Многофотонная прижизненная визуализация для мониторинга рекрутирования лейкоцитов во время артериогенеза на модели задних конечностей мышей

Резюме

Рекрутирование лейкоцитов и тромбоцитов является важным компонентом, необходимым для эффективного роста коллатеральных артерий во время артериогенеза. Многофотонная микроскопия является эффективным инструментом для отслеживания клеточной динамики с высоким пространственно-временным разрешением in vivo и меньшей фототоксичностью для изучения рекрутирования и экстравазации лейкоцитов во время артериогенеза.

Аннотация

Артериогенез сильно зависит от рекрутирования лейкоцитов и тромбоцитов в периваскулярное пространство растущих коллатеральных сосудов. Стандартным подходом к анализу коллатеральных артерий и лейкоцитов в артериогенезе является ex vivo (иммуно-) гистологическая методология. Однако этот метод не позволяет измерять динамические процессы, такие как кровоток, напряжение сдвига, межклеточные взаимодействия и скорость частиц. В данной работе представлен протокол мониторинга процессов in vivo в растущих коллатеральных артериях во время артериогенеза с использованием прижизненной визуализации. Описанный здесь метод является надежным инструментом для измерения динамики и предлагает высококонтрастный анализ с минимальной фотоцитотоксичностью, обеспечиваемый многофотонной возбуждающей микроскопией. До анализа растущих коллатеральных артерий артериогенез индуцировался в приводящей мышце мышей односторонней перевязкой бедренной артерии.

После перевязки ранее существовавшие коллатеральные артерии начали расти из-за повышенного напряжения сдвига. Через двадцать четыре часа после операции кожа и подкожно-жировая клетчатка над коллатеральными артериями были удалены, образовав карман для дальнейших анализов. Чтобы визуализировать кровоток и иммунные клетки во время визуализации in vivo , антитела CD41-флуоресцеина изотиоцианата (FITC) (тромбоциты) и CD45-фикоэритрин (ПЭ) (лейкоциты) вводили внутривенно (в/в) через катетер, помещенный в хвостовую вену мыши. В этой статье представлена прижизненная многофотонная визуализация в качестве альтернативы или дополнения in vivo к обычно используемым статическим (иммуно-) гистологическим анализам ex vivo для изучения процессов, имеющих отношение к артериогенезу. Таким образом, в этой статье описывается новый и динамичный метод in vivo для исследования трафика иммунных клеток, кровотока и напряжения сдвига в модели артериогенеза задних конечностей, что значительно расширяет возможности оценки.

Введение

Несмотря на интенсивный исследовательский интерес в последние годы, сердечно-сосудистые заболевания, например, ишемическая болезнь сердца и инсульт, по-прежнему являются ведущей глобальной причиной смерти¹. Современные методы лечения этих заболеваний представляют собой высокоинвазивные методы лечения, такие как чрескожная транслюминальная ангиопластика, чрескожная транслюминальная коронарная ангиопластика или шунтирование². Поэтому срочно необходима разработка альтернативных, неинвазивных терапевтических вариантов. Организм может создавать естественные обходы вокруг стенозированного или закупоренного сосуда, чтобы перена....

протокол

Это исследование было одобрено Баварским комитетом по уходу за животными и их использованию (одобрено этическим кодексом: ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99); эти эксперименты проводились в строгом соответствии с руководящими принципами немецкого законодательства о животных.

1. Животные и перевязка бедренной артерии (FAL)

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы вызвать стерильное воспаление и артериогенез, использовали 8-10-недельных мышей-самцов C57BL / 6J. Ни одна из мышей не умерла и не пострадала от раневой инфекции или нарушения заживления ран во время или после FAL или фиктивной операции, соответственно.

1. Анестезия
   ПРИМЕЧ....

Результаты

Многофотонная микроскопия обеспечивает высокое пространственно-временное разрешение для отслеживания лейкоцитов, при этом можно отслеживать и контролировать этапы и скорость миграции клеток (рис. 4A, B). Тем не менее, физиологическое движение образца представ?.......

Обсуждение

Описанный метод многофотонного анализа рекрутирования лейкоцитов in vivo представляет собой дополнение к широко используемым инструментам для исследований рекрутирования лейкоцитов, таким как (иммуно-) гистологический анализ или анализ FACS. С помощью этого метода визуализации можн.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mL Syringe	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	309628	syringe for injection
3M Durapore Surgical Tape 1538-0	3M, St. Paul, MN, USA	1538-0	fixation tape
Atipamezole	Zoetis, Berlin, Germany		antagonize anesthesia
Buprenorphine	Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK		antagonize anesthesia
C57/B6J mouse	Charles River, Sulzfeld, Germany		used animals for surgery/imaging
CD41-FITC ab	Biolegend	133904	Platelet labeling in vivo
CD45-PE ab	Biolegend	368510	Leukocytes labelling in vivo
Disinfectant Cutasept	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland	AK64.2	Disinfection
Eye cream (Bepanthen)	Bayer Vital GmbH	5g
Fentanyl	CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany		anesthesia
Flumazenile	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland		antagonize anesthesia
Fine bore polythene tubing	Smiths medical	Lot 278316	0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter
Histoacryl flexible	BRAUM	1050052	tissue glue
Imaris software	Oxford Instruments	version 9.2	Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection
Laser Doppler Imaging instrument	Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany
LEICA KL300 LED	Leica, Solms, Germany		light for microscope
Leica M60	Leica, Solms, Germany		microscope for surgery
LEICA MC120 HD	Leica, Solms, Germany		camera for microscope
Medetomidine	Pfizer Pharma, Berlin, Germany		anesthesia
Midazolam	Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany		anesthesia
Multiphoton microscope	Lavision	TRIMScope II	WL 820 nm
NaCl 0.9%	Braun, Melsungen, Deutschland	3570310	saline for pocket
Naloxone	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland		antagonize anesthesia
Needle 30 G	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	305128	needle for i.v. catheter
Silk braided suture (0/7)	Pearsalls Ltd., Taunton, UK	SUT-S 103	suture for femoral artery ligation
Ultrason Gel	SONOSID-ASID BONZ 250 mL	782012	gel for imaging
Vicryl 6.0 suture	Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA	NW-2347	suture to build pocket
VivoFollow drift correction software	Developed by Mykhailo Vladymyrov		Reference 9