Um sistema de explant para estudos de imagem de lapso de tempo da montagem do circuito olfativo em Drosophila

Resumo

Este protocolo descreve o procedimento de dissecção, condição cultural e imagem ao vivo de um sistema de explant antena-cérebro para o estudo do conjunto do circuito olfativo.

Resumo

~Os neurônios são precisamente interconectados para formar circuitos essenciais para a função adequada do cérebro. O sistema olfativo Drosophila fornece um excelente modelo para investigar esse processo, uma vez que 50 tipos de neurônios receptores olfativos (ORNs) das antenas e palpas maxilares projetam seus axônios a 50 glomeruli identificáveis no lobo antena e formam conexões sinápticas com dendritos de 50 tipos de neurônios de projeção de segunda ordem (PNs). Estudos anteriores se concentraram principalmente na identificação de moléculas importantes que regulam o direcionamento preciso no circuito olfativo usando tecidos fixos. Aqui, um sistema de explant antennae-cérebro que recapitula os principais marcos de desenvolvimento da montagem do circuito olfativo na cultura é descrito. Através da dissecação da cutícula externa e limpeza de corpos de gordura opacos que cobrem o cérebro pupal em desenvolvimento, imagens de alta qualidade de neurônios únicos de cérebros vivos podem ser coletadas usando microscopia de dois fótons. Isso permite imagens de lapso de tempo de um único axônio ORN direcionado a partir de tecido vivo. Essa abordagem ajudará a revelar importantes contextos biológicos celulares e funções de genes importantes previamente identificados e identificar mecanismos que sustentam o processo dinâmico de montagem do circuito.

Introdução

Os neurônios são precisamente interligados para formar circuitos essenciais para a função adequada do cérebro. Por mais de 100 anos, os neurocientistas têm tentado entender como os neuritos se estendem em direção aos seus alvos intermediários e finais com extrema precisão. Como resultado, eles identificaram genes importantes que codificam pistas de orientação para o desenvolvimento de processos neuronais¹. O sistema olfativo Drosophila fornece um excelente modelo para investigar esse processo desde os neurônios receptores olfativos (ORNs, os neurônios sensoriais primários) projetam-se para 50 glomeruli identificáveis com tamanho estereotipado, forma e posição relativa, onde formam conexões sinápticas com dendritos de 50 tipos de neurônios de projeção de segunda ordem (PNs), cada um dos quais envia dendritos para um dos 50 glomeruli² (Figura 1A ). Portanto, é relativamente fácil identificar fenótipos mutantes na resolução sináptica (glomerular) no sistema olfativo de mosca. Isso levou a descobertas de genes importantes que regulam o conjunto do circuito olfativo³.

A montagem do circuito olfativo da mosca conta com processos de desenvolvimento temporal e^{espacialmente} coordenados 3. ORNs e PNs adquirem destinos celulares distintos, que configuram o programa para suas especificidades de fiação. Em seguida, dendritos PN pré-padrão do lóbulo antena (Figura 1B). Os axônios de ORNs então circunavegam o lobo antena ipsilateral e cruzam a linha média do cérebro para alcançar o lobo antena contralateral. Posteriormente, os axônios ORN invadem os lobos ipsi e contralateral das antenas e formam sinapses com dendritos de seus PNs parceiros em glomeruli específico. Este modelo grosseiro para montagem de circuito olfativo foi proposto com base na caracterização de amostras fixas a partir de pontos de tempo intermediários durante o desenvolvimento. A baixa resolução temporal e a incapacidade de seguir os mesmos processos neuronais através do desenvolvimento do tecido fixo limitam a compreensão mecanicista do processo de montagem do circuito.

É tecnicamente desafiador viver os processos orn e PN in vivo, uma vez que o processo de fiação ocorre na primeira metade da fase pupal quando o lobo antena é cercado por corpo de gordura opaco dentro da caixa pupal. É, portanto, impossível imaginar diretamente o circuito olfativo em desenvolvimento a partir de pupas intactas. Tecidos dissecados cultivados ex vivo podem contornar a opacidade tecidual e têm sido usados com sucesso para estudar o desenvolvimento neural ^4,5,6. O desafio de usar uma estratégia de cultura ex vivo ex vivo semelhante para estudar a fiação neuronal no cérebro pupal é se ele recapitula o neurônio preciso direcionado em uma condição cultural. Com base em uma condição de cultura ex vivo relatada anteriormente para o complexo olho-cérebro⁷, uma explanta que contém todo o cérebro pupal, antenas e os nervos antenas de conexão intactos foi recentemente desenvolvido, que retém alvo preciso do circuito olfativo e pode ser submetido a imagens ao vivo baseadas em microscopia de dois fótons por até 24 h na frequência de cada 20 min⁸ . Aqui, um protocolo detalhado da cultura explant e imagem é descrito. O sistema de explant fornece um método poderoso para estudar a montagem de circuito olfativo e, potencialmente, outros circuitos no cérebro central.

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Protocolo

1. Preparação de reagentes

NOTA: Todas as etapas deste protocolo são realizadas à temperatura ambiente (20-25 °C) a menos que explique o contrário.

1. Para preparar a placa de cultura para imobilizar a explantização durante a imagem do lapso de tempo, coloque Sylgard de 0,5 cm de espessura (misture completamente dois componentes líquidos na proporção 10:1 antes do uso) na superfície inferior de uma placa de Petri de 60 mm x 15 mm e deixe curar por 48 h à temperatura ambiente (Figura 2A, referida como placa de Sylgard no texto a seguir).
2. Para preparar micro pinos para imobilizar a explanta nesta placa, use um par de fórceps para colocar vários micro pinos em uma fita com as extremidades afiadas alinhadas de um lado (Figura 2B). Use um par de tesouras para cortar ~2 mm das extremidades afiadas dos micro pinos (Figura 2B'). Use fórceps para segurar os micro pinos cortados e insira na camada Sylgard de uma placa Sylgard pré-fabricada (Figura 2C). Dois micro pinos são usados para imobilizar uma explanta.
3. Use um pincel para coletar pupas brancas, que formam puparium dentro de 1 h, de hsFLP, pebbled-GAL4/+; UAS-FRT^100-stop-FRT 100-mCD8-GFP ⁸ genótipo e transfira-os para novos frascos. Choque térmico no banho de água de 37 °C por 40 minutos para induzir clones orn esparsos de tipos aleatórios. Após o choque térmico, coloque os frascos a 25 °C por 30 h, resultando em pupas envelhecidas a 30 h após a formação de puparium (APF).
4. Para preparar o meio de cultura para explant, adicione 5 mL de Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL) a 500 mL De Drosophila Medium schneider. Filtre o meio e faça alíquotas de 45 mL em tubos cônicos de 50 mL. O meio pode ser armazenado a 4 °C por 1-2 meses.
5. No dia da imagem, pegue um tubo de 45 mL do meio Drosophila de Schneider e adicione 5 mL de Soro Bovino Fetal (10% v/v), 125 μL de 4 mg/mL solução de estoque de insulina humana (10 μg/mL de concentração final), 50 μL de 1 mg/mL 20-hidroxiecdysone solução de estoque dissolvida em etanol (1 μg/mL concentração final). Misture bem e transfira 15 mL de meio completo em um novo tubo cônico de 50 mL. O resto do meio completo pode ser armazenado a 4 °C durante uma semana. O Soro Bovino Fetal, a solução de estoque de insulina humana e a solução de estoque de 20 hidroxyecdysona são aliquos e armazenados a -20 °C.
6. Oxigene o meio completo de 15 mL bombeando bolhas de oxigênio de um cilindro de oxigênio sob a superfície líquida através de uma ponta de pipeta estéril de 5 mL à taxa de uma bolha/s por 20-30 min. Use um filme de parafina para cobrir a abertura do tubo durante este processo.
7. Esterilize a superfície do poço de dissecção e a placa Sylgard (com micro pinos inseridos na camada Sylgard, preparados nas etapas A1 e A2) com 70% de etanol. Deixe-os secar antes de usar.

2. Dissecção de explanta

1. Use uma escova para transferir pupae de 30 h APF (30 h após a formação do puparium) para um tecido de papel e seque a superfície externa da pupae por 5 min.
2. Coloque um pedaço de fita dupla face em um slide de vidro. Conecte cuidadosamente a pupa seca na superfície pegajosa da fita com o lado dorsal voltado para cima. Pressione suavemente a pupa com um pincel para ajudar o lado ventral da pupae a prender bem a fita (Figura 3A). Não danifique a pupa.
3. Use um par de fórceps para remover a caixa pupal marrom que cobre o lado dorsal da cabeça (Figura 3A,B). Insira uma ponta afiada das fórceps entre a caixa de pupal marrom e a pupa do lado lateral e quebre cuidadosamente a caixa de pupal marrom através de uma linha até a extremidade posterior da pupa (Figura 3B,C). Abra a caixa de pupal marrom. Use um par de fórceps para segurar suavemente a pupa e transferir para o poço de dissecção com 1 mL de meio completo oxigenado. Submergir pupa flutuante na superfície média para ajudá-la a afundar até o fundo do poço (Figura 3D).
   NOTA: Não insira a ponta das fórceps muito profundamente dentro da caixa de pupal marrom para evitar ferir a pupa com as fórceps.
4. Para dissecar a explanta antena-cérebro da pupa, use fórceps para segurar suavemente a pupa com uma mão e use um par de microscisores para cortar um pequeno orifício do lado posterior da pupa com a outra mão (Figura 3E). Este pequeno buraco libera a alta pressão dentro da pupa.
5. Corte através da linha média ventral da pupa do orifício até o pescoço (a estrutura estreita que conecta a cabeça e o tórax) com os microscisores (Figura 3F). Em seguida, corte a circunferência do pescoço para desprender a cabeça do corpo da pupa (Figura 3G). Remova o corpo e coloque-o em um poço diferente.
   NOTA: Não corte o pescoço diretamente do lado dorsal/ventral da pupa, que pode espremer o cérebro.
6. Corte a cutícula transparente que cobre o lado dorsal do cérebro (Figura 3H). Isso vai expor o corpo gordo em cima do cérebro. Mantenha alguma cutícula à qual a retina e as antenas se prendem. Repita o mesmo procedimento no lado ventral do cérebro.
   NOTA: Não insira a lâmina da tesoura muito profundamente sob a cutícula, pois isso causará o corte dos nervos antenas que ligam as antenas e o cérebro (Figura 3H').
7. Use uma pipeta P10 para lavar suavemente o corpo de gordura que cobre o cérebro e as antenas, tubos do meio em direção às regiões abertas nas laterais dorsal e ventral da cabeça (Figura 3I).
   NOTA: Seja muito gentil ao escoar o meio, pois o cérebro pode ser facilmente separado da cutícula. Certifique-se de que todo o corpo gordo seja removido durante esta etapa. O desenvolvimento preso de axônios ORN foi observado quando o corpo gordo não foi bem limpo, provavelmente devido ao baixo acesso ao oxigênio do meio.
8. Para estudar a interação de axônios orn bilaterais ou axônios ORN com alvos de dendrite PN, corte um ou dois nervos antenas com os microscisores durante esta fase⁸ (Figura 3J). Coloque cuidadosamente as lâminas da tesoura entre a cutícula e o cérebro e corte os nervos antenas interessados.
9. Para transferir a explanta dissecada para a placa Sylgard, coloque uma gotícula de meio completo oxigenado (~200 μL) na superfície de Sylgard. Cubra a superfície interna de uma ponta de pipeta de ponta larga de 200 μL com o corpo de gordura do tronco dissecado (passo 1.6) ao escoar o corpo de gordura várias vezes, o que impede que as explantas grudem a ponta da pipeta durante a transferência. Em seguida, use esta ponta de pipeta de ponta larga para transferir a explanta da dissecação bem para a gota média na placa de cultura (Figura 3K).
10. Use fórceps para fixar a explanta na camada Sylgard nos dois lóbulos ópticos (Figura 3L). Posicione cuidadosamente a placa Sylgard na estação de imagem e imobilize a placa com fitas. Adicione lentamente 10 mL de meio total oxigenado à placa Sylgard usando pipeta P1000.
    NOTA: Evite interromper a explanta ao adicionar o meio à placa Sylgard.

3. Imagem ao vivo baseada em microscopia de dois fótons

1. Para realizar imagens de lapso de tempo, use um microscópio de dois fótons, um laser Ti:Sapphire, um objetivo de imersão em água de 20x (1.0 NA) e um software de imagem. Use o comprimento de onda de excitação a 920 nm para imagens de proteínas GFP. Ajuste o tempo de moradia do pixel para 10 μs.
2. Ajuste a posição da estação de imagem para que as explanagens estejam aproximadamente sob o objetivo. Use 70% de etanol para esterilizar a lente antes da imagem. Abaixe lentamente o objetivo sob o meio perto das explantas. Verifique se há alguma bolha na lente do objetivo.
   1. Se assim for, levante o objetivo acima do meio e repita isso até que a bolha se vá. Encontre as explantas usando a ocular e central uma explant no campo.
3. Para garantir uma explanta com alguns ORNs pouco rotulados para imagens de lapso de tempo, disseque ~10 explantas cada vez e alinhe no eixo y na placa de cultura. Tela todas as explantas movendo o objetivo ao longo do eixo e escolha uma explanta na qual alguns axônios ORN únicos acabaram de chegar ao lóbulo de antenas para imagem (Figura 4A).
   1. Reconheça o lobo antena pela sua forma oval e os axônios ORN que estão começando a circunavegá-lo. Imagem de uma área de ~150 μm x 150 μm no plano xy (zoom de 3x com o objetivo de 20x). Estimar o limite dos dois lóbulos antenas e centralizar-nos na área de imagem.
4. Selecione uma região de imagem inicial ao longo do eixo z definindo a seção inferior e a seção superior da digitalização. Configure área de imagem ao longo do eixo z. Defina a seção mais profunda com sinais de axônio ORN como a primeira sessão de imagem e a sessão 100 μm acima (lado mais superficial) como a última sessão de imagem (Figura 4B).
   NOTA: Isso deixa algumas seções no topo (lado superficial) dos axônios ORN e evita a mudança de axônios ORN para cima fora da área de imagem devido ao crescimento do cérebro durante a cultura.
   1. Imagem em intervalos de 2 μm. Defina a varredura automática de imagens na frequência de cada 20 minutos usando software de imagem.
5. Deslocar a região de imagem 20 μm para cima ao longo do eixo z após a primeira imagem de 4h e outros 20 μm para cima ao longo do eixo z após 16 h de imagem. Isso pode ser conseguido definindo um script e diferentes pilhas z no software de imagem.
6. Cultura a explante por um período adicional de imagem pós-imagem (até 24 h ex vivo) antes da fixação e coloração com N-cadherin, um marcador neuropil, para revelar a identidade genética de cada ORN pelo glomerulus a que ele visa.

4. Processamento de imagens

1. Para processar z stack imagens de séries de seção tiradas em cada ponto de tempo usando o software Fiji, abra a série de seção de imagens, clique em Imagem | Pilhas | Projeto Z [/].
2. Para corrigir a deriva lateral da amostra durante a cultura, instale o Plugin TurboReg em Fiji.
   1. Abra uma série de imagens de pilha z e uma única imagem de pilha z da série. | de plugins abertos | de inscrição O TurboReg.
   2. Selecione a série de imagens z stack na Fonte e a imagem de pilha de z única em Target | Tradução. Clique no botão Batch para registrar todas as imagens da série de imagens abertas da pilha z.
3. Para maximizar a utilidade das amostras de imagem, separem axônios únicos pouco rotulados nas proximidades das imagens da pilha z seguindo seções de imagem 3D.
   1. Para extrair axônios ORN únicos de alguns axônios na mesma imagem, abra a série de seção de imagem, clique em Plugins | | de segmentação Editor de Segmentação [/]. Selecione a ferramenta de pincel e mascarar o axônio ORN interessado na janela de trabalho do Editor de Segmentação usando botões Select "+" ou "-" em cada seção de imagem.
   2. Clique em Process | Calculadora de imagens [/]. Selecione "Imagem X" na Imagem 1, "Multiplique" em Operação, "Imagem X. labels" na Imagem 2, [/]. Isso gera um novo arquivo de série de imagens apenas com o axônio interessado. Execute a etapa 4.1 para processar a imagem da pilha z. Repita esta etapa para todos os pontos de tempo para gerar um arquivo de imagem de série temporal.
4. Para pseudocolorir diferentes axônios da mesma imagem, primeiro execute o passo 4.3 para gerar o arquivo de imagem da série temporal de cada axônio separadamente. Abra os arquivos de imagem da série temporal para diferentes axônios únicos da mesma imagem de dados brutos. Clique em Imagem | | de cor Mesclar canais. Selecione diferentes arquivos de imagem de séries temporizais em diferentes canais de cores e clique em OK.

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Resultados

Os axônios ORN chegam ao lóbulo das antenas entre 18h e 36 h APF. Eles então navegam pelo lóbulo da antena, cruzam a linha média e inervam o glomeruli. Vídeo 1 é um vídeo representativo mostrando todo o processo para vários axônios individualmente identificáveis, tirados na frequência de cada 20 min por 24 h. Antes do registro usando o TurboReg, os axônios exibem alguns desvios laterais à medida que o cérebro se desenvolve (primeira metade do vídeo). Após o registro, a deriva é corrigid...

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Discussão

A explanta drosophila antennae-cérebro mantém o alvo normal do circuito olfativo. Notamos que o desenvolvimento é 2 vezes mais lento em relação ao in vivo. Nota-se que o sistema de explant não retém palp maxilar, que hospeda seis tipos de ORNs. Para garantir que o desenvolvimento normal seja recapitulado ex vivo, o alongamento dos nervos antenas precisa ser evitado durante a dissecação da explant. Durante a cultura ex vivo , o crescimento das bactérias geralmente cau...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
20-hydroxyecdysone	Sigma	H5142
Chameleon Ti:Sapphire laser	Coherent	Coherent MRU X1
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10082147
Human insulin	Thermo Fisher Scientific	12585014
Imaging software	Prairie
Micro Scissors	World Precision Instruments	501778
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Oxygen cylinder	Praxair	OX M-E
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Schneider’s Drosophila Medium	Thermo Fisher Scientific	21720024
SYLGARD 184 Silicone Elastomer	Thermo Fisher Scientific	NC0162601
Two-photon microscopy	Bruker
water immerse objective (20X)	Zeiss	421452-9800-000