Un sistema di espianto per studi di imaging time-lapse dell'assemblaggio di circuiti olfattivi in Drosophila

Riepilogo

Questo protocollo descrive la procedura di dissezione, le condizioni di coltura e l'imaging dal vivo di un sistema di espianto antenna-cervello per lo studio dell'assemblaggio del circuito olfattivo.

Abstract

I neuroni sono precisamente interconnessi per formare circuiti essenziali per il corretto funzionamento del cervello. Il sistema olfattivo Drosophila fornisce un modello eccellente per studiare questo processo poiché 50 tipi di neuroni recettori olfattivi (ORN) dalle antenne e palpi mascellari proiettano i loro assoni a 50 glomeruli identificabili nel lobo antennale e formano connessioni sinaptiche con dendriti da 50 tipi di neuroni di proiezione del secondo ordine (PN). Studi precedenti si sono concentrati principalmente sull'identificazione di molecole importanti che regolano il targeting preciso nel circuito olfattivo utilizzando tessuti fissi. Qui, viene descritto un sistema di espianto antenna-cervello che ricapitola le principali pietre miliari dello sviluppo dell'assemblaggio del circuito olfattivo in coltura. Attraverso la dissezione della cuticola esterna e la pulizia di corpi adiposi opachi che coprono il cervello pupale in via di sviluppo, immagini di alta qualità di singoli neuroni da cervelli vivi possono essere raccolte utilizzando la microscopia a due fotoni. Ciò consente l'imaging time-lapse di un singolo assone ORN mirato da tessuto vivo. Questo approccio aiuterà a rivelare importanti contesti e funzioni biologiche cellulari di geni importanti precedentemente identificati e identificare i meccanismi alla base del processo dinamico di assemblaggio del circuito.

Introduzione

I neuroni sono precisamente interconnessi per formare circuiti essenziali per il corretto funzionamento del cervello. Per oltre 100 anni, i neuroscienziati hanno cercato di capire come i neuriti si estendono verso i loro obiettivi intermedi e finali con estrema precisione. Di conseguenza, hanno identificato geni importanti che codificano segnali di guida per lo sviluppo di processi neuronali¹. Il sistema olfattivo Drosophila fornisce un modello eccellente per indagare questo processo poiché i neuroni recettori olfattivi (ORN, i neuroni sensoriali primari) proiettano a 50 glomeruli identificabili con dimensioni, forma e posizione relativa stereotipate, dove formano connessioni sinaptiche con dendriti da 50 tipi di neuroni di proiezione (PN) di secondo ordine), ognuno dei quali invia dendriti a uno dei 50 glomeruli² (Figura 1A ). Pertanto, è relativamente facile identificare fenotipi mutanti a risoluzione sinaptica (glomerulare) nel sistema olfattivo della mosca. Ciò ha portato alla scoperta di importanti geni che regolano l'assemblaggio del circuito olfattivo³.

L'assemblaggio del circuito olfattivo della mosca si basa su processi di sviluppo temporalmente e spazialmente coordinati³. ORN e PN acquisiscono destini cellulari distinti, che impostano il programma per le loro specificità di cablaggio. Successivamente, i dendriti PN prepatterano il lobo antennale (Figura 1B). Gli assoni degli ORN circumnavigano quindi il lobo antennale ipsilaterale e attraversano la linea mediana del cervello per raggiungere il lobo antennale controlaterale. Successivamente, gli assoni ORN invadono sia i lobi antennali ipsi- che controlaterali e formano sinapsi con dendriti dei loro PT partner in glomeruli specifici. Questo modello grossolano per l'assemblaggio di circuiti olfattivi è stato proposto sulla base della caratterizzazione di campioni fissi da punti temporali intermedi durante lo sviluppo. La scarsa risoluzione temporale e l'incapacità di seguire gli stessi processi neuronali attraverso lo sviluppo da tessuto fisso limitano la comprensione meccanicistica del processo di assemblaggio del circuito.

È tecnicamente difficile vivere i processi ORN e PN in vivo poiché il processo di cablaggio avviene nella prima metà dello stadio pupale quando il lobo antennale è circondato da un corpo grasso opaco all'interno della custodia pupale. È quindi impossibile visualizzare direttamente il circuito olfattivo in via di sviluppo da pupe intatte. I tessuti sezionati coltivati ex vivo possono aggirare l'opacità tissutale e sono stati utilizzati con successo per studiare lo sviluppo neurale ^4,5,6. La sfida di utilizzare una simile strategia di coltura di espianto ex vivo per studiare il cablaggio neuronale nel cervello pupale è se ricapitola il targeting preciso del neurone in una condizione di coltura. Sulla base di una condizione di coltura ex vivo precedentemente riportata per il complesso occhio-cervello della mosca⁷, è stato recentemente sviluppato un espianto che contiene intatto l'intero cervello pupale, le antenne e i nervi antennali di collegamento, che mantiene un targeting preciso del circuito olfattivo e può essere sottoposto a imaging dal vivo basato su microscopia a due fotoni per un massimo di 24 ore alla frequenza di ogni 20 min⁸ . Qui viene descritto un protocollo dettagliato della coltura e dell'imaging di espianto. Il sistema di espianto fornisce un metodo potente per studiare l'assemblaggio del circuito olfattivo e potenzialmente altri circuiti nel cervello centrale.

Protocollo

1. Preparazione dei reagenti

NOTA: Tutte le fasi di questo protocollo vengono eseguite a temperatura ambiente (20-25 °C) se non diversamente specificato.

1. Per preparare il piatto di coltura per immobilizzare l'espianto durante l'imaging time lapse, posare Sylgard di 0,5 cm di spessore (mescolare accuratamente due componenti liquidi con un rapporto 10: 1 prima dell'uso) sulla superficie inferiore di una capsula di Petri da 60 mm x 15 mm e lasciarla polimerizzare per 48 ore a temperatura ambiente (Figura 2A, denominata piastra Sylgard nel testo seguente).
2. Per preparare micro pin per immobilizzare l'espianto su questa piastra, utilizzare un paio di pin per incollare più micro pin su un nastro con le estremità affilate allineate su un lato (Figura 2B). Utilizzare un paio di forbici per tagliare ~ 2 mm dalle estremità affilate dei micro perni (Figura 2B '). Utilizzare una pinza per tenere i micro perni tagliati e inserirli nello strato Sylgard di una piastra Sylgard prefabbricata (Figura 2C). Due micro pin vengono utilizzati per immobilizzare un espianto.
3. Utilizzare un pennello per raccogliere pupe bianche, che formano puparium entro 1 ora, di hsFLP, ciottolato-GAL4/+; UAS-FRT^100-stop-FRT 100-mCD8-GFP ⁸ genotipo e trasferirli in nuove fiale. Shock termico a bagnomaria a 37 °C per 40 minuti per indurre cloni ORN sparsi da tipi casuali. Dopo lo shock termico, mettere i flaconcini a 25 °C per 30 ore, con conseguente invecchiamento delle pupe a 30 ore dopo la formazione del pupario (APF).
4. Per preparare il terreno di coltura per l'espianto, aggiungere 5 ml di penicillina-streptomicina (10.000 U/mL) a 500 ml di Drosophila Medium di Schneider. Filtrare il mezzo e fare aliquote da 45 mL in tubi conici da 50 mL. Il mezzo può essere conservato a 4 °C per 1-2 mesi.
5. Il giorno dell'imaging, prelevare un tubo da 45 mL di Drosophila medium di Schneider e aggiungere 5 mL di siero bovino fetale (10% v/v), 125 μL di soluzione madre di insulina umana da 4 mg/mL (concentrazione finale di 10 μg/mL), 50 μL di 1 mg/mL di soluzione madre di 20-idrossiecdisone disciolta in etanolo (concentrazione finale di 1 μg/mL). Mescolare bene e trasferire 15 mL di mezzo pieno in un nuovo tubo conico da 50 mL. Il resto del mezzo completo può essere conservato a 4 °C per una settimana. Il siero bovino fetale, la soluzione madre di insulina umana e la soluzione madre di 20-idrossiecdisone vengono aliquotati e conservati a -20 °C.
6. Ossigenare il mezzo pieno da 15 mL pompando bolle di ossigeno da una bombola di ossigeno sotto la superficie del liquido attraverso una punta di pipetta sterile da 5 mL alla velocità di una bolla / e per 20-30 minuti. Utilizzare un film di paraffina per coprire l'apertura del tubo durante questo processo.
7. Sterilizzare la superficie del pozzo di dissezione e la piastra Sylgard (con micro perni inseriti sullo strato Sylgard, preparati nei passaggi A1 e A2) con il 70% di etanolo. Lasciarli asciugare prima dell'uso.

2. Dissezione dell'impianto

1. Utilizzare un pennello per trasferire 30 ore di APF (30 ore dopo la formazione della puparium) pupe su un fazzoletto di carta e asciugare la superficie esterna delle pupe per 5 minuti.
2. Metti un pezzo di nastro biadesivo su una diapositiva di vetro. Attaccare con cura le pupe essiccate sulla superficie appiccicosa del nastro con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Premere delicatamente le pupe con un pennello per aiutare il lato ventrale delle pupe ad attaccarsi bene al nastro (Figura 3A). Non danneggiare la pupa.
3. Utilizzare un paio di pinze per rimuovere la custodia pupale marrone che copre il lato dorsale della testa (Figura 3A, B). Inserire una punta affilata della pinza tra la cassa pupale marrone e la pupa dal lato laterale e rompere con cura la cassa pupale marrone attraverso una linea fino all'estremità posteriore della pupa (Figura 3B, C). Apri la custodia pupale marrone. Utilizzare un paio di pinze per tenere delicatamente la pupa e trasferirla al pozzo di dissezione con 1 mL di mezzo pieno ossigenato. Immergere la pupa galleggiante sulla superficie media per aiutarla ad affondare sul fondo del pozzo (Figura 3D).
   NOTA: Non inserire la punta della pinza troppo in profondità all'interno della custodia pupale marrone per evitare di ferire la pupa con la pinza.
4. Per sezionare l'espianto antenna-cervello dalla pupa, utilizzare una pinza per tenere delicatamente la pupa con una mano e utilizzare un paio di microscissori per tagliare un piccolo foro dal lato posteriore della pupa con l'altra mano (Figura 3E). Questo piccolo foro rilascia l'alta pressione all'interno della pupa.
5. Tagliare la linea mediana ventrale della pupa dal foro fino al collo (la struttura stretta che collega la testa e il torace) con i microscissori (Figura 3F). Quindi, tagliare la circonferenza del collo per staccare la testa dal corpo della pupa (Figura 3G). Rimuovere il corpo e metterlo in un pozzo diverso.
   NOTA: Non tagliare il collo direttamente dal lato dorsale/ventrale della pupa, che potrebbe spremere il cervello.
6. Tagliare la cuticola trasparente che copre il lato dorsale del cervello (Figura 3H). Questo esporrà il corpo grasso sulla parte superiore del cervello. Tenere una cuticola a cui si attaccano la retina e le antenne. Ripeti la stessa procedura sul lato ventrale del cervello.
   NOTA: Non inserire la lama delle forbici troppo in profondità sotto la cuticola in quanto ciò causerà il taglio dei nervi antennali che collegano le antenne e il cervello (Figura 3H').
7. Utilizzare una pipetta P10 per lavare delicatamente il corpo grasso che copre il cervello e le antenne pipettando il mezzo verso le regioni aperte sui lati dorsale e ventrale della testa (Figura 3I).
   NOTA: Sii molto delicato quando tubi il mezzo poiché il cervello può essere facilmente staccato dalla cuticola. Assicurati che tutto il corpo grasso venga rimosso durante questo passaggio. Lo sviluppo arrestato di assoni ORN è stato osservato quando il corpo grasso non è stato pulito bene, probabilmente a causa dello scarso accesso all'ossigeno dal mezzo.
8. Per studiare l'interazione degli assoni ORN bilaterali o degli assoni ORN con il targeting della dendrite PN, recidere uno o due nervi antennali con i microscissori durante questa fase⁸ (Figura 3J). Posizionare con attenzione le lame delle forbici tra la cuticola e il cervello e tagliare i nervi antennali interessati.
9. Per trasferire l'espianto sezionato sulla piastra Sylgard, posizionare una goccia di mezzo pieno ossigenato (~ 200 μL) sulla superficie di Sylgard. Rivestire la superficie interna di una punta di pipetta a punta larga 200 μL con il corpo grasso dal tronco sezionato (passaggio 1.6) pipettando più volte il corpo grasso, il che impedisce agli espianti di attaccare la punta della pipetta durante il trasferimento. Quindi, utilizzare questa punta della pipetta a punta larga per trasferire l'espianto dal pozzo di dissezione alla goccia media sulla piastra di coltura (Figura 3K).
10. Utilizzare una pinza per fissare l'espianto sullo strato sylgard nei due lobi ottici (Figura 3L). Posizionare con attenzione la piastra Sylgard sulla stazione di imaging e immobilizzare la piastra con dei nastri. Aggiungere lentamente 10 mL di mezzo pieno ossigenato alla piastra Sylgard utilizzando la pipetta P1000.
    NOTA: Evitare di interrompere l'espianto quando si aggiunge il mezzo alla piastra Sylgard.

3. Imaging dal vivo basato sulla microscopia a due fotoni

1. Per eseguire l'imaging time-lapse, utilizzare un microscopio a due fotoni, un laser Ti:Sapphire, un obiettivo ad immersione in acqua 20x (1,0 NA) e un software di imaging. Utilizzare la lunghezza d'onda di eccitazione a 920 nm per l'imaging delle proteine GFP. Regolare il tempo di permanenza dei pixel a 10 μs.
2. Regolare la posizione della stazione di imaging in modo che gli espianti siano approssimativamente al di sotto dell'obiettivo. Utilizzare il 70% di etanolo per sterilizzare la lente prima dell'imaging. Abbassare lentamente l'obiettivo sotto il mezzo vicino agli espianti. Controlla se c'è qualche bolla sulla lente dell'obiettivo.
   1. In tal caso, sollevare l'obiettivo sopra il mezzo e ripetere fino a quando la bolla non è sparita. Trova gli espianti usando l'oculare e centra un espianto sul campo.
3. Per garantire un espianto con pochi ORN scarsamente etichettati per l'imaging time lapse, sezionare ~ 10 espianti ogni volta e allineare sull'asse y sulla piastra di coltura. Esaminare tutti gli espianti spostando l'obiettivo lungo l'asse y e scegliere un espianto in cui alcuni singoli assoni ORN hanno appena raggiunto il lobo antennale per l'imaging (Figura 4A).
   1. Riconosci il lobo antennale dalla sua forma ovale e dagli assoni ORN che stanno iniziando a circumnavigarlo. Immagine di un'area ~ 150 μm x 150 μm nel piano xy (zoom 3x con l'obiettivo 20x). Stimare il confine dei due lobi antennali e centrarli nell'area di imaging.
4. Selezionare un'area di imaging iniziale lungo l'asse z definendo la sezione inferiore e la sezione superiore della scansione. Impostare l'area di imaging lungo l'asse z. Impostare la sezione più profonda con segnali assonali ORN come prima sessione di imaging e la sessione 100 μm sopra (lato più superficiale) come ultima sessione di imaging (Figura 4B).
   NOTA: Questo lascia alcune sezioni sulla parte superiore (lato superficiale) degli assoni ORN ed evita lo spostamento degli assoni ORN verso l'alto al di fuori dell'area di imaging a causa della crescita del cervello durante la coltura.
   1. Immagine a intervalli di 2 μm. Imposta la scansione automatica delle immagini alla frequenza di ogni 20 minuti utilizzando il software di imaging.
5. Spostare la regione di imaging di 20 μm verso l'alto lungo l'asse z dopo la prima imaging di 4 ore e altri 20 μm verso l'alto lungo l'asse z dopo l'imaging di 16 ore. Ciò può essere ottenuto impostando uno script e diversi stack z nel software di imaging.
6. Coltivare l'espianto per un ulteriore periodo dopo l'imaging (fino a 24 ore ex vivo) prima della fissazione e della colorazione con N-caderina, un marcatore neuropil, per rivelare l'identità genetica di ogni singolo ORN dal glomerulo a cui si rivolge.

4. Elaborazione delle immagini

1. Per elaborare le immagini z stack da serie di sezioni scattate in ogni punto temporale utilizzando il software Fiji, aprire la serie di sezioni di immagini, fare clic su Immagine | Stack | Progetto Z [/].
2. Per correggere la deriva laterale del campione durante la coltura, installare TurboReg Plugin nelle Figi.
   1. Aprire una serie di immagini dello stack z e una singola immagine dello stack z della serie. Apri plugin | | di registrazione TurboReg.
   2. Selezionare la serie di immagini dello stack z in Source e l'immagine dello stack z singolo in Target | Traduzione. Fare clic sul pulsante Batch per registrare tutte le immagini della serie di immagini z stack aperta.
3. Per massimizzare l'utilità dei campioni ripresi, separare i singoli assoni scarsamente etichettati nelle vicinanze l'uno all'altro dalle immagini dello stack z seguendo le sezioni di immagini 3D.
   1. Per estrarre singoli assoni ORN da alcuni assoni nella stessa immagine, apri la serie di sezioni immagine, fai clic su Plugin | segmentazione | Editor di segmentazione [/]. Selezionare lo strumento pennello e mascherare l'assone ORN interessato nella finestra di lavoro dell'Editor di segmentazione utilizzando i pulsanti Seleziona "+" o "-" in ogni sezione dell'immagine.
   2. Fare clic su | processo Calcolatore di immagini [/]. Selezionare "Immagine X" nell'Immagine 1, "Moltiplica" in Operazione, "Immagine X. etichette" nell'Immagine 2, [/]. Questo genera un nuovo file di serie di immagini con solo l'assone interessato. Eseguire il passaggio 4.1 per elaborare l'immagine dello stack z. Ripetere questo passaggio per tutti i punti temporali per generare un file di immagine serie temporali.
4. Per pseudocolorare assoni diversi dalla stessa immagine, eseguire innanzitutto il passaggio 4.3 per generare separatamente il file di immagine della serie temporale di ciascun assone. Aprire i file di immagine della serie temporale per diversi assoni singoli dalla stessa immagine di dati non elaborati. Clicca su Immagine | | colore Unisci canali. Selezionare diversi file di immagine di serie temporali in diversi canali di colore e fare clic su OK.

Risultati

Gli assoni ORN arrivano al lobo antennale tra 18 h e 36 h APF. Quindi navigano nel lobo dell'antenna, attraversano la linea mediana e innervano i glomeruli. Il video 1 è un video rappresentativo che mostra l'intero processo per diversi assoni identificabili individualmente, preso alla frequenza di ogni 20 minuti per 24 ore. Prima della registrazione con TurboReg, gli assoni mostrano una deriva laterale mentre il cervello si sviluppa (prima metà del video). Dopo la registrazione, la deriva viene corrett...

Discussione

L'espianto cervello delle antenne della Drosophila mantiene il normale targeting del circuito olfattivo. Abbiamo notato che lo sviluppo è 2 volte più lento ex vivo rispetto a in vivo. Si noti che il sistema di espianto non mantiene il palpo mascellare, che ospita sei tipi di ORN. Per garantire che lo sviluppo normale sia ricapitolato ex vivo, è necessario evitare lo stiramento dei nervi antennali durante la dissezione dell'impianto. Durante la coltura ex vivo la crescita ba...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
20-hydroxyecdysone	Sigma	H5142
Chameleon Ti:Sapphire laser	Coherent	Coherent MRU X1
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10082147
Human insulin	Thermo Fisher Scientific	12585014
Imaging software	Prairie
Micro Scissors	World Precision Instruments	501778
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Oxygen cylinder	Praxair	OX M-E
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Schneider’s Drosophila Medium	Thermo Fisher Scientific	21720024
SYLGARD 184 Silicone Elastomer	Thermo Fisher Scientific	NC0162601
Two-photon microscopy	Bruker
water immerse objective (20X)	Zeiss	421452-9800-000