Imagerie intravitale multiphotonique pour la surveillance du recrutement leucocytaire au cours de l’artériogenèse dans un modèle murin de membre postérieur

Résumé

Le recrutement des leucocytes et des plaquettes constitue un composant essentiel nécessaire à la croissance efficace des artères collatérales au cours de l’artériogenèse. La microscopie multiphotonique est un outil efficace pour suivre la dynamique cellulaire avec une résolution spatio-temporelle élevée in vivo et moins photo-toxicité pour étudier le recrutement et l’extravasation des leucocytes au cours de l’artériogenèse.

Résumé

L’artériogenèse dépend fortement du recrutement des leucocytes et des plaquettes dans l’espace périvasculaire des vaisseaux collatéraux en croissance. L’approche standard pour l’analyse des artères collatérales et des leucocytes dans l’artériogenèse est la méthodologie histologique ex vivo . Cependant, cette technique ne permet pas de mesurer des processus dynamiques tels que le flux sanguin, la contrainte de cisaillement, les interactions cellule-cellule et la vitesse des particules. Cet article présente un protocole pour surveiller les processus in vivo dans les artères collatérales en croissance au cours de l’artériogenèse en utilisant l’imagerie intravitale. La méthode décrite ici est un outil fiable pour la mesure dynamique et offre une analyse à contraste élevé avec une photocytotoxicité minimale, fournie par microscopie d’excitation multiphotonique. Avant d’analyser les artères collatérales en croissance, l’artériogenèse a été induite dans le muscle adducteur de souris par ligature unilatérale de l’artère fémorale.

Après la ligature, les artères collatérales préexistantes ont commencé à se développer en raison de l’augmentation de la contrainte de cisaillement. Vingt-quatre heures après la chirurgie, la peau et la graisse sous-cutanée au-dessus des artères collatérales ont été enlevées, construisant une poche pour d’autres analyses. Pour visualiser le flux sanguin et les cellules immunitaires pendant l’imagerie in vivo , des anticorps à base d’isothiocyanate de fluorescéine CD41 (FITC) (plaquettes) et de CD45-phycoérythrine (PE) (leucocytes) ont été injectés par voie intraveineuse (i.v.) via un cathéter placé dans la veine de la queue d’une souris. Cet article présente l’imagerie multiphotonique intravitale comme alternative ou complément in vivo aux analyses histologiques statiques ex vivo (immuno-) couramment utilisées pour étudier les processus pertinents pour l’artériogenèse. En résumé, cet article décrit une méthode in vivo nouvelle et dynamique pour étudier le trafic de cellules immunitaires, le flux sanguin et le stress de cisaillement dans un modèle d’artériogenèse des membres postérieurs, ce qui améliore considérablement les possibilités d’évaluation.

Introduction

Malgré l’intérêt intensif de la recherche au cours des dernières années, les maladies cardiovasculaires, par exemple les cardiopathies ischémiques et les accidents vasculaires cérébraux, demeurent la principale cause mondiale de décès¹. Les traitements actuels de ces maladies sont des thérapies hautement invasives telles que l’angioplastie transluminale percutanée, l’angioplastie coronaire transluminale percutanée ou le pontage^{coronarien 2}. Par conséquent, le développement d’options thérapeutiques alternatives et non invasives est nécessaire de toute urgence. Le corps peut créer des pontages naturels autour d’un vaisseau sténosé ou obstrué pour rediriger le flux sanguin interrompu vers la partie distale de la sténose. Ce processus est appelé artériogenèse². De nombreuses études récentes ont montré que l’augmentation du cisaillement des fluides a un impact sur le recrutement des leucocytes, qui joue un rôle important lors de l’artériogenèse³. Les principales options actuelles pour analyser le recrutement des leucocytes au cours de l’artériogenèse sont les analyses histologiques ex vivo ou la méthodologie de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)⁴. Pour permettre l’évaluation de la dynamique des leucocytes au cours de l’artériogenèse, cet article présente un protocole d’imagerie intravitale avec microscopie multiphotonique.

Les leucocytes sont les principales cellules sanguines recrutées au cours du processus d’artériogenèse³. Ce protocole utilise l’imagerie multiphotonique pour montrer le rampement des leucocytes adhérents marqués avec des anticorps anti-CD45-PE injectés dans les artères collatérales, 24 h après l’induction de l’artériogenèse par ligature de l’artère fémorale (LAF) utilisant une ischémie des membres postérieurs murins modèle ^5,6. Alternativement, les cellules immunitaires peuvent être marquées ex vivo et soigneusement injectées à la souris, comme le montrent les études sur l’angiogenèse utilisant la microscopie intravitale⁷. Le flux sanguin à l’intérieur des vaisseaux et des artères peut être visualisé par CD41-FITC (pour marquer les plaquettes), dextran-FITC (plasma), ou par la deuxième génération harmonique (SHG), qui visualise le collagène de type 1 présent dans la membrane basale d’une partie de l’arbre vasculaire. SHG est un effet d’étiquetage libre unique de l’excitation multiphotonique. L’imagerie multiphotonique permet un suivi cellulaire à long terme sans endommager le tissu et activer les cellules par excitation de puissance laser. La microscopie multiphotonique est la méthode d’imagerie de choix pour visualiser les cellules et les structures marquées par fluorescence chez les animaux vivants en raison de sa capacité à exciter les fluorophores plus profondément dans les tissus / organes avec une phototoxicité minimale⁸.

L’utilisation de lasers infrarouges accordés avec des impulsions délivrées à intervalles femtosecondes excite le fluorochrome uniquement au plan focal, sans excitation au-dessus et au-dessous du plan focal⁸. Ainsi, la microscopie multiphotonique permet une résolution spatio-temporelle élevée, moins de photo-dommages et une imagerie de pénétration tissulaire accrue pour étudier les événements biologiques dynamiques à l’intérieur des organes. C’est un outil de microscopie idéal pour l’imagerie d’animaux vivants. Cependant, le multiphoton et tout autre art de la microscopie intravitale est limité par le mouvement des tissus dû au rythme cardiaque, à la respiration, aux mouvements péristaltiques, à la tonalité musculaire et à d’autres fonctions physiologiques, ce qui perturbe l’acquisition et l’analyse de l’imagerie. Comme ces mouvements nuisent à la résolution temporelle et spatiale et parfois même à l’analyse ultérieure, ils doivent être traités de manière appropriée pour permettre une analyse et une interprétation précises des données. Plusieurs stratégies ont été développées pour réduire ou prévenir les artefacts du mouvement des tissus. Ce protocole applique un logiciel de correction de la dérive in situ appelé VivoFollow⁹ pour corriger la dérive tissulaire lors de l’acquisition d’images. Cette approche fournit la stabilisation d’image requise, permettant l’imagerie à long terme et l’analyse du suivi cellulaire.

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Protocole

Cette étude a été approuvée par le Comité bavarois de soin et d’utilisation des animaux (approuvé par le code d’éthique : ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99) ; ces expériences ont été réalisées en stricte conformité avec les directives de la législation animale allemande.

1. Animaux et ligature de l’artère fémorale (LAF)

REMARQUE: Pour induire une inflammation stérile et l’artériogenèse, des souris C57BL / 6J mâles âgées de 8 à 10 semaines ont été utilisées. Aucune des souris n’est morte ou n’a souffert d’une infection de la plaie ou d’une perturbation de la cicatrisation pendant ou après une chirurgie FAL ou simulée, respectivement.

1. Anesthésie
   REMARQUE: Avant l’injection de l’anesthésie MMF-mix, il est recommandé d’anesthésier d’abord avec 5% d’isoflurane jusqu’à ce que la souris dorme.
   1. Peser la souris et préparer le mélange MMF avec une dose de midazolam 5,0 mg/kg, de médétomidine 0,5 mg/kg et de fentanyl 0,05 mg/kg.
   2. Remplir une seringue de 1 mL avec le mélange MMF et injecter un volume final de 100 μL s.c. à l’aide d’une aiguille de 30 G (après anesthésie avec 5% d’isoflurane).
   3. Placez la souris sur un coussin chaud et attendez que la souris soit complètement anesthésiée. Réglez la minuterie sur 35 min. Après ce temps, injecter la moitié de la dose (50 μL) du mélange MMF.
   4. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en testant la pédale et les réflexes interdigitaux (par pincement ferme des orteils) de la souris.
      REMARQUE : L’absence de réponse indique une profondeur d’analgésie adéquate.
2. Ligature de l’artère fémorale (LAF)
   REMARQUE: Utilisez des instruments chirurgicaux et des sutures stériles. Désinfectez la peau avec un désinfectant avant l’ouverture et après la fermeture.
   1. Placez la souris anesthésiée sur une plaque chauffante (35-37 °C) pour maintenir la température corporelle physiologique. Appliquez une crème pour les yeux (dexpanthénol) sur chaque œil pour éviter le dessèchement des yeux sous anesthésie.
   2. Transférer la souris anesthésiée dans une chambre d’imagerie Doppler laser (LDI) avant et après FAL pour vérifier le flux sanguin et la perfusion (Figure 1A-C).
   3. Enlevez les poils, désinfectez la peau et faites une coupe pour accéder à l’artère fémorale. Au microscope chirurgical, ligaturer l’artère fémorale droite du membre postérieur de la souris à l’aide d’une suture de soie tressée (7-0) et effectuer une opération fictive sur l’artère fémorale gauche pour servir de contrôle interne comme décrit précédemment⁶ (Figure 1D-K).
      REMARQUE: L’incision dans la peau a été faite avec de petits ciseaux pour éviter les blessures directes aux vaisseaux sanguins proches de la peau.
   4. Fermez la peau à l’aide d’une suture en soie tressée (6-0). Administrer de la buprénorphine (0,1 mg/kg) s.c. toutes les 12 h, en commençant 10 minutes avant de contrarier l’anesthésie pour soulager la douleur. Observez l’animal pour détecter tout signe de douleur, c.-à-d. activité de toilettage réduite, réticence à bouger ou posture voûtée pendant 24 heures après la chirurgie.
   5. Injectez (s.c.) une combinaison de naloxone (1,2 mg/kg), de flumazénile (0,5 mg/kg) et d’atipamézole (2,5 mg/kg) pour antagoniser l’anesthésie après avoir terminé le FAL et fermé la peau.
   6. Après la chirurgie, gardez la souris sur le coussin chaud et surveillez continuellement l’animal jusqu’à ce qu’il puisse maintenir une posture verticale et commencer à marcher normalement autour de la cage.
   7. Lorsque la souris est complètement réveillée, replacez-la dans la cage avec les autres souris et ramenez la cage dans la salle de logement des animaux.

2. Préparation tissulaire pour l’imagerie intravitale multiphotonique

1. Injection veineuse de la queue
   REMARQUE: L’animal doit être sous anesthésie avant de commencer la préparation pour l’imagerie intravitale. Avant d’introduire l’aiguille du cathéter veineux, il est recommandé d’appliquer un désinfectant pour la peau sur la queue. Cela aidera également à visualiser les vaisseaux.
   1. Préparer un cathéter d’injection veineuse de queue à l’aide d’une aiguille de 2 x 30 G, d’un tube en polyéthylène de 10 cm de calibre fin (diamètre interne de 0,28 mm et diamètre extérieur de 0,61 mm), d’une seringue de 1 ml et d’une colle histoacrylique pour fixer le cathéter sur la queue de la souris en vue d’autres injections intraveineuses pendant l’imagerie (figures 2A, B et 2F).
   2. Préparer la solution d’anticorps pour injection intraveineuse : CD45-PE et CD41-FITC (20 μg/souris) à un volume final de 100 μL.
   3. Vérifiez la queue pour les nervures de la queue situées latéralement et endiguez la veine pour identifier la veine de la queue. Désinfectez la queue, insérez le cathéter veineux et fixez-le à l’aide de colle histoacrylique tissulaire (figure 2B).
   4. Injecter les anticorps avant l’imagerie (au moins 15 minutes avant) et après avoir terminé la préparation tissulaire.
2. Préparation des tissus
   REMARQUE: Utilisez toujours un tampon chaud et administrez une goutte de crème pour les yeux (dexpanthénol) dans chaque œil avant la préparation des tissus. Utilisez des instruments chirurgicaux et des sutures stériles. Désinfectez la peau avec un désinfectant avant l’ouverture et après la fermeture.
   1. Placez la souris anesthésiée sur un coussinet stable et portable. Fixez la souris en décubitus dorsal avec une fixation à 4 points sur le tampon à l’aide de ruban adhésif (Figure 2B).
   2. Mouler deux morceaux de pâte à modeler et placer les morceaux sous le membre postérieur supérieur de la souris pour assurer une position plane du muscle adducteur (Figure 2B, indiquée par des flèches rouges).
   3. Pour assurer une température corporelle stable de 37 °C de la souris, placez le tampon avec la souris sur une plaque chauffante sous un microscope chirurgical avec un zoom de 0,64 à 4,0 fois (Figure 1L).
   4. Enlevez les poils des deux jambes, désinfectez la peau et coupez la peau en cercle autour de la cicatrice de la ligature antérieure de l’artère fémorale du membre postérieur droit (Figure 1M).
   5. Retirez la couche de peau et de graisse du haut de la jambe (Figure 1N,O) et écartez la peau restante à l’aide de sutures pour créer une poche autour du muscle adducteur (Figure 1P,Q).
   6. Retirez la graisse sous-cutanée pour obtenir une vision claire du muscle adducteur et de l’artère/veine profonde ainsi que des vaisseaux collatéraux (Figure 1Q,R).
   7. Commencez soigneusement à enlever la couche musculaire superficielle au-dessus des vaisseaux collatéraux en la disséquant soigneusement à l’aide d’une pince fine (Figure 1R).
      REMARQUE : L’artère collatérale et la veine collatérale sont clairement visibles et prêtes pour l’imagerie (Figure 1S).
   8. Remplissez la poche préparée avec une solution saline pour éviter le dessèchement du tissu et continuez avec la même procédure pour le membre postérieur gauche opéré fictif. Avant l’imagerie, ajouter du gel ultrasonique dans les deux poches, ce qui empêche le séchage et sert de milieu d’immersion pour le couplage optique avec l’objectif (Figure 2C et Figure 2F).

3. Microscopie multiphotonique intravitale

1. Préparation
   REMARQUE: Gardez une seringue avec du gel à ultrasons à l’intérieur de la chambre de l’incubateur du microscope pour maintenir une température chaude pour remplir les poches pendant l’imagerie à long terme.
   1. Retirez la solution saline des deux poches préparées et remplacez-la par du gel à ultrasons pour couvrir les vaisseaux collatéraux (figure 2C).
   2. Injectez la solution d’anticorps à travers le cathéter de la veine de la queue. 15 min après l’injection d’anticorps, transférer le tampon avec la souris fixe dans la chambre d’imagerie multiphotonique chauffée (Figure 2F).
   3. Une fois l’acquisition de l’image terminée, euthanasier la souris par luxation cervicale sous narcose profonde.
2. Acquisition d’images en microscopie multiphotonique
   REMARQUE: Allumez le microscope 30 minutes avant l’imagerie pour permettre la stabilisation du laser. Pour la meilleure stabilité optique du microscope, il est recommandé de maintenir la chambre du microscope chauffée en permanence.
   1. Allumez la clé du boîtier laser Ti:Sapphire, les boîtiers d’interfaces électroniques, l’unité de chauffage de la chambre d’incubation, la lampe fluorescente et l’ordinateur (Figure 2D,E).
   2. Lancez le logiciel d’acquisition (logiciel Inspector). Réglez la longueur d’onde sur 800 nm et ouvrez l’obturateur du microscope (Figure 3A ii).
   3. Dans la boîte de dialogue Assistant de mesure, choisissez le mode Instrument (faisceau unique) et le mode Mesure (Time lapse de balayage 3D) (Figure 3A i).
   4. Transférer la souris anesthésiée dans la chambre d’incubation préchauffée du microscope. Positionnez la zone avec le gel à ultrasons (étape 2.2.8) directement en contact avec la lentille frontale de l’objectif (Figure 2F).
   5. Ouvrez l’obturateur du microscope à épifluorescence, choisissez un réglage filtre / dichroïque adéquat pour la visualisation FITC (4) pour trouver la zone d’intérêt en suivant le flux sanguin sous l’éclairage par épifluorescence. Après avoir placé la zone d’intérêt dans le champ de vision central, fermez l’obturateur du microscope à épifluorescence.
   6. Dans la boîte de dialogue xy-Scanner, définissez les paramètres suivants : Taille de l’image (554x554), Pixel (512x512), Fréquence (400), Moyenne des lignes (1) (Figure 3A iii). Ajustez la puissance laser (5%) (Figure 3A iv) et réglez le gain du photomultiplicateur (PMT) pour les canaux vert (66), rouge (66) et bleu (63) (Figure 3A v).
   7. Sélectionner un objectif adéquat pour les paramètres d’imagerie intravitale et de correction de la dérive (voir détails au point 3.2.11).
      REMARQUE : Ici, l’objectif sélectionné était le Nikon LWD 16x (Figure 3A vi).
   8. Définissez la plage de piles d’images en démarrant le mode d’acquisition de l’aperçu en appuyant sur le bouton rouge situé dans le coin supérieur droit de la boîte de dialogue Assistant de mesure (Figure 3A i).
   9. Définissez la zone et la structure d’intérêt en effectuant la mise au point pour obtenir une bonne image. Ensuite, tout en observant l’écran, changez de focus en déplaçant l’objectif vers le haut jusqu’à ce que l’image disparaisse, et réglez-le sur zéro (first = 0). Changez la mise au point dans la direction opposée en déplaçant l’objectif vers le bas jusqu’à ce que l’image disparaisse à nouveau de l’écran et définissez-la comme dernière position (extrémité = 40 μm) dans la direction axiale (Figure 3A vii).
   10. Définissez la taille du pas sur 2 μm. Cliquez sur le bouton rouge dans le coin supérieur droit de la boîte de dialogue Assistant de mesure pour arrêter l’analyse d’aperçu.
       REMARQUE : Le nombre d’images sera calculé et réglé automatiquement (21 images), comme indiqué à la figure 3A vii.
   11. Si le microscope est équipé d’une correction de dérive en direct⁹, démarrez le logiciel de correction de dérive (par exemple, VivoFollow) et suivez les étapes décrites ci-dessous.
       1. Dans la boîte de dialogue Assistant de mesure, choisissez l’axe Python (Python Ax) (Figure 3A viii) comme périphérique du premier axe ; N’activez PAS le mode d’enregistrement automatique. Cochez la case d’enregistrement automatique (AS) uniquement sur l’axe temporel ( Heure de temps). Appuyez sur l’icône Python de la fenêtre Available Devices (Figure 3A ix) pour ouvrir la boîte de dialogue Python .
       2. Dans les paramètres de l’axe de la boîte de dialogue Python , entrez From (0 zéro) et To (-40). Entrez le nombre d’étapes (21) comme indiqué à la figure 3A x.
       3. Accédez à la fenêtre de dialogue xyz Stage Z et agrandissez la plage de balayage de 200 μm aux deux extrémités : dans Start, entrez (200 μm) et dans End, entrez (-240 μm), la plage sera automatiquement définie (-440 μm). Conservez la taille du pas (2 μm) comme indiqué à la figure 3A xi.
       4. Ouvrez la boîte de dialogue VivoFollow Frontend et cliquez sur la case Motion Profile (Profil de mouvement ) (Figure 3A xii).
       5. Démarrez l’acquisition d’images en appuyant sur la pointe de flèche verte dans le coin supérieur gauche de la boîte de dialogue Assistant de mesure du logiciel Inspector (Figure 3A i).
       6. Si la correction de dérive sous tension est utilisée, recherchez une boîte de dialogue pour la configuration de correction de dérive à afficher comme illustré à la figure 3A xiii. Définissez le canal d’acquisition qui sera utilisé comme référence de repère immobile (pour ce protocole, choisissez le canal 2, où le signal du traceur vasculaire doit être enregistré). Entrez le décalage de correction maximal en μm qui a été ajouté aux première et dernière positions z (ici, 200 μm) et cliquez sur OK.
       7. Surveillez le décalage de dérive actuel en x, y et z en temps réel pendant l’acquisition de l’image dans la fenêtre de dialogue frontale de VivoFollow Figure 3A xiv.
       8. Arrêtez l’acquisition d’imagerie après ~35 min lorsqu’un autre cycle de réinjection d’anesthésie est nécessaire. Injecter une demi-dose du mélange MMF (50 μl s.c) et recommencer l’acquisition par imagerie en appuyant à nouveau sur la pointe de flèche verte (étape 3.2.11.5).
       9. Répétez cette procédure jusqu’à ce que l’expérience soit terminée.

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Résultats

La microscopie multiphotonique offre une résolution spatio-temporelle élevée pour le suivi des leucocytes, dans laquelle les étapes et la vitesse de migration cellulaire peuvent être suivies et surveillées (Figure 4A,B). Cependant, le mouvement physiologique de l’échantillon pose un défi, en particulier pour les acquisitions d’images de microscopie intravitale à long terme. Par conséquent, une bonne préparation tissulaire et des supports pour fixer le tissu et...

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Discussion

La méthode décrite d’analyse multiphotonique in vivo du recrutement leucocytaire représente un complément aux outils couramment utilisés pour les études de recrutement leucocytaire telles que les analyses (immuno-) histologiques ou FACS. Avec cette méthode d’imagerie, il est possible de visualiser plus en détail les processus dynamiques d’adhérence et d’extravasation des leucocytes au cours de l’artériogenèse¹⁰. Malgré la valeur ajoutée de cette méthode, le protoco...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mL Syringe	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	309628	syringe for injection
3M Durapore Surgical Tape 1538-0	3M, St. Paul, MN, USA	1538-0	fixation tape
Atipamezole	Zoetis, Berlin, Germany		antagonize anesthesia
Buprenorphine	Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK		antagonize anesthesia
C57/B6J mouse	Charles River, Sulzfeld, Germany		used animals for surgery/imaging
CD41-FITC ab	Biolegend	133904	Platelet labeling in vivo
CD45-PE ab	Biolegend	368510	Leukocytes labelling in vivo
Disinfectant Cutasept	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland	AK64.2	Disinfection
Eye cream (Bepanthen)	Bayer Vital GmbH	5g
Fentanyl	CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany		anesthesia
Flumazenile	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland		antagonize anesthesia
Fine bore polythene tubing	Smiths medical	Lot 278316	0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter
Histoacryl flexible	BRAUM	1050052	tissue glue
Imaris software	Oxford Instruments	version 9.2	Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection
Laser Doppler Imaging instrument	Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany
LEICA KL300 LED	Leica, Solms, Germany		light for microscope
Leica M60	Leica, Solms, Germany		microscope for surgery
LEICA MC120 HD	Leica, Solms, Germany		camera for microscope
Medetomidine	Pfizer Pharma, Berlin, Germany		anesthesia
Midazolam	Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany		anesthesia
Multiphoton microscope	Lavision	TRIMScope II	WL 820 nm
NaCl 0.9%	Braun, Melsungen, Deutschland	3570310	saline for pocket
Naloxone	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland		antagonize anesthesia
Needle 30 G	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	305128	needle for i.v. catheter
Silk braided suture (7-0)	Pearsalls Ltd., Taunton, UK	SUT-S 103	suture for femoral artery ligation
Ultrason Gel	SONOSID-ASID BONZ 250 mL	782012	gel for imaging
Vicryl 6.0 suture	Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA	NW-2347	suture to build pocket
VivoFollow drift correction software	Developed by Mykhailo Vladymyrov		Reference 9