arayın. Hareketsiz bir dönüm noktası referansı olarak kullanılacak edinme kanalını ayarlayın (bu protokol için, vasküler izleyici sinyalinin kaydedileceği kanal 2'yi seçin). İlk ve son z konumlarına (burada, 200 μm) eklenen maksimum düzeltme ofsetini μm cinsinden girin ve Tamam'ı tıklatın.
       7. VivoFollow önlü iletişim penceresinde görüntü toplama sırasında x, y ve z cinsinden geçerli sapma ofsetini gerçek zamanlı olarak izleyin Şekil 3A xiv.
       8. Başka bir anestezi yeniden enjeksiyon döngüsü gerektiğinde ~ 35 dakika sonra görüntüleme alımını durdurun. MMF karışımının yarım dozunu (50 μl s.c) enjekte edin ve yeşil ok ucuna tekrar basarak görüntüleme alımını yeniden başlatın (adım 3.2.11.5).
       9. Deneme bitene kadar bu yordamı yineleyin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Multifoton mikroskopisi, lökosit takibi için hücre migrasyon adımlarının ve hızının izlenebileceği ve izlenebileceği yüksek bir mekansal-zamansal çözünürlük sunar (Şekil 4A, B). Bununla birlikte, numunenin fizyolojik hareketi, özellikle uzun süreli intravital mikroskopi görüntü kazanımları için bir zorluk teşkil etmektedir. Bu nedenle, başarılı ve istikrarlı görüntüleme elde etmek için iyi bir doku hazırlığı ve dokuyu sabitlemek için t...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Lökosit alımının tarif edilen multifoton in vivo analizi yöntemi, (immüno-) histolojik veya FACS analizleri gibi lökosit işe alım çalışmaları için yaygın olarak kullanılan araçlara bir eki temsil etmektedir. Bu görüntüleme yöntemi ile arteriyogenez¹⁰ sırasında lökosit aderansı ve ekstravazasyonundaki dinamik süreçleri daha ayrıntılı olarak görselleştirmek mümkündür. Bu yöntemin katma değerine rağmen, sunulan protokol bazı kritik adımlar ve sınırla...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mL Syringe	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	309628	syringe for injection
3M Durapore Surgical Tape 1538-0	3M, St. Paul, MN, USA	1538-0	fixation tape
Atipamezole	Zoetis, Berlin, Germany		antagonize anesthesia
Buprenorphine	Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK		antagonize anesthesia
C57/B6J mouse	Charles River, Sulzfeld, Germany		used animals for surgery/imaging
CD41-FITC ab	Biolegend	133904	Platelet labeling in vivo
CD45-PE ab	Biolegend	368510	Leukocytes labelling in vivo
Disinfectant Cutasept	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland	AK64.2	Disinfection
Eye cream (Bepanthen)	Bayer Vital GmbH	5g
Fentanyl	CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany		anesthesia
Flumazenile	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland		antagonize anesthesia
Fine bore polythene tubing	Smiths medical	Lot 278316	0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter
Histoacryl flexible	BRAUM	1050052	tissue glue
Imaris software	Oxford Instruments	version 9.2	Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection
Laser Doppler Imaging instrument	Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany
LEICA KL300 LED	Leica, Solms, Germany		light for microscope
Leica M60	Leica, Solms, Germany		microscope for surgery
LEICA MC120 HD	Leica, Solms, Germany		camera for microscope
Medetomidine	Pfizer Pharma, Berlin, Germany		anesthesia
Midazolam	Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany		anesthesia
Multiphoton microscope	Lavision	TRIMScope II	WL 820 nm
NaCl 0.9%	Braun, Melsungen, Deutschland	3570310	saline for pocket
Naloxone	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland		antagonize anesthesia
Needle 30 G	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	305128	needle for i.v. catheter
Silk braided suture (7-0)	Pearsalls Ltd., Taunton, UK	SUT-S 103	suture for femoral artery ligation
Ultrason Gel	SONOSID-ASID BONZ 250 mL	782012	gel for imaging
Vicryl 6.0 suture	Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA	NW-2347	suture to build pocket
VivoFollow drift correction software	Developed by Mykhailo Vladymyrov		Reference 9