Un sistema de explante para estudios de imágenes de lapso de tiempo del ensamblaje de circuitos olfativos en Drosophila

Resumen

Este protocolo describe el procedimiento de disección, la condición de cultivo y las imágenes en vivo de un sistema de explante antena-cerebro para el estudio del ensamblaje del circuito olfativo.

Resumen

Las neuronas están interconectadas con precisión para formar circuitos esenciales para el correcto funcionamiento del cerebro. El sistema olfativo de Drosophila proporciona un excelente modelo para investigar este proceso, ya que 50 tipos de neuronas receptoras olfativas (ORN) de las antenas y palpos maxilares proyectan sus axones a 50 glomérulos identificables en el lóbulo antenal y forman conexiones sinápticas con dendritas de 50 tipos de neuronas de proyección de segundo orden (PN). Estudios previos se centraron principalmente en identificar moléculas importantes que regulan la orientación precisa en el circuito olfativo utilizando tejidos fijos. Aquí, se describe un sistema de explante antena-cerebro que recapitula los hitos clave del desarrollo del ensamblaje del circuito olfativo en cultivo. A través de la disección de la cutícula externa y la limpieza de cuerpos grasos opacos que cubren el cerebro pupal en desarrollo, se pueden recopilar imágenes de alta calidad de neuronas individuales de cerebros vivos utilizando microscopía de dos fotones. Esto permite obtener imágenes de lapso de tiempo de un solo axón ORN dirigido desde tejido vivo. Este enfoque ayudará a revelar contextos biológicos celulares importantes y funciones de genes importantes previamente identificados e identificar mecanismos que sustentan el proceso dinámico de ensamblaje de circuitos.

Introducción

Las neuronas están interconectadas con precisión para formar circuitos esenciales para el correcto funcionamiento del cerebro. Durante más de 100 años, los neurocientíficos han estado tratando de comprender cómo las neuritas se extienden hacia sus objetivos intermedios y finales con extrema precisión. Como resultado, han identificado genes importantes que codifican señales de guía para el desarrollo de procesos neuronales¹. El sistema olfativo de Drosophila proporciona un excelente modelo para investigar este proceso, ya que las neuronas receptoras olfativas (ORN, las neuronas sensoriales primarias) se proyectan a 50 glomérulos identificables con tamaño, forma y posición relativa estereotipados, donde forman conexiones sinápticas con dendritas de 50 tipos de neuronas de proyección de segundo orden (PN), cada una de las cuales envía dendritas a uno de los 50 glomérulos² (Figura 1A ). Por lo tanto, es relativamente fácil identificar fenotipos mutantes a resolución sináptica (glomerular) en el sistema olfativo de la mosca. Esto llevó a descubrimientos de genes importantes que regulan el ensamblaje del circuito olfativo³.

El ensamblaje del circuito olfativo de la mosca se basa en procesos de desarrollo coordinados temporal y espacialmente³. Los ORN y los PN adquieren destinos celulares distintos, que configuran el programa para sus especificidades de cableado. A continuación, las dendritas PN prepatronan el lóbulo antenal (Figura 1B). Los axones de los ORN luego circunnavegan el lóbulo antenal ipsilateral y cruzan la línea media del cerebro para llegar al lóbulo antenal contralateral. Posteriormente, los axones ORN invaden los lóbulos antenales ipsi- y contralaterales y forman sinapsis con dendritas de sus compañeros PNs en glomérulos específicos. Este modelo grueso para el ensamblaje de circuitos olfativos se propuso a partir de la caracterización de muestras fijas a partir de puntos de tiempo intermedios durante el desarrollo. La mala resolución temporal y la incapacidad de seguir los mismos procesos neuronales a través del desarrollo a partir de tejido fijo limitan la comprensión mecanicista del proceso de ensamblaje del circuito.

Es técnicamente difícil vivir los procesos orn y PN in vivo, ya que el proceso de cableado ocurre en la primera mitad de la etapa pupal cuando el lóbulo antenal está rodeado por un cuerpo de grasa opaco dentro de la caja pupal. Por lo tanto, es imposible obtener imágenes directas del circuito olfativo en desarrollo a partir de pupas intactas. Los tejidos disecados cultivados ex vivo pueden eludir la opacidad tisular y se han utilizado con éxito para estudiar el desarrollo neuronal ^4,5,6. El desafío de usar una estrategia de cultivo de explante ex vivo similar para estudiar el cableado neuronal en el cerebro pupal es si recapitula la orientación neuronal precisa en una condición de cultivo. Sobre la base de una condición de cultivo ex vivo previamente informada para el complejo ojo de mosca-cerebro⁷, recientemente se ha desarrollado un explante que contiene todo el cerebro pupal, las antenas y los nervios antenales de conexión intactos, que conserva la orientación precisa del circuito olfativo y puede someterse a imágenes en vivo basadas en microscopía de dos fotones durante hasta 24 h a la frecuencia de cada 20 min⁸ . Aquí, se describe un protocolo detallado del cultivo de explante y las imágenes. El sistema de explante proporciona un método poderoso para estudiar el ensamblaje del circuito olfativo y potencialmente otros circuitos en el cerebro central.

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Protocolo

1. Preparación de reactivos

NOTA: Todos los pasos de este protocolo se llevan a cabo a temperatura ambiente (20-25 °C) a menos que se explique lo contrario.

1. Para preparar la placa de cultivo para inmovilizar el explante durante la toma de imágenes de lapso de tiempo, coloque Sylgard de 0,5 cm de espesor (mezcle bien dos componentes líquidos en una proporción de 10: 1 antes de usarla) en la superficie inferior de una placa de Petri de 60 mm x 15 mm y déjela curar durante 48 h a temperatura ambiente (Figura 2A, denominada placa Sylgard en el siguiente texto).
2. Para preparar micro pines para inmovilizar el explante en esta placa, use un par de pinzas para pegar múltiples micro pines en una cinta con los extremos afilados alineados en un lado (Figura 2B). Use un par de tijeras para cortar ~ 2 mm de los extremos afilados de los micro pines (Figura 2B'). Use pinzas para sujetar los micro pasadores cortados e insértelos en la capa de Sylgard de una placa de Sylgard prefabricada (Figura 2C). Se utilizan dos micro pines para inmovilizar un explante.
3. Use un cepillo para recolectar pupas blancas, que forman pupario dentro de 1 h, de hsFLP, guijarros-GAL4 / +; UAS-FRT^100-stop-FRT 100-mCD8-GFP ⁸ genotipo y transferirlos a nuevos viales. Choque térmico en un baño de agua a 37 °C durante 40 min para inducir clones de ORN dispersos de tipos aleatorios. Después del choque térmico, coloque los viales a 25 ° C durante 30 h, lo que resulta en pupas envejecidas a las 30 h después de la formación de pupario (APF).
4. Para preparar el medio de cultivo para el explante, agregue 5 ml de penicilina-estreptomicina (10,000 U / ml) a 500 ml de Drosophila Medium de Schneider. Filtra el medio y haz alícuotas de 45 mL en tubos cónicos de 50 mL. El medio se puede almacenar a 4 °C durante 1-2 meses.
5. El día de la obtención de imágenes, tome un tubo de 45 ml del medio Drosophila de Schneider y agregue 5 ml de suero fetal bovino (10% v / v), 125 μL de solución madre de insulina humana de 4 mg / ml (concentración final de 10 μg / ml), 50 μL de solución madre de 20 mg / ml de 20-hidroxiecdisona disuelta en etanol (concentración final de 1 μg / ml). Mezcle bien y transfiera 15 ml de medio completo en un nuevo tubo cónico de 50 ml. El resto del medio completo se puede almacenar a 4 °C durante una semana. El suero fetal bovino, la solución madre de insulina humana y la solución madre de 20-hidroxiecdisona se alicitan y almacenan a -20 °C.
6. Oxigenar el medio completo de 15 ml bombeando burbujas de oxígeno desde un cilindro de oxígeno debajo de la superficie del líquido a través de una punta de pipeta estéril de 5 ml a razón de una burbuja / s durante 20-30 min. Use una película de parafina para cubrir la abertura del tubo durante este proceso.
7. Esterilizar la superficie del pozo de disección y la placa Sylgard (con micro pines insertados en la capa Sylgard, preparados en los pasos A1 y A2) con etanol al 70%. Déjalos secar antes de usarlos.

2. Disección de explantes

1. Use un cepillo para transferir 30 h de pupas APF (30 h después de la formación del pupario) a un pañuelo de papel y seque la superficie externa de las pupas durante 5 minutos.
2. Coloque un trozo de cinta adhesiva de doble cara en un portaobjetos de vidrio. Coloque cuidadosamente las pupas secas en la superficie pegajosa de la cinta con el lado dorsal hacia arriba. Presione suavemente las pupas con un cepillo para ayudar a que el lado ventral de las pupas se adhiera bien a la cinta (Figura 3A). No dañe la pupa.
3. Use un par de fórceps para quitar la caja de pupa marrón que cubre el lado dorsal de la cabeza (Figura 3A, B). Inserte una punta afilada de los fórceps entre la caja de pupa marrón y la pupa del lado lateral y rompa cuidadosamente la caja de pupa marrón a través de una línea hasta el extremo posterior de la pupa (Figura 3B, C). Abra la caja de pupa marrón. Use un par de fórceps para sostener suavemente la pupa y transferirla al pozo de disección con 1 ml de medio completo oxigenado. Sumergir la pupa flotante en la superficie media para ayudar a que se hunda hasta el fondo del pozo (Figura 3D).
   NOTA: No inserte la punta de los fórceps demasiado profundamente dentro de la caja de pupa marrón para evitar lesionar la pupa con las pinzas.
4. Para diseccionar el explante antena-cerebro de la pupa, use fórceps para sostener suavemente la pupa con una mano y use un par de microscisoras para cortar un pequeño agujero desde el lado posterior de la pupa con la otra mano (Figura 3E). Este pequeño orificio libera la alta presión dentro de la pupa.
5. Corte a través de la línea media ventral de la pupa desde el orificio hasta el cuello (la estructura estrecha que conecta la cabeza y el tórax) con las microescisoras (Figura 3F). Luego, corte a través de la circunferencia del cuello para separar la cabeza del cuerpo de la pupa (Figura 3G). Retire el cuerpo y colóquelo en un pozo diferente.
   NOTA: No corte el cuello directamente desde el lado dorsal / ventral de la pupa, que puede apretar el cerebro.
6. Cortar la cutícula transparente que cubre el lado dorsal del cerebro (Figura 3H). Esto expondrá el cuerpo gordo en la parte superior del cerebro. Mantenga un poco de cutícula a la que se unen la retina y las antenas. Repita el mismo procedimiento en el lado ventral del cerebro.
   NOTA: No inserte la hoja de las tijeras demasiado profundamente debajo de la cutícula, ya que esto causará la ruptura de los nervios antenales que conectan las antenas y el cerebro (Figura 3H').
7. Use una pipeta P10 para lavar suavemente el cuerpo graso que cubre el cerebro y las antenas mediante el pipeteo del medio hacia las regiones abiertas en los lados dorsal y ventral de la cabeza (Figura 3I).
   NOTA: Sea muy suave al pipetear el medio, ya que el cerebro puede desprenderse fácilmente de la cutícula. Asegúrese de que todo el cuerpo graso se elimine durante este paso. Se observó un desarrollo detenido de los axones ORN cuando el cuerpo graso no se limpió bien, probablemente debido al acceso deficiente al oxígeno del medio.
8. Para estudiar la interacción de los axones ORN bilaterales o axones ORN con la orientación de dendritas PN, corte uno o dos nervios antenales con las microescisoras durante esta etapa⁸ (Figura 3J). Coloque cuidadosamente las cuchillas de las tijeras entre la cutícula y el cerebro y corte los nervios antenales interesados.
9. Para transferir el explante diseccionado a la placa de Sylgard, coloque una gota de medio completo oxigenado (~ 200 μL) en la superficie de Sylgard. Cubra la superficie interna de una punta de pipeta de punta ancha de 200 μL con el cuerpo graso del tronco diseccionado (paso 1.6) pipeteando el cuerpo graso varias veces, lo que evita que los explantes peguen la punta de la pipeta durante la transferencia. Luego, use esta punta de pipeta de punta ancha para transferir el explante del pozo de disección a la gota mediana en la placa de cultivo (Figura 3K).
10. Use fórceps para fijar el explante en la capa de Sylgard en los dos lóbulos ópticos (Figura 3L). Coloque cuidadosamente la placa Sylgard en la estación de imágenes e inmovilice la placa con cintas. Agregue lentamente 10 ml de medio completo oxigenado a la placa Sylgard usando pipeta P1000.
    NOTA: Evite interrumpir el explante al agregar el medio a la placa Sylgard.

3. Imágenes en vivo basadas en microscopía de dos fotones

1. Para realizar imágenes de lapso de tiempo, utilice un microscopio de dos fotones, un láser Ti:Sapphire, un objetivo de inmersión en agua 20x (1.0 NA) y un software de imágenes. Utilice la longitud de onda de excitación a 920 nm para obtener imágenes de proteínas GFP. Ajuste el tiempo de permanencia de píxeles a 10 μs.
2. Ajuste la posición de la estación de imagen para que los explantes estén aproximadamente debajo del objetivo. Use etanol al 70% para esterilizar la lente antes de obtener imágenes. Baje lentamente el objetivo bajo el medio cerca de los explantes. Compruebe si hay alguna burbuja en la lente del objetivo.
   1. Si es así, levanta el objetivo por encima del medio y repite esto hasta que la burbuja se haya ido. Encuentra los explantes usando el ocular y centra un explante en el campo.
3. Para garantizar un explante con unas pocas ORN escasamente etiquetadas para imágenes de lapso de tiempo, diseccione ~ 10 explantes cada vez y alinee en el eje y en la placa de cultivo. Evalúe todos los explantes moviendo el objetivo a lo largo del eje y elija un explante en el que unos pocos axones ORN individuales acaban de llegar al lóbulo antenal para obtener imágenes (Figura 4A).
   1. Reconocer el lóbulo antenal por su forma ovalada y los axones ORN que están empezando a circunnavegarlo. Imagine un área de ~150 μm x 150 μm en el plano xy (zoom 3x con el objetivo 20x). Estimar el límite de los dos lóbulos antenales y centrarlos en el área de imágenes.
4. Seleccione una región de imagen inicial a lo largo del eje z definiendo la sección inferior y la sección superior del escaneo. Configure el área de imágenes a lo largo del eje z. Establezca la sección más profunda con señales de axón ORN como la primera sesión de imágenes y la sesión 100 μm por encima (lado más superficial) como la última sesión de imágenes (Figura 4B).
   NOTA: Esto deja algunas secciones en la parte superior (lado superficial) de los axones ORN y evita el desplazamiento de los axones ORN hacia arriba fuera del área de imágenes debido al crecimiento del cerebro durante el cultivo.
   1. Imagen a intervalos de 2 μm. Configure el escaneo automático de imágenes a la frecuencia de cada 20 minutos utilizando un software de imágenes.
5. Desplace la región de la imagen 20 μm hacia arriba a lo largo del eje z después de las primeras 4 h de imagen y otros 20 μm hacia arriba a lo largo del eje z después de la imagen de 16 h. Esto se puede lograr estableciendo un script y diferentes pilas z en el software de imágenes.
6. Cultive el explante durante un período adicional después de la obtención de imágenes (hasta 24 h ex vivo) antes de la fijación y tinción con N-cadherina, un marcador neuropil, para revelar la identidad genética de cada ORN por el glomérulo al que se dirige.

4. Procesamiento de imágenes

1. Para procesar imágenes de pila z de series de secciones tomadas en cada punto de tiempo utilizando el software Fiji, abra la serie de secciones de imágenes, haga clic en Imagen | Pilas | Proyecto Z [/].
2. Para corregir la deriva lateral de la muestra durante el cultivo, instale turboReg Plugin en Fiji.
   1. Abra una serie de imágenes de pila z y una sola imagen de pila z de la serie. Abrir plugins | | de registro TurboReg.
   2. Seleccione la serie de imágenes de pila z en Origen y la imagen de pila z única en Destino | Traducción. Haga clic en el botón Lote para registrar todas las imágenes de la serie de imágenes de la pila z abierta.
3. Para maximizar la utilidad de las muestras con imágenes, separe los axones individuales escasamente etiquetados en las proximidades entre sí de las imágenes de la pila z siguiendo las secciones de imágenes 3D.
   1. Para extraer axones ORN individuales de unos pocos axones en la misma imagen, abra la serie de secciones de imágenes, haga clic en Plugins | Segmentación | Editor de segmentación [/]. Seleccione la herramienta de pincel y la máscara del axón ORN interesado en la ventana de trabajo del Editor de segmentación utilizando los botones Seleccionar "+" o "-" en cada sección de la imagen.
   2. Haga clic en proceso | Calculadora de imágenes [/]. Seleccione "Imagen X" en la Imagen 1, "Multiplicar" en Operación, "Imagen X. etiquetas" en la Imagen 2, [/]. Esto genera un nuevo archivo de serie de imágenes con el axón interesado solamente. Realice el paso 4.1 para procesar la imagen de la pila z. Repita este paso para todos los puntos de tiempo para generar un archivo de imagen de serie temporal.
4. Para pseudocolorear diferentes axones de la misma imagen, primero realice el paso 4.3 para generar el archivo de imagen de serie temporal de cada axón por separado. Abra los archivos de imagen de series temporales para diferentes axones individuales desde la misma imagen de datos sin procesar. Haga clic en el | de la imagen | de color Fusionar canales. Seleccione diferentes archivos de imagen de series temporales en diferentes canales de color y haga clic en Aceptar.

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Resultados

Los axones ORN llegan al lóbulo antenal entre 18 h y 36 h APF. Luego navegan por el lóbulo antenal, cruzan la línea media e inervan los glomérulos. El video 1 es un video representativo que muestra todo el proceso para varios axones identificables individualmente, tomados a la frecuencia de cada 20 minutos durante 24 h. Antes del registro con TurboReg, los axones exhiben cierta deriva lateral a medida que se desarrolla el cerebro (primera mitad del video). Después del registro, se corrige la deriva ...

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Discusión

El explante de antenas-cerebro de Drosophila conserva la orientación normal del circuito olfativo. Notamos que el desarrollo es 2 veces más lento ex vivo en comparación con in vivo. Se observa que el sistema de explante no retiene el palpo maxilar, que alberga seis tipos de ORN. Para garantizar que el desarrollo normal se recapite ex vivo, se debe evitar el estiramiento de los nervios antenales durante la disección del explante. Durante el cultivo ex vivo, el crecimiento d...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
20-hydroxyecdysone	Sigma	H5142
Chameleon Ti:Sapphire laser	Coherent	Coherent MRU X1
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10082147
Human insulin	Thermo Fisher Scientific	12585014
Imaging software	Prairie
Micro Scissors	World Precision Instruments	501778
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Oxygen cylinder	Praxair	OX M-E
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Schneider’s Drosophila Medium	Thermo Fisher Scientific	21720024
SYLGARD 184 Silicone Elastomer	Thermo Fisher Scientific	NC0162601
Two-photon microscopy	Bruker
water immerse objective (20X)	Zeiss	421452-9800-000