ショウジョウバエの嗅覚回路アセンブリのタイムラプスイメージング研究のための外植システム

要約

このプロトコルは、嗅覚回路アセンブリの研究のためのアンテナ - 脳外植システムの解剖手順、培養状態、およびライブイメージングを記述する。

要約

〜ニューロンは正確に相互接続され、脳の適切な機能に不可欠な回路を形成します。 ショウジョウバエ の嗅覚系は、触角および上顎触診からの50種類の嗅覚受容体ニューロン(ORN)が軸索を触角葉の50個の識別可能な糸球体に投影し、50種類の二次突起ニューロン(PN)からの樹状突起とのシナプス接続を形成するため、このプロセスを調査するための優れたモデルを提供する。これまでの研究では、主に、固定組織を用いて嗅覚回路における正確な標的化を調節する重要な分子を同定することに焦点を当てていた。ここでは、培養における嗅覚回路アセンブリの重要な発達マイルストーンを反復するアンテナ脳外植システムについて説明する。外側のキューティクルを解剖し、発達中の蛹の脳を覆っている不透明な脂肪体を洗浄することで、生きた脳からの単一のニューロンの高品質の画像を2光子顕微鏡で収集することができます。これにより、生組織からの単一のORN軸索ターゲティングのタイムラプス画像化が可能になる。このアプローチは、以前に同定された重要な遺伝子の重要な細胞生物学的背景と機能を明らかにし、回路アセンブリの動的プロセスを支えるメカニズムを特定するのに役立ちます。

概要

ニューロンは正確に相互接続され、脳の適切な機能に不可欠な回路を形成します。100年以上にわたり、神経科学者は、神経突起が中間および最終標的に向かって非常に正確にどのように拡張するかを理解しようとしてきました。その結果、彼らはニューロンプロセスを発達させるためのガイダンス手がかりをコードする重要な遺伝子を同定した¹。 ショウジョウバエ の嗅覚系は、嗅覚受容体ニューロン(ORN、一次感覚ニューロン)がステレオタイプなサイズ、形状、相対位置を持つ50個の識別可能な糸球体に投影し、50種類の2次突起ニューロン(PN)の樹状突起とシナプス結合を形成し、それぞれが樹状突起を50個の糸球体² の1つに送信するため、このプロセスを調査するための優れたモデルを提供します(図1A).したがって、フライ嗅覚系におけるシナプス(糸球体)分解能で変異表現型を同定することは比較的容易である。これにより、嗅覚回路アセンブリ³を調節する重要な遺伝子の発見につながった。

フライ嗅覚回路の組み立ては、時間的および空間的に調整された発生プロセス^{に依存する3}。ORNとPNは、配線の特異性のためにプログラムを設定する別個のセル運命を獲得します。次に、PNデンドライトが触角ローブを予めパターン化する(図1B)。その後、ORNの軸索は同側触角葉を周回し、脳の正中線を横切って対側触角葉に到達する。続いて、ORN軸索は、イプシ側および対側触角葉の両方に侵入し、特定の糸球体におけるパートナーPNの樹状突起とシナプスを形成する。嗅覚回路アセンブリのためのこの粗いモデルは、開発中の中間時点からの固定サンプルの特性評価に基づいて提案された。時間分解能が低く、固定組織からの発生全体にわたって同じニューロンプロセスに従うことができないため、回路アセンブリプロセスの機構的理解が制限されます。

蛹のケース内で触角葉が不透明な脂肪体に囲まれている場合、配線プロセスは蛹期の前半に起こるため、生体内で生きている画像ORNおよびPNプロセスを行うことは技術的に困難です。したがって、無傷の蛹から発達中の嗅覚回路を直接画像化することは不可能である。エクスビボで培養された解剖された組織は、組織の不透明度を回避することができ、神経発達の研究に首尾よく使用されている⁴、^5、6。同様のエクスビボ外植体培養戦略を使用して、蛹脳内のニューロン配線を研究することの課題は、それが培養条件下で標的化される正確なニューロンを反復するかどうかである。フライアイ-脳複合体⁷の既報のエクスビボ培養条件に基づいて、蛹脳全体、アンテナ、および接続する触角神経をそのまま含む外植体が最近開発され、嗅覚回路の正確な標的を保持し、20分ごとの頻度で最大24時間の2光子顕微鏡ベースのライブイメージングに供することができる⁸.ここでは、外植体培養および画像化の詳細なプロトコールが説明される。外植システムは、中枢脳における嗅覚回路および潜在的に他の回路の集合を研究するための強力な方法を提供する。

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プロトコル

1. 試薬の調製

メモ: このプロトコルのすべての手順は、特に説明がない限り、室温 (20 ~ 25 °C) で実行されます。

1. タイムラプスイメージング中に外植体を固定化するための培養皿を準備するために、厚さ0.5cmのシルガード(使用前に2つの液体成分を10:1の比率で十分に混合する)を60mm×15mmのシャーレの底面に敷き詰め、室温で48時間硬化させる(図2A、以下のテキストではシルガードプレートと呼ぶ)。
2. このプレートに外植体を固定するためのマイクロピンを準備するには、一対の鉗子を使用して、鋭利な端を片側に揃えたテープに複数のマイクロピンを貼り付けます(図2B)。一対のはさみを使用して、マイクロピンの鋭い端から約2mmを切り取ります(図2B ́)。鉗子を使用して切断したマイクロピンを保持し、既製のシルガードプレートのシルガード層に挿入します(図2C)。2つのマイクロピンを使用して、1つの外植体を固定化します。
3. ブラシを使用して、hsFLP、小石-GAL4 / +の1時間以内に蛹を形成する白い蛹を収集します。UAS-FRT 100-stop-FRT 100-mCD8-GFP ⁸遺伝子型およびそれらを新しいバイアルに移す。37°Cの水浴中で40分間のヒートショックにより、ランダム型からまばらなORNクローンを誘導した。ヒートショック後、バイアル瓶を25°Cで30時間入れ、蛹形成後30時間で熟成させた蛹(APF)を生じた。
4. 外植用培養液を調製するには、500mLのシュナイダーショウ ジョウバエ 培地に5mLのペニシリン-ストレプトマイシン(10,000U/mL)を加える。培地をろ過し、50 mLの円錐形チューブに45 mLのアリコートを作ります。培地は、4°Cで1〜2ヶ月間保存することができる。
5. イメージング当日、シュナイダーの ショウジョウバエ 培地45 mLのチューブを1本取り、5 mLのウシ胎児血清(10% v/v)、125 μLの4 mg/mLヒトインスリンストック溶液(10 μg/mL最終濃度)、50 μLの1 mg/mLエタノールに溶解した20-ヒドロキシエクジソンストック溶液(最終濃度1 μg/mL)を加える。よく混ぜ合わせ、15 mL のフル培地を新しい 50 mL の円錐形チューブに移します。残りのフル培地は、4°Cで1週間保存することができます。ウシ胎児血清、ヒトインスリンストック溶液および20−ヒドロキシエクジソンストック溶液を分取し、−20°Cで保存した。
6. 液面下の酸素ボンベから滅菌した5 mLピペットチップを通して酸素気泡を1 bubble/sの速度で20〜30分間ポンピングすることによって、15 mLのフル培地を酸素化します。このプロセス中にチューブの開口部を覆うためにパラフィンフィルムを使用してください。
7. 解剖ウェル表面およびシルガードプレート(シルガード層にマイクロピンを挿入し、ステップA1およびA2で調製)を70%エタノールで滅菌する。使用前に乾かしてください。

2. エクスプラント解剖

1. ブラシを使用して、30時間APF(蛹形成後30時間)の蛹を紙の組織に移し、蛹の外表面を5分間乾燥させる。
2. 両面テープをスライドガラスの上に置きます。乾燥した蛹を背側を上に向けてテープの粘着性のある面に慎重に取り付けます。蛹をブラシで軽く押して、蛹の腹側がテープにしっかりと付着するようにします(図3A)。蛹を傷つけないでください。
3. 一対の鉗子を使用して、頭部の背側を覆う茶色の蛹のケースを取り除きます(図3A、B)。茶色の蛹のケースと蛹の間に鉗子の鋭い先端を横から挿入し、茶色の蛹のケースを蛹の後端までの線を通して慎重に壊します(図3B、C)。茶色の蛹のケースを開けます。一対の鉗子を使用して蛹を優しく保持し、1mLの酸素化された完全培地でよく解剖する。浮遊する蛹を中程度の表面に沈めて、井戸の底に沈めるのを助けます(図3D)。
   注:鉗子で蛹を傷つけるのを防ぐために、茶色の蛹のケースの中に鉗子の先端を深く挿入しすぎないでください。
4. 蛹からアンテナ脳外植体を解剖するには、鉗子を使用して片手で蛹を優しく保持し、もう一方の手で蛹の後側から小さな穴を切るために一対のマイクロハサミを使用します(図3E)。この小さな穴は、蛹内の高圧を解放します。
5. 蛹の腹側正中線を穴から頸部(頭部と胸郭をつなぐ狭い構造)までミクロはさみで切り込みます(図3F)。次に、頸部の周囲を切り裂き、頭部を蛹の体から剥離する(図3G)。体を取り外し、別の井戸に入れます。
   注:脳を圧迫する可能性のある蛹の背側/腹側から直接首を切らないでください。
6. 脳の背側を覆う透明なキューティクルを切ります(図3H)。これは、脳の上に脂肪体を露出させます.網膜とアンテナが取り付けられるキューティクルを保管してください。脳の腹側に同じ手順を繰り返します.
   メモ:はさみの刃をキューティクルの下に深く差し込みすぎると、アンテナと脳をつなぐ触角神経が切断されますので、挿入しないでください(図3H')。
7. P10ピペットを使用して、頭部の背側と腹側の開放領域に向かって培地をピペッティングすることにより、脳とアンテナを覆う脂肪体を優しく洗い流します(図3I)。
   注:脳をキューティクルから簡単に切り離すことができるので、培地をピペッティングするときは非常に穏やかにしてください。このステップ中にすべての脂肪体が除去されていることを確認してください。ORN軸索の発達の停止は、脂肪体がよく洗浄されなかったときに観察されたが、これはおそらく培地からの酸素アクセスが悪いためである。
8. 両側ORN軸索またはORN軸索とPN樹状突起標的との相互作用を研究するために、この段階で1つまたは2つの触角神経をマイクロハサミで切断する⁸ (図3J)。はさみの刃をキューティクルと脳の間に慎重に置き、関心のある触角神経を切断します。
9. 解剖した外植体をシルガードプレートに移すには、酸素化された完全培地(〜200μL)の液滴をシルガード表面に置きます。幅200 μLのチップピペットチップの内面を、脂肪体を数回ピペッティングして、解剖した幹からの脂肪体でコーティングし(ステップ1.6)、移送中に外植体がピペットチップに付着するのを防ぎます。次に、この幅の広いチップピペットチップを使用して、エクスプラントを解剖ウェルから培養プレート上の培地液滴に移す(図3K)。
10. 鉗子を使用して、外植体を2つの光学ローブのシルガード層に固定します(図3L)。シルガードプレートをイメージングステーションに慎重に置き、テープでプレートを固定します。P1000ピペットを使用して、酸素化フル培地10mLをシルガードプレートにゆっくりと加えます。
    注:シルガードプレートに培地を添加するときは、外植体を混乱させないでください。

3. 2光子顕微鏡によるライブイメージング

1. タイムラプスイメージングを実行するには、2光子顕微鏡、Ti:サファイアレーザー、20倍の水浸対物レンズ(1.0 NA)、およびイメージングソフトウェアを使用します。GFP タンパク質のイメージングには、920 nm の励起波長を使用します。ピクセルの滞留時間を10μsに調整します。
2. 外植体がほぼ対物レンズの下になるようにイメージングステーションの位置を調整します。イメージング前にレンズを滅菌するために70%エタノールを使用してください。外植体に近い培地の下で目標をゆっくりと下げます。対物レンズに気泡がないか確認してください。
   1. その場合は、目標を媒体の上に持ち上げ、バブルがなくなるまでこれを繰り返します。接眼レンズを使用して外植体を見つけ、フィールド内の1つの外植体の中心に配置します。
3. タイムラプスイメージング用にまばらにラベル付けされたいくつかのORNを有する外植体を確実にするために、毎回〜10個の外植体を解剖し、培養プレート上のy軸上に位置合わせする。Y軸に沿って対物レンズを動かしてすべての外植体をスクリーニングし、いくつかの単一のORN軸索がイメージングのために触角葉に到達したばかりの外植体を選択します(図4A)。
   1. 触角葉は、その楕円形と、それを一周し始めているORN軸索によって認識する。xy 平面内の約 150 μm x 150 μm の領域を画像化します (20 倍の対物レンズで 3 倍ズーム)。2つの触角ローブの境界を推定し、それらを撮像領域の中心に配置する。
4. スキャンの下部セクションと上部セクションを定義して、z 軸に沿った初期イメージング領域を選択します。Z軸に沿ってイメージング領域を設定します。ORN軸索信号を有する最深部を最初のイメージングセッションとして設定し、セッションを100μm上(より表面側)を最後のイメージングセッションとして設定します(図4B)。
   注:これにより、ORN軸索の上部(表層側)にいくつかの切片が残り、培養中の脳の成長によるORN軸索の画像領域外への上方へのシフトが回避される。
   1. 2μm間隔での画像。イメージングソフトウェアを使用して、20分ごとの周波数で自動イメージングスキャンを設定します。
5. 最初の4時間の撮像後に、撮像領域をz軸に沿って20μm上方に、16時間撮像後にz軸に沿って別の20μm上方にシフトする。これは、イメージングソフトウェアでスクリプトと異なるzスタックを設定することによって実現できます。
6. 固定前に外植体を画像化後(最大24時間 エクスビボ)のさらなる期間培養し、ニューロピルマーカーであるN−カドヘリンで染色し、糸球体による各単一ORNの遺伝的同一性を明らかにすることを標的とする。

4. 画像処理

1. フィジーのソフトウェアを使用して各時点で撮影されたセクションシリーズのzスタック画像を処理するには、画像セクションシリーズを開き、[ 画像]|スタック|Z プロジェクト [/]。
2. 培養中のサンプルの横方向のドリフトを修正するには、フィジーに TurboRegプラグイン をインストールします。
   1. Z スタック イメージ シリーズと、そのシリーズから 1 つの z スタック イメージを開きます。 プラグインを開く |参加登録|ターボレッグ。
   2. 「ソース」で z スタック・イメージ系列を選択し、「ターゲット・イメージ」で単一の z スタック・イメージを選択|翻訳。バッチボタンをクリックして、開いたzスタック画像シリーズからすべての画像を登録します。
3. 画像化されたサンプルの有用性を最大限に引き出すために、3D画像セクションに続くzスタック画像から、互いに近傍のまばらにラベル付けされた単一の軸索を分離する。
   1. 同じ画像内のいくつかの軸索から単一のORN軸索を抽出するには、画像セクションシリーズを開き、[プラグイン]|セグメンテーション|セグメンテーションエディタ [/]。ブラシツールを選択し、各画像セクションの「+」または「-」ボタンを選択して、セグメンテーションエディタの作業ウィンドウで関心のあるORN軸索をマスクします。
   2. [プロセス|]をクリックします。画像計算機 [/].画像1の「画像X」、操作の「乗算」、画像2の「画像X.ラベル」[/]を選択します。これにより、関心のある軸索のみを含む新しい画像系列ファイルが生成されます。ステップ 4.1 を実行して、z スタック・イメージを処理します。すべてのタイム ポイントに対してこの手順を繰り返して、時系列イメージ ファイルを生成します。
4. 同じ画像から異なる軸索を擬似色化するために、まずステップ4.3を実行して、各軸索の時系列画像ファイルを別々に生成する。同じ生データ画像から異なる単一軸索の時系列画像ファイルを開きます。 画像|をクリックします。カラー|チャンネルをマージします。異なるカラーチャンネルで異なる時系列画像ファイルを選択し、「 OK」をクリックします。

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結果

ORN軸索は、18時間から36時間APFの間の触角葉に到着する。その後、触角葉をナビゲートし、正中線を横切り、糸球体を神経支配します。ビデオ1は、20分毎の頻度で24時間撮影された、個々に識別可能ないくつかの軸索の全プロセスを示す代表的な ビデオ である。TurboRegを使用して登録する前に、軸索は脳が発達するにつれていくらかの横方向の漂流を示す(ビデオの前半)。登録後?...

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ディスカッション

ショウジョウバエのアンテナ脳外植体は、嗅覚回路の正常な標的を保持している。我々は、開発がin vivoと比較して2倍遅いex vivoであることに気付きました。外植系は、6種類のORNを宿主とする上顎触診を保持しないことに留意されたい。正常な発達がエクスビボで反復されることを確実にするために、外植体解剖中に触角神経の伸張を避ける必要がある。エクス?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
20-hydroxyecdysone	Sigma	H5142
Chameleon Ti:Sapphire laser	Coherent	Coherent MRU X1
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10082147
Human insulin	Thermo Fisher Scientific	12585014
Imaging software	Prairie
Micro Scissors	World Precision Instruments	501778
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Oxygen cylinder	Praxair	OX M-E
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Schneider’s Drosophila Medium	Thermo Fisher Scientific	21720024
SYLGARD 184 Silicone Elastomer	Thermo Fisher Scientific	NC0162601
Two-photon microscopy	Bruker
water immerse objective (20X)	Zeiss	421452-9800-000