Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Рекрутирование лейкоцитов и тромбоцитов является важным компонентом, необходимым для эффективного роста коллатеральных артерий во время артериогенеза. Многофотонная микроскопия является эффективным инструментом для отслеживания клеточной динамики с высоким пространственно-временным разрешением in vivo и меньшей фототоксичностью для изучения рекрутирования и экстравазации лейкоцитов во время артериогенеза.

Аннотация

Артериогенез сильно зависит от рекрутирования лейкоцитов и тромбоцитов в периваскулярное пространство растущих коллатеральных сосудов. Стандартным подходом к анализу коллатеральных артерий и лейкоцитов в артериогенезе является ex vivo (иммуно-) гистологическая методология. Однако этот метод не позволяет измерять динамические процессы, такие как кровоток, напряжение сдвига, межклеточные взаимодействия и скорость частиц. В данной работе представлен протокол мониторинга процессов in vivo в растущих коллатеральных артериях во время артериогенеза с использованием прижизненной визуализации. Описанный здесь метод является надежным инструментом для измерения динамики и предлагает высококонтрастный анализ с минимальной фотоцитотоксичностью, обеспечиваемый многофотонной возбуждающей микроскопией. До анализа растущих коллатеральных артерий артериогенез индуцировался в приводящей мышце мышей односторонней перевязкой бедренной артерии.

После перевязки ранее существовавшие коллатеральные артерии начали расти из-за повышенного напряжения сдвига. Через двадцать четыре часа после операции кожа и подкожно-жировая клетчатка над коллатеральными артериями были удалены, образовав карман для дальнейших анализов. Чтобы визуализировать кровоток и иммунные клетки во время визуализации in vivo , антитела CD41-флуоресцеина изотиоцианата (FITC) (тромбоциты) и CD45-фикоэритрин (ПЭ) (лейкоциты) вводили внутривенно (в/в) через катетер, помещенный в хвостовую вену мыши. В этой статье представлена прижизненная многофотонная визуализация в качестве альтернативы или дополнения in vivo к обычно используемым статическим (иммуно-) гистологическим анализам ex vivo для изучения процессов, имеющих отношение к артериогенезу. Таким образом, в этой статье описывается новый и динамичный метод in vivo для исследования трафика иммунных клеток, кровотока и напряжения сдвига в модели артериогенеза задних конечностей, что значительно расширяет возможности оценки.

Введение

Несмотря на интенсивный исследовательский интерес в последние годы, сердечно-сосудистые заболевания, например, ишемическая болезнь сердца и инсульт, по-прежнему являются ведущей глобальной причиной смерти1. Современные методы лечения этих заболеваний представляют собой высокоинвазивные методы лечения, такие как чрескожная транслюминальная ангиопластика, чрескожная транслюминальная коронарная ангиопластика или шунтирование2. Поэтому срочно необходима разработка альтернативных, неинвазивных терапевтических вариантов. Организм может создавать естественные обходы вокруг стенозированного или закупоренного сосуда, чтобы перена....

протокол

Это исследование было одобрено Баварским комитетом по уходу за животными и их использованию (одобрено этическим кодексом: ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99); эти эксперименты проводились в строгом соответствии с руководящими принципами немецкого законодательства о животных.

1. Животные и перевязка бедренной артерии (FAL)

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы вызвать стерильное воспаление и артериогенез, использовали 8-10-недельных мышей-самцов C57BL / 6J. Ни одна из мышей не умерла и не пострадала от раневой инфекции или нарушения заживления ран во время или после FAL или фиктивной операции, соответственно.

  1. Анестезия
    ПРИМЕЧ....

Результаты

Многофотонная микроскопия обеспечивает высокое пространственно-временное разрешение для отслеживания лейкоцитов, при этом можно отслеживать и контролировать этапы и скорость миграции клеток (рис. 4A, B). Тем не менее, физиологическое движение образца представ?.......

Обсуждение

Описанный метод многофотонного анализа рекрутирования лейкоцитов in vivo представляет собой дополнение к широко используемым инструментам для исследований рекрутирования лейкоцитов, таким как (иммуно-) гистологический анализ или анализ FACS. С помощью этого метода визуализации можн.......

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.

Благодарности

Исследование финансировалось Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 914 (HI-A/SM, проект Z01). Мы благодарим доктора Сюзанну Штутте за прочтение рукописи.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.0 mL SyringeBD Biosciences, San Jose, CA, USA309628syringe for injection
3M Durapore Surgical Tape 1538-03M, St. Paul, MN, USA1538-0fixation tape
AtipamezoleZoetis, Berlin, Germanyantagonize anesthesia
BuprenorphineReckitt Benckiser Healthcare, Slough, UKantagonize anesthesia
C57/B6J mouseCharles River, Sulzfeld, Germanyused animals for surgery/imaging
CD41-FITC abBiolegend133904Platelet labeling in vivo
CD45-PE abBiolegend368510Leukocytes labelling in vivo
Disinfectant CutaseptCarl Roth GmbH, Karlsruhe, DeutschlandAK64.2Disinfection
Eye cream (Bepanthen)Bayer Vital GmbH5g
FentanylCuraMED Pharma, Karlsruhe, Germanyanesthesia
FlumazenileInresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschlandantagonize anesthesia
Fine bore polythene tubingSmiths medicalLot 2783160.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter
Histoacryl flexibleBRAUM1050052tissue glue
Imaris softwareOxford Instrumentsversion 9.2Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection
Laser Doppler Imaging instrumentMoor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany
LEICA KL300 LEDLeica, Solms, Germanylight for microscope
Leica M60Leica, Solms, Germanymicroscope for surgery
LEICA MC120 HDLeica, Solms, Germanycamera for microscope
MedetomidinePfizer Pharma, Berlin, Germanyanesthesia
MidazolamRatiopharm GmbH, Ulm, Germanyanesthesia
Multiphoton microscopeLavisionTRIMScope IIWL 820 nm
NaCl 0.9%Braun, Melsungen, Deutschland3570310saline for pocket
NaloxoneInresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschlandantagonize anesthesia
Needle 30 GBD Biosciences, San Jose, CA, USA305128needle for i.v. catheter
Silk braided suture (0/7)Pearsalls Ltd., Taunton, UKSUT-S 103suture for femoral artery ligation
Ultrason GelSONOSID-ASID BONZ 250 mL782012gel for imaging
Vicryl 6.0 sutureVicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USANW-2347suture to build pocket
VivoFollow drift correction softwareDeveloped by Mykhailo VladymyrovReference 9

Ссылки

  1. The top 10 causes of death. World Health Organization Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2020)
  2. Deindl, E., Schaper, W. The art of arteriogenesis. Cell Biochemistry and Biophysics. 43 (1), 1-15 (2005).
  3. Lasch, M., et al.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE175ViVoFollow

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены