Многофотонная прижизненная визуализация для мониторинга рекрутирования лейкоцитов во время артериогенеза на модели задних конечностей мышей

Резюме

Рекрутирование лейкоцитов и тромбоцитов является важным компонентом, необходимым для эффективного роста коллатеральных артерий во время артериогенеза. Многофотонная микроскопия является эффективным инструментом для отслеживания клеточной динамики с высоким пространственно-временным разрешением in vivo и меньшей фототоксичностью для изучения рекрутирования и экстравазации лейкоцитов во время артериогенеза.

Аннотация

Артериогенез сильно зависит от рекрутирования лейкоцитов и тромбоцитов в периваскулярное пространство растущих коллатеральных сосудов. Стандартным подходом к анализу коллатеральных артерий и лейкоцитов в артериогенезе является ex vivo (иммуно-) гистологическая методология. Однако этот метод не позволяет измерять динамические процессы, такие как кровоток, напряжение сдвига, межклеточные взаимодействия и скорость частиц. В данной работе представлен протокол мониторинга процессов in vivo в растущих коллатеральных артериях во время артериогенеза с использованием прижизненной визуализации. Описанный здесь метод является надежным инструментом для измерения динамики и предлагает высококонтрастный анализ с минимальной фотоцитотоксичностью, обеспечиваемый многофотонной возбуждающей микроскопией. До анализа растущих коллатеральных артерий артериогенез индуцировался в приводящей мышце мышей односторонней перевязкой бедренной артерии.

После перевязки ранее существовавшие коллатеральные артерии начали расти из-за повышенного напряжения сдвига. Через двадцать четыре часа после операции кожа и подкожно-жировая клетчатка над коллатеральными артериями были удалены, образовав карман для дальнейших анализов. Чтобы визуализировать кровоток и иммунные клетки во время визуализации in vivo , антитела CD41-флуоресцеина изотиоцианата (FITC) (тромбоциты) и CD45-фикоэритрин (ПЭ) (лейкоциты) вводили внутривенно (в/в) через катетер, помещенный в хвостовую вену мыши. В этой статье представлена прижизненная многофотонная визуализация в качестве альтернативы или дополнения in vivo к обычно используемым статическим (иммуно-) гистологическим анализам ex vivo для изучения процессов, имеющих отношение к артериогенезу. Таким образом, в этой статье описывается новый и динамичный метод in vivo для исследования трафика иммунных клеток, кровотока и напряжения сдвига в модели артериогенеза задних конечностей, что значительно расширяет возможности оценки.

Введение

Несмотря на интенсивный исследовательский интерес в последние годы, сердечно-сосудистые заболевания, например, ишемическая болезнь сердца и инсульт, по-прежнему являются ведущей глобальной причиной смерти¹. Современные методы лечения этих заболеваний представляют собой высокоинвазивные методы лечения, такие как чрескожная транслюминальная ангиопластика, чрескожная транслюминальная коронарная ангиопластика или шунтирование². Поэтому срочно необходима разработка альтернативных, неинвазивных терапевтических вариантов. Организм может создавать естественные обходы вокруг стенозированного или закупоренного сосуда, чтобы перенаправить прерванный кровоток в дистальную часть стеноза. Этот процесс называется артериогенезом². Многие недавние исследования показали, что повышенный сдвиг жидкости влияет на рекрутирование лейкоцитов, что играет важную роль во время артериогенеза³. Основными современными вариантами анализа рекрутирования лейкоцитов во время артериогенеза являются гистологические анализы ex vivo (иммуно-) или методология сортировки клеток, активированной флуоресценцией (FACS)⁴. Для оценки динамики лейкоцитов во время артериогенеза в данной работе представлен протокол прижизненной визуализации с многофотонной микроскопией.

Лейкоциты являются основными клетками крови, набираемыми в процессе артериогенеза³. В этом протоколе используется многофотонная визуализация, чтобы показать ползание адгезивных лейкоцитов, меченных инъецированными антителами против CD45-PE, в коллатеральных артериях через 24 часа после индукции артериогенеза с помощью перевязки бедренной артерии (FAL) с использованием модели^ишемии задних конечностей мыши ^5,6. В качестве альтернативы, иммунные клетки могут быть помечены ex vivo и осторожно введены мышам, как показано в исследованиях ангиогенеза с использованием прижизненной микроскопии⁷. Кровоток внутри сосудов и артерий может быть визуализирован с помощью CD41-FITC (для маркировки тромбоцитов), декстрана-FITC (плазма) или с помощью генерации второй гармоники (SHG), которая визуализирует коллаген типа 1, присутствующий в базальной мембране некоторой части сосудистого дерева. ГСП – это уникальный свободный меченый эффект многофотонного возбуждения. Многофотонная визуализация позволяет осуществлять долгосрочное отслеживание клеток, не повреждая ткани и не активируя клетки путем возбуждения лазерной энергии. Многофотонная микроскопия является предпочтительным методом визуализации для визуализации флуоресцентно меченных клеток и структур у живых животных из-за ее способности возбуждать флуорофоры глубже в ткани/органы с минимальной фототоксичностью⁸.

Использование настроенных инфракрасных лазеров с импульсами, доставляемыми в фемтосекундных интервалах, возбуждает флуорохром только в фокальной плоскости, без возбуждения выше и ниже фокальной плоскости⁸. Таким образом, многофотонная микроскопия обеспечивает высокое пространственно-временное разрешение, меньшее количество фотоповреждений и увеличенную визуализацию проникновения в ткани для изучения динамических биологических событий внутри органов. Это идеальный инструмент микроскопии для визуализации живых животных. Однако многофотонная и любая другая техника прижизненной микроскопии ограничена движением тканей из-за сердцебиения, дыхания, перистальтических движений, тонуса мышц и других физиологических функций, что нарушает получение и анализ изображений. Поскольку эти перемещения ухудшают временное и пространственное разрешение, а иногда даже препятствуют последующему анализу, они должны быть надлежащим образом устранены, чтобы обеспечить точный анализ и интерпретацию данных. Было разработано несколько стратегий для снижения или предотвращения артефактов от движения тканей. Этот протокол применяет программное обеспечение для коррекции дрейфа in situ под названием VivoFollow⁹ для коррекции дрейфа тканей во время получения изображения. Такой подход обеспечивает необходимую стабилизацию изображения, позволяя проводить долгосрочную визуализацию и анализ отслеживания клеток.

протокол

Это исследование было одобрено Баварским комитетом по уходу за животными и их использованию (одобрено этическим кодексом: ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99); эти эксперименты проводились в строгом соответствии с руководящими принципами немецкого законодательства о животных.

1. Животные и перевязка бедренной артерии (FAL)

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы вызвать стерильное воспаление и артериогенез, использовали 8-10-недельных мышей-самцов C57BL / 6J. Ни одна из мышей не умерла и не пострадала от раневой инфекции или нарушения заживления ран во время или после FAL или фиктивной операции, соответственно.

1. Анестезия
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед введением ММФ-микс анестезии рекомендуется сначала обезболить 5% изофлураном, пока мышь не уснет.
   1. Взвесьте мышь и приготовьте смесь ММФ с дозой мидазолама 5,0 мг/кг, медетомидина 0,5 мг/кг и фентанила 0,05 мг/кг.
   2. Наполните шприц объемом 1 мл смесью ММФ и введите конечный объем 100 мкл.к. с помощью иглы 30 г (после анестезии 5% изофлураном).
   3. Положите мышь на теплую подушечку и подождите, пока мышь полностью обезболиется. Установите таймер на 35 минут. По истечении этого времени вводят/к половину дозы (50 мкл) ММФ-смеси.
   4. Проверьте глубину анестезии, проверив педальные и межпальцевые рефлексы (путем сильного защемления пальца ноги) мыши.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отсутствие ответа указывает на адекватную глубину обезболивания.
2. Перевязка бедренной артерии (FAL)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильные хирургические инструменты и швы. Продезинфицируйте кожу дезинфицирующим средством перед открытием и после закрытия.
   1. Поместите мышь, находящуюся под наркозом, на нагревательную пластину (35-37 °C) для поддержания физиологической температуры тела. Нанесите крем для глаз (декспантенол) на каждый глаз, чтобы предотвратить высыхание глаз под наркозом.
   2. Переведите анестезированную мышь в камеру лазерной допплерографии (LDI) до и после FAL, чтобы проверить кровоток и перфузию (рис. 1A-C).
   3. Удалите волосы, продезинфицируйте кожу и сделайте разрез для доступа к бедренной артерии. Под хирургическим микроскопом перевязать правую бедренную артерию задней конечности мыши с помощью плетеного шелкового шва (7-0) и выполнить фиктивную операцию на левой бедренной артерии, которая будет служить внутренним контролем, как описано^{ранее 6} (рис. 1D-K).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разрез на коже был сделан маленькими ножницами, чтобы избежать прямого повреждения кровеносных сосудов, близких к коже.
   4. Закройте кожу с помощью плетеного шелкового шва (6-0). Вводят бупренорфин (0,1 мг/кг)/к каждые 12 ч, начиная с 10 мин, до антагонизма анестезии для облегчения боли. Наблюдайте за животным на предмет признаков боли, т. е. снижения активности груминга, нежелания двигаться или сгорбленной осанки в течение 24 часов после операции.
   5. Вводят (/к) комбинацию налоксона (1,2 мг/кг), флумазенила (0,5 мг/кг) и атипамезола (2,5 мг/кг), чтобы противодействовать анестезии после завершения FAL и закрытия кожи.
   6. После операции держите мышь на теплой подушке и постоянно следите за животным, пока оно не сможет сохранять вертикальное положение и не начнет нормально ходить по клетке.
   7. Когда мышь полностью проснулась, поместите ее обратно в клетку вместе с другими мышами и верните клетку в комнату для содержания животных.

2. Подготовка тканей к многофотонной прижизненной визуализации

1. Инъекция в хвостовую вену
   ПРИМЕЧАНИЕ: Животное должно находиться под наркозом перед началом подготовки к прижизненной визуализации. Перед введением иглы венозного катетера рекомендуется нанести на хвост дезинфицирующее средство для кожи. Это также поможет визуализировать сосуды.
   1. Подготовьте катетер для инъекции в хвостовую вену, используя иглу 2 x 30 G, 10 см полиэтиленовой трубки с тонким отверстием (внутренний диаметр 0,28 мм и внешний диаметр 0,61 мм), шприц объемом 1 мл и гистоакриловый клей для фиксации катетера на хвосте мыши для дальнейших внутривенных инъекций во время визуализации (рис. 2A, B и рис. 2F).
   2. Приготовьте раствор антител для внутривенной инъекции: CD45-PE и CD41-FITC (20 мкг/мышь) в конечном объеме 100 мкл.
   3. Проверьте хвост на наличие боковых хвостовых вен и запрудите вену, чтобы определить хвостовую вену. Продезинфицируйте хвост, вставьте венозный катетер и зафиксируйте его с помощью тканевого гистоакрилового клея (рис. 2B).
   4. Вводите антитела до визуализации (не менее чем за 15 минут) и после завершения подготовки тканей.
2. Подготовка тканей
   ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте теплую подушечку и вводите каплю крема для глаз (декспантенола) в каждый глаз перед подготовкой тканей. Используйте стерильные хирургические инструменты и швы. Продезинфицируйте кожу дезинфицирующим средством перед открытием и после закрытия.
   1. Поместите анестезированную мышь на устойчивую и портативную подушечку. Зафиксируйте мышь в положении лежа на спине с 4-точечной фиксацией на подушечке с помощью скотча (рис. 2Б).
   2. Сформируйте два кусочка пластилина и поместите кусочки под верхнюю заднюю конечность мыши, чтобы обеспечить ровное положение приводящей мышцы (рис. 2B, обозначен красными стрелками).
   3. Чтобы обеспечить стабильную температуру тела мыши 37 °C, поместите подушечку с мышью на нагревательную пластину под хирургическим микроскопом с 0,64-4,0-кратным зумом (рис. 1L).
   4. Удалите волосы с обеих ног, продезинфицируйте кожу и разрежьте кожу по кругу вокруг рубца от более ранней перевязки бедренной артерии правой задней конечности (рис. 1M).
   5. Удалите кожу и жировой слой с верхней части ноги (рис. 1N, O) и оттяните оставшуюся кожу с помощью швов, чтобы создать карман вокруг приводящей мышцы (рис. 1P, Q).
   6. Удалите подкожный жир, чтобы получить четкое представление о приводящей мышце и глубокой артерии/вене, а также о коллатеральных сосудах (рис. 1Q, R).
   7. Осторожно начните удаление поверхностного мышечного слоя поверх коллатеральных сосудов, осторожно рассекая его тонкими щипцами (рис. 1R).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коллатеральная артерия и коллатеральная вена хорошо видны и готовы к визуализации (рис. 1S).
   8. Наполните подготовленный карман физиологическим раствором, чтобы избежать высыхания ткани, и продолжите ту же процедуру для фиктивно прооперированной левой задней конечности. Перед визуализацией добавьте ультразвуковой гель в оба кармана, который предотвращает высыхание и служит иммерсионной средой для оптического соединения с объективом (рис. 2C и рис. 2F).

3. Прижизненная многофотонная микроскопия

1. Подготовка
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите шприц с ультразвуковым гелем внутри камеры инкубатора микроскопа, чтобы поддерживать теплую температуру для наполнения карманов во время длительной визуализации.
   1. Извлеките физиологический раствор из двух подготовленных карманов и замените его ультразвуковым гелем, чтобы покрыть коллатеральные сосуды (рис. 2C).
   2. Вводят раствор антител через катетер хвостовой вены. Через 15 минут после инъекции антитела перенесите подушечку с неподвижной мышью в нагретую многофотонную камеру визуализации (рис. 2F).
   3. После завершения получения изображения усыпьте мышь вывихом шейки матки под глубоким наркозом.
2. Получение изображений с помощью многофотонной микроскопии
   ПРИМЕЧАНИЕ: Включите микроскоп за 30 минут до получения изображения, чтобы обеспечить лазерную стабилизацию. Для достижения наилучшей оптической стабильности микроскопа рекомендуется постоянно нагревать камеру микроскопа.
   1. Включите ключ лазерной коробки Ti:Sapphire, блоки электронных интерфейсов, нагревательный блок инкубационной камеры, люминесцентную лампу и компьютер (рис. 2D, E).
   2. Запустите программное обеспечение для сбора данных (программное обеспечение Inspector). Установите длину волны на 800 нм и откройте затвор микроскопа (рис. 3A ii).
   3. В диалоговом окне Measurement Wizard (Мастер измерений) выберите Instrument Mode (Single beam) и ( Measurement Mode (3D-scan Timelapse) (рисунок 3A i).
   4. Перенесите анестезированную мышь в предварительно подогретую инкубационную камеру микроскопа. Расположите область с ультразвуковым гелем (этап 2.2.8) непосредственно в контакте с передней линзой объектива (рис. 2F).
   5. Откройте затвор эпифлуоресцентного микроскопа, выберите адекватную настройку фильтра/дихроичности для визуализации FITC (4), чтобы найти интересующую область, проследив за кровотоком при эпифлуоресцентном освещении. После того, как область интереса окажется в центре поля зрения, закройте затвор эпифлуоресцентного микроскопа.
   6. В диалоговом окне xy-Scanner задайте следующие параметры: Размер изображения (554x554), Пиксель (512x512), Частота (400), Среднее значение строки (1) (рис. 3A iii). Отрегулируйте мощность лазера (5%) (рис. 3A iv) и установите коэффициент усиления фотоумножителя (ФЭУ) для зеленых (66), красных (66) и синих (63) каналов (рис. 3A v).
   7. Выберите адекватный объектив для прижизненной визуализации и настройки коррекции дрейфа (см. подробности в 3.2.11).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь выбран объектив Nikon LWD 16x (рис. 3A vi).
   8. Определите диапазон стека изображений, запустив режим предварительного просмотра , нажав красную кнопку в правом верхнем углу диалогового окна Measurement Wizard (рисунок 3A i).
   9. Определите интересующую область и структуру, сфокусировавшись, чтобы получить хорошее изображение. Затем, наблюдая за экраном, измените фокус, перемещая объектив вверх, пока изображение не исчезнет, и установите его равным нулю (первый = 0). Измените фокус в противоположном направлении, перемещая объектив вниз до тех пор, пока изображение снова не исчезнет с экрана, и установите его в качестве последнего (конец = 40 мкм) положения в осевом направлении (рис. 3A vii).
   10. Установите размер шага 2 мкм. Нажмите красную кнопку в правом верхнем углу диалогового окна «Мастер измерений », чтобы остановить предварительный просмотр сканирования.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Количество изображений будет рассчитано и установлено автоматически (21 изображение), как показано на рисунке 3A vii.
   11. Если микроскоп оснащен функцией коррекции дрейфа в реальном времени⁹, запустите программное обеспечение для коррекции дрейфа (например, VivoFollow) и выполните шаги, описанные ниже.
       1. В диалоговом окне «Мастер измерений» выберите ось Python (Python Ax) (рис. 3A viii) в качестве устройства первой оси; НЕ активируйте режим автосохранения. Установите флажок автосохранения (AS) только на оси времени (Time Time). Нажмите на иконку Python в окне Available Devices (рисунок 3A ix), чтобы открыть диалоговое окно Python.
       2. В диалоговом окне Python «Настройки оси» введите «От» (0 ноль) и «До» (-40). Введите количество шагов (21), как показано на рисунке 3A x.
       3. Перейдите в диалоговое окно xyz Stage Z и увеличьте диапазон сканирования на 200 мкм на обоих концах: в поле « Пуск» введите (200 мкм) и в поле «Конец» введите (-240 мкм), диапазон будет установлен автоматически (-440 мкм). Сохраняйте размер шага (2 мкм), как показано на рисунке 3A xi.
       4. Откройте диалог VivoFollow Frontend и нажмите на поле Motion Profile (рисунок 3A xii).
       5. Начните получение изображения, нажав зеленую стрелку в верхнем левом углу диалогового окна Measurement Wizard программного обеспечения Inspector (рисунок 3A i).
       6. Если используется коррекция дрейфа в реальном времени, найдите диалоговое окно для конфигурации коррекции дрейфа, как показано на рисунке 3A xiii. Установите канал сбора, который будет использоваться в качестве неподвижного ориентира (для этого протокола выберите канал 2, по которому будет записываться сигнал сосудистого индикатора). Введите максимальное смещение коррекции в мкм, которое было добавлено к первой и последней позициям z (здесь 200 мкм), и нажмите кнопку «ОК».
       7. Отслеживайте смещение смещения тока в x, y и z в режиме реального времени во время получения изображения в диалоговом окне VivoFollow Рисунок 3A xiv.
       8. Прекратите получение изображений через ~ 35 минут, когда требуется еще один цикл повторной инъекции анестезии. Введите половину дозы смеси MMF (50 мкл s.c.) и снова начните получение изображения, снова нажав на зеленую стрелку (этап 3.2.11.5).
       9. Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока эксперимент не будет завершен.

Результаты

Многофотонная микроскопия обеспечивает высокое пространственно-временное разрешение для отслеживания лейкоцитов, при этом можно отслеживать и контролировать этапы и скорость миграции клеток (рис. 4A, B). Тем не менее, физиологическое движение образца представ?...

Обсуждение

Описанный метод многофотонного анализа рекрутирования лейкоцитов in vivo представляет собой дополнение к широко используемым инструментам для исследований рекрутирования лейкоцитов, таким как (иммуно-) гистологический анализ или анализ FACS. С помощью этого метода визуализации можн...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mL Syringe	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	309628	syringe for injection
3M Durapore Surgical Tape 1538-0	3M, St. Paul, MN, USA	1538-0	fixation tape
Atipamezole	Zoetis, Berlin, Germany		antagonize anesthesia
Buprenorphine	Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK		antagonize anesthesia
C57/B6J mouse	Charles River, Sulzfeld, Germany		used animals for surgery/imaging
CD41-FITC ab	Biolegend	133904	Platelet labeling in vivo
CD45-PE ab	Biolegend	368510	Leukocytes labelling in vivo
Disinfectant Cutasept	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland	AK64.2	Disinfection
Eye cream (Bepanthen)	Bayer Vital GmbH	5g
Fentanyl	CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany		anesthesia
Flumazenile	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland		antagonize anesthesia
Fine bore polythene tubing	Smiths medical	Lot 278316	0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter
Histoacryl flexible	BRAUM	1050052	tissue glue
Imaris software	Oxford Instruments	version 9.2	Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection
Laser Doppler Imaging instrument	Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany
LEICA KL300 LED	Leica, Solms, Germany		light for microscope
Leica M60	Leica, Solms, Germany		microscope for surgery
LEICA MC120 HD	Leica, Solms, Germany		camera for microscope
Medetomidine	Pfizer Pharma, Berlin, Germany		anesthesia
Midazolam	Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany		anesthesia
Multiphoton microscope	Lavision	TRIMScope II	WL 820 nm
NaCl 0.9%	Braun, Melsungen, Deutschland	3570310	saline for pocket
Naloxone	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland		antagonize anesthesia
Needle 30 G	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	305128	needle for i.v. catheter
Silk braided suture (0/7)	Pearsalls Ltd., Taunton, UK	SUT-S 103	suture for femoral artery ligation
Ultrason Gel	SONOSID-ASID BONZ 250 mL	782012	gel for imaging
Vicryl 6.0 suture	Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA	NW-2347	suture to build pocket
VivoFollow drift correction software	Developed by Mykhailo Vladymyrov		Reference 9