Bir Murin Arka Bacak Modelinde Arteriyogenez Sırasında Lökosit Alımını İzlemek için Multifoton İntravital Görüntüleme

Özet

Lökosit ve trombositlerin işe alınması, arteriyogenez sırasında kollateral arterlerin etkili büyümesi için gerekli olan önemli bir bileşeni oluşturur. Multifoton mikroskopisi, arteriyogenez sırasında lökosit alımını ve ekstravazasyonunu incelemek için in vivo yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe ve daha az foto-toksisiteye sahip hücre dinamiklerini izlemek için etkili bir araçtır.

Özet

Arteriyogenez, büyüyen kollateral damarların perivasküler boşluğuna lökosit ve trombosit alımına güçlü bir şekilde bağlıdır. Arteriogenezde kollateral arterlerin ve lökositlerin analizinde standart yaklaşım ex vivo (immüno -) histolojik metodolojidir. Bununla birlikte, bu teknik kan akışı, kayma stresi, hücre-hücre etkileşimleri ve parçacık hızı gibi dinamik süreçlerin ölçülmesine izin vermez. Bu yazıda, intravital görüntüleme kullanılarak arteriyogenez sırasında büyüyen kollateral arterlerde in vivo süreçleri izlemek için bir protokol sunulmaktadır. Burada açıklanan yöntem, dinamik ölçüm için güvenilir bir araçtır ve çoklu foton uyarma mikroskobu tarafından sağlanan minimum foto-sitotoksisiteye sahip yüksek kontrastlı bir analiz sunar. Büyüyen kollateral arterleri analiz etmeden önce, femoral arterin tek taraflı bağlanması ile farelerin adduktör kasında arteriyogenez indüklendi.

Ligasyondan sonra, önceden var olan kollateral arterler, artan kayma stresi nedeniyle büyümeye başladı. Ameliyattan yirmi dört saat sonra, kollateral arterlerin üzerindeki deri ve deri altı yağları çıkarıldı ve daha ileri analizler için bir cep oluşturuldu. İn vivo görüntüleme sırasında kan akışını ve bağışıklık hücrelerini görselleştirmek için, CD41-floresein izotiyosiyanat (FITC) (trombositler) ve CD45-fikoeritrin (PE) (lökositler) antikorları, bir farenin kuyruk damarına yerleştirilen bir kateter aracılığıyla intravenöz olarak (i.v.) enjekte edildi. Bu makalede, arteriyogenez ile ilgili süreçleri incelemek için yaygın olarak kullanılan statik ex vivo (immüno-) histolojik analizlere alternatif veya in vivo kompleman olarak intravital multifoton görüntüleme tanıtılmaktadır. Özetle, bu yazıda immün hücre kaçakçılığını, kan akışını ve kayma stresini arka bacak arteriyogenez modelinde araştırmak için yeni ve dinamik bir in vivo yöntem anlatılmakta ve bu da değerlendirme olanaklarını önemli ölçüde artırmaktadır.

Giriş

Son yıllardaki yoğun araştırma ilgisine rağmen, kardiyovasküler hastalıklar, örneğin iskemik kalp hastalığı ve inme, hala önde gelen küresel ölüm nedenidir¹. Bu hastalıkların güncel tedavileri perkütan transluminal anjiyoplasti, perkütan transluminal koroner anjiyoplasti veya bypass cerrahisi² gibi oldukça invaziv tedavilerdir. Bu nedenle, alternatif, non-invaziv tedavi seçeneklerinin geliştirilmesine acilen ihtiyaç vardır. Vücut, kesilen kan akışını stenozun distal kısmına yönlendirmek için stenozlu veya tıkalı bir damarın etrafında doğal baypaslar oluşturabilir. Bu sürece arteriyogenez² denir. S....

Protokol

Bu çalışma Bavyera Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (etik kodla onaylanmıştır: ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99); Bu deneyler, Alman hayvan mevzuatı yönergelerine sıkı sıkıya bağlı kalınarak gerçekleştirilmiştir.

1. Hayvanlar ve femoral arter ligasyonu (FAL)

NOT: Steril inflamasyon ve arteriyogenezi indüklemek için 8-10 haftalık erkek C57BL/6J fareler kullanıldı. Farelerin hiçbiri, sırasıyla FAL veya sahte ameliyat sırasında veya sonrasında yara enfeksiyonu veya yara iyileşmesi bozukluğundan ölmedi veya acı çekmedi.

1. Anestezi
   NOT: MMF karışımı anestezinin enjeksiyonundan önce,....

Sonuçlar

Multifoton mikroskopisi, lökosit takibi için hücre migrasyon adımlarının ve hızının izlenebileceği ve izlenebileceği yüksek bir mekansal-zamansal çözünürlük sunar (Şekil 4A, B). Bununla birlikte, numunenin fizyolojik hareketi, özellikle uzun süreli intravital mikroskopi görüntü kazanımları için bir zorluk teşkil etmektedir. Bu nedenle, başarılı ve istikrarlı görüntüleme elde etmek için iyi bir doku hazırlığı ve dokuyu sabitlemek için t.......

Tartışmalar

Lökosit alımının tarif edilen multifoton in vivo analizi yöntemi, (immüno-) histolojik veya FACS analizleri gibi lökosit işe alım çalışmaları için yaygın olarak kullanılan araçlara bir eki temsil etmektedir. Bu görüntüleme yöntemi ile arteriyogenez¹⁰ sırasında lökosit aderansı ve ekstravazasyonundaki dinamik süreçleri daha ayrıntılı olarak görselleştirmek mümkündür. Bu yöntemin katma değerine rağmen, sunulan protokol bazı kritik adımlar ve sınırla.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mL Syringe	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	309628	syringe for injection
3M Durapore Surgical Tape 1538-0	3M, St. Paul, MN, USA	1538-0	fixation tape
Atipamezole	Zoetis, Berlin, Germany		antagonize anesthesia
Buprenorphine	Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK		antagonize anesthesia
C57/B6J mouse	Charles River, Sulzfeld, Germany		used animals for surgery/imaging
CD41-FITC ab	Biolegend	133904	Platelet labeling in vivo
CD45-PE ab	Biolegend	368510	Leukocytes labelling in vivo
Disinfectant Cutasept	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland	AK64.2	Disinfection
Eye cream (Bepanthen)	Bayer Vital GmbH	5g
Fentanyl	CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany		anesthesia
Flumazenile	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland		antagonize anesthesia
Fine bore polythene tubing	Smiths medical	Lot 278316	0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter
Histoacryl flexible	BRAUM	1050052	tissue glue
Imaris software	Oxford Instruments	version 9.2	Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection
Laser Doppler Imaging instrument	Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany
LEICA KL300 LED	Leica, Solms, Germany		light for microscope
Leica M60	Leica, Solms, Germany		microscope for surgery
LEICA MC120 HD	Leica, Solms, Germany		camera for microscope
Medetomidine	Pfizer Pharma, Berlin, Germany		anesthesia
Midazolam	Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany		anesthesia
Multiphoton microscope	Lavision	TRIMScope II	WL 820 nm
NaCl 0.9%	Braun, Melsungen, Deutschland	3570310	saline for pocket
Naloxone	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland		antagonize anesthesia
Needle 30 G	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	305128	needle for i.v. catheter
Silk braided suture (0/7)	Pearsalls Ltd., Taunton, UK	SUT-S 103	suture for femoral artery ligation
Ultrason Gel	SONOSID-ASID BONZ 250 mL	782012	gel for imaging
Vicryl 6.0 suture	Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA	NW-2347	suture to build pocket
VivoFollow drift correction software	Developed by Mykhailo Vladymyrov		Reference 9