מערכת אקספלנט למחקרי הדמיה בהילוך מהיר של מכלול מעגלי חוש הריח בדרוזופילה

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הליך הנתיחה, מצב התרבית וההדמיה החיה של מערכת אקספלנט של אנטנות-מוח לצורך חקר מכלול מעגלי חוש הריח.

Abstract

~נוירונים מחוברים זה לזה במדויק כדי ליצור מעגלים החיוניים לתפקוד תקין של המוח. מערכת חוש הריח Drosophila מספקת מודל מצוין לחקור את התהליך הזה מכיוון ש-50 סוגים של נוירונים של קולטני חוש הריח (ORNs) מהאנטנות והפלפים המקסילריים מקרינים את האקסונים שלהם ל-50 גלומרולי הניתנים לזיהוי באונה האנטנה ויוצרים קשרים סינפטיים עם דנדריטים מ-50 סוגים של נוירוני הקרנה מסדר שני (PNs). מחקרים קודמים התמקדו בעיקר בזיהוי מולקולות חשובות המווסתות את המיקוד המדויק במעגל חוש הריח באמצעות רקמות קבועות. כאן מתוארת מערכת הסברים של אנטנה-מוח המשחזרת אבני דרך התפתחותיות מרכזיות של הרכבת מעגלי חוש הריח בתרבית. באמצעות ניתוח הקוטיקולה החיצונית וניקוי גופי שומן אטומים המכסים את המוח הפופל המתפתח, ניתן לאסוף תמונות באיכות גבוהה של נוירונים בודדים ממוחות חיים באמצעות מיקרוסקופיה של שני פוטונים. זה מאפשר הדמיה בהילוך מהיר של מיקוד אקסון ORN יחיד מרקמה חיה. גישה זו תסייע לחשוף הקשרים ותפקודים ביולוגיים חשובים של תאים של גנים חשובים שזוהו בעבר ולזהות מנגנונים העומדים בבסיס התהליך הדינמי של הרכבת מעגלים.

Introduction

נוירונים מחוברים זה לזה במדויק כדי ליצור מעגלים החיוניים לתפקוד תקין של המוח. במשך יותר מ-100 שנה, מדעני מוח מנסים להבין כיצד נויריטים מתרחבים לעבר המטרות הבינוניות והסופיות שלהם בדיוק רב. כתוצאה מכך, הם זיהו גנים חשובים המקודדים רמזי הנחיה לפיתוח תהליכים עצביים¹. מערכת חוש הריח Drosophila מספקת מודל מצוין לחקר התהליך הזה, שכן נוירונים של קולטני חוש הריח (ORNs, הנוירונים החושיים העיקריים) מקרינים 50 גלומרולי הניתנים לזיהוי עם גודל, צורה ומיקום יחסי סטריאוטיפיים, שם הם יוצרים קשרים סינפטיים עם דנדריטים מ-50 סוגים של נוירוני הקרנה מסדר שני (PNs), שכל אחד מהם שולח דנדריטים לאחד מ-50 הגלומרולי² (איור 1A ). לכן, קל יחסית לזהות פנוטיפים מוטנטיים ברזולוציה סינפטית (גלומרולרית) במערכת חוש הריח הזבובית. זה הוביל לתגליות של גנים חשובים המווסתים את הרכבת מעגלי חוש הריח³.

ההרכבה של מעגל חוש הריח הזבובי מסתמכת על תהליכים התפתחותיים מתואמים זמנית ומרחבית³. ORNs ו- PNs רוכשים גורלות תאים מובחנים, אשר מגדירים את התוכנית עבור ספציפיות החיווט שלהם. לאחר מכן, דנדריטים של PN מקדימים את אונת האנטנה (איור 1B). לאחר מכן, האקסונים של ה-ORNs מקיפים את אונת האנטנה האיפסילטרלית וחוצים את קו האמצע של המוח כדי להגיע לאונת האנטנה הקונטרה-צדדית. לאחר מכן, אקסונים של ORN פולשים הן לאונות אנטנה ipsi והן לאונות אנטנה קונטרלטרליות ויוצרים סינפסות עם דנדריטים של PNs השותפים שלהם בגלומרולי ספציפי. מודל גס זה להרכבת מעגלי חוש הריח הוצע על סמך אפיון דגימות קבועות מנקודות זמן ביניים במהלך הפיתוח. הרזולוציה הטמפורלית הירודה וחוסר היכולת לעקוב אחר אותם תהליכים עצביים לאורך ההתפתחות מרקמה קבועה מגבילים את ההבנה המכניסטית של תהליך הרכבת המעגלים.

זה מאתגר מבחינה טכנית לצלם בשידור חי תהליכי ORN ו- PN in vivo מכיוון שתהליך החיווט מתרחש במחצית הראשונה של שלב הפופל כאשר אונת האנטנה מוקפת בגוף שומן אטום בתוך מארז הפופל. לכן, אי אפשר לדמות ישירות את מעגל חוש הריח המתפתח מגלמים שלמים. רקמות מנותחות בתרבית ex vivo יכולות לעקוף את אטימות הרקמות ושימשו בהצלחה לחקר ההתפתחות העצבית ^4,5,6. האתגר של שימוש באסטרטגיה דומה של תרבית ex vivo explant כדי לחקור חיווט עצבי במוח הפופל הוא האם הוא משחזר את מיקוד הנוירונים המדויק במצב תרבית. בהתבסס על מצב תרבית ex vivo שדווח בעבר עבור קומפלקס העין-מוח זבוב⁷, פותח לאחרונה אקספלנט המכיל את כל המוח הפופלי, האנטנות ועצבי האנטנה המחברים ללא פגע, אשר שומר על מיקוד מדויק של מעגל חוש הריח וניתן להכפיף אותו להדמיה חיה מבוססת מיקרוסקופיית שני פוטונים למשך עד 24 שעות בתדר של כל 20 דקות⁸ . כאן מתואר פרוטוקול מפורט של תרבות ההסבר וההדמיה. מערכת ההסבר מספקת שיטה רבת עוצמה לחקר הרכבה של מעגלי חוש הריח ואולי גם מעגלים אחרים במוח המרכזי.

Protocol

1. הכנת ריאגנטים

הערה: כל השלבים בפרוטוקול זה מתבצעים בטמפרטורת החדר (20-25 מעלות צלזיוס) אלא אם כן הוסבר אחרת.

1. כדי להכין את צלחת התרבית לשתוק האקספלנט במהלך הדמיית קיטועי הזמן, הניחו את סילגארד בעובי 0.5 ס"מ (ערבבו היטב שני רכיבים נוזליים ביחס של 10:1 לפני השימוש) על המשטח התחתון של צלחת פטרי בגודל 60 מ"מ x 15 מ"מ ותנו לו לרפא למשך 48 שעות בטמפרטורת החדר (איור 2A, המכונה צלחת סילגארד בטקסט הבא).
2. כדי להכין מיקרו-פינים לשיתוק אקספלנט על צלחת זו, השתמשו בזוג מלקחיים כדי להדביק מספר פינים זעירים על סרט הדבקה כאשר הקצוות החדים מיושרים בצד אחד (איור 2B). השתמשו בזוג מספריים כדי לחתוך כ-2 מ"מ מהקצוות החדים של פיני המיקרו (איור 2B'). השתמשו במלקחיים כדי להחזיק את סיכות המיקרו החתוכים ולהחדיר לשכבת סילגארד של צלחת סילגארד מוכנה מראש (איור 2C). שני פינים זעירים משמשים לשתוק אקספלנט אחד.
3. השתמש במברשת כדי לאסוף גלמים לבנים, היוצרים puparium תוך שעה אחת, של hsFLP, חלוקי נחל-GAL4/+; UAS-FRT^{100-stop-FRT 100-mCD8-GFP 8} גנוטיפ ולהעביר אותם לבקבוקונים חדשים. הלם חום באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות כדי לגרום לשיבוטי ORN דלילים מסוגים אקראיים. לאחר הלם חום, שים את הבקבוקונים על 25 מעלות צלזיוס למשך 30 שעות, וכתוצאה מכך הגלמים הזדקנו ב -30 שעות לאחר היווצרות puparium (APF).
4. כדי להכין את מדיום התרבות לאקספלנט, הוסיפו 5 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL) ל-500 מ"ל מדיום דרוזופילה של שניידר. לסנן את המדיום ולעשות 45 מ"ל aliquots ב 50 מ"ל צינורות חרוטיים. ניתן לאחסן את המדיום בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 1-2 חודשים.
5. ביום ההדמיה, קחו צינורית אחת של 45 מ"ל של מדיום דרוזופילה של שניידר והוסיפו 5 מ"ל של סרום בקר עוברי (10% v/v), 125 μL של תמיסת מלאי אינסולין אנושית של 4 מ"ג/מ"ל (ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל), 50 μL של תמיסת מלאי 1 מ"ג/מ"ל 20-הידרוקסיאקדיזון מומסת באתנול (ריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל). מערבבים היטב ומעבירים 15 מ"ל של מדיום מלא לצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל. את שאר המדיום המלא ניתן לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע. סרום בקר עוברי, תמיסת מלאי אינסולין אנושי ותמיסת מלאי 20-hydroxyecdysone הם aliquoted ומאוחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
6. חמצן את המדיום המלא של 15 מ"ל על ידי שאיבת בועות חמצן מבלון חמצן מתחת לפני השטח הנוזליים דרך קצה פיפטה סטרילי של 5 מ"ל בקצב של בועה אחת לשנייה למשך 20-30 דקות. השתמש בסרט פרפין כדי לכסות את פתיחת הצינור במהלך תהליך זה.
7. לעקר את משטח באר הנתיחה ואת לוחית סילגרד (עם מיקרו פינים מוכנסים על שכבת סילגארד, מוכנסים בשלבים A1 ו- A2) עם 70% אתנול. תנו להם להתייבש לפני השימוש.

2. דיסקציה אקספלנט

1. השתמש במברשת כדי להעביר 30 שעות APF (30 שעות לאחר היווצרות puparium) גלמים לרקמת נייר ולייבש את המשטח החיצוני של הגלמים במשך 5 דקות.
2. שים חתיכת סרט דו-צדדי על מגלשת זכוכית. חברו בזהירות את הגלמים המיובשים על המשטח הדביק של הסרט כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה. לחצו בעדינות על הגלמים עם מברשת כדי לעזור לצד הגחון של הגלמים להתחבר היטב לקלטת (איור 3A). אין לפגוע בגולם.
3. השתמשו בזוג מלקחיים כדי להסיר את נרתיק הפופל החום המכסה את הצד הגבי של הראש (איור 3A,B). הוסיפו קצה חד אחד של המלקחיים בין נרתיק הפופל החום לבין הגלם מהצד הצדדי ושברו בזהירות את נרתיק הפופל החום דרך קו לקצה האחורי של הגלם (איור 3B,C). פתחו את המארז החום של הפופל. השתמש בזוג מלקחיים כדי להחזיק בעדינות את הגלם ולהעביר את הנתיחה היטב עם 1 מ"ל של בינוני מלא מחומצן. הטביעו גלמים צפים על המשטח הבינוני כדי לעזור לו לשקוע לתחתית הבאר (איור 3D).
   הערה: אין להחדיר את קצה המלקחיים עמוק מדי לתוך נרתיק הפופל החום כדי למנוע פגיעה בגולם עם המלקחיים.
4. כדי לנתח את האנטנה-מוח מתוך הגלם, השתמשו במלקחיים כדי להחזיק בעדינות את הגלם ביד אחת והשתמשו בזוג מיקרו-חתכים כדי לחתוך חור קטן מהצד האחורי של הגלם ביד השנייה (איור 3E). חור קטן זה משחרר את הלחץ הגבוה בתוך הגלם.
5. חותכים דרך קו האמצע הגחוני של הגלם מהחור עד הצוואר (המבנה הצר שמחבר את הראש ובית החזה) עם המיקרו-חתכים (איור 3F). לאחר מכן, חתכו את היקף הצוואר כדי לנתק את הראש מגוף הגלם (איור 3G). מוציאים את הגוף ומניחים אותו בבאר אחרת.
   הערה: אין לחתוך את הצוואר ישירות מהצד הגבי/גחוני של הגלם, מה שעלול לסחוט את המוח.
6. חותכים את הציפורן השקופה שמכסה את הצד הגבי של המוח (איור 3H). זה יחשוף את הגוף השמן על גבי המוח. שמור על כמה ציפורניים שאליהן הרשתית והאנטנות מתחברות. חזור על אותו הליך לצד הגחוני של המוח.
   הערה: אל תכניסו את הלהב של המספריים עמוק מדי מתחת לציפורן, שכן הדבר יגרום לניתוק עצבי האנטנה המחברים בין האנטנות למוח (איור 3H').
7. השתמשו בפיפטה P10 כדי לשטוף בעדינות את הגוף השמן שמכסה את המוח ואת האנטנות על ידי צנרת המדיום לכיוון האזורים הפתוחים בצד הגבי והגחוני של הראש (איור 3I).
   הערה: היו עדינים מאוד בעת צנרת המדיום מכיוון שניתן לנתק את המוח בקלות מהציפורן. ודא שכל הגוף השמן מוסר במהלך שלב זה. התפתחות עצורה של אקסונים של ORN נצפתה כאשר הגוף השמן לא ניקה היטב, כנראה בגלל גישה לקויה לחמצן מהמדיום.
8. כדי לחקור את האינטראקציה של אקסונים דו-צדדיים של ORN או אקסונים של ORN למיקוד דנדריט PN, נתקו עצב אנטנה אחד או שניים עם המיקרו-חתכים במהלך שלב זה⁸ (איור 3J). הניחו בזהירות את להבי המספריים בין הציפורן למוח וקטעו את עצבי האנטנה המעוניינים בכך.
9. כדי להעביר את האקספלנט המנותח לצלחת סילגארד, הניחו טיפה של תווך מלא מחומצן (כ-200 μL) על פני השטח של סילגארד. מצפים את המשטח הפנימי של קצה פיפטה ברוחב 200 μL עם הגוף השמן מהגזע המנותח (שלב 1.6) על ידי צנרת הגוף השמן מספר פעמים, מה שמונע מהגולשים להדביק את קצה הפיפטה במהלך ההעברה. לאחר מכן, השתמשו בקצה הפיפטה הרחב הזה כדי להעביר את האקספלנט מהניתוח היטב לטיפה הבינונית שעל צלחת התרבית (איור 3K).
10. השתמשו במלקחיים כדי להצמיד את האקספלנט לשכבת סילגארד בשתי האונות האופטיות (איור 3L). מקם בזהירות את צלחת Sylgard על תחנת ההדמיה ושיתק את הצלחת עם קלטות. לאט לאט מוסיפים 10 מ"ל של מדיום מלא מחומצן לצלחת Sylgard באמצעות P1000 pipette.
    הערה: הימנעו משיבוש האקספלנט בעת הוספת המדיום לצלחת Sylgard.

3. הדמיה חיה מבוססת מיקרוסקופיית שני פוטונים

1. כדי לבצע הדמיה בהילוך מהיר, השתמש במיקרוסקופ בעל שני פוטונים, לייזר Ti:Sapphire, מטרת טבילת מים פי 20 (1.0 NA) ותוכנת הדמיה. השתמש באורך הגל של העירור ב- 920 ננומטר להדמיית חלבוני GFP. התאם את זמן השהייה של הפיקסל ל- 10 μs.
2. התאם את מיקום תחנת ההדמיה כך שהמוציאים יהיו בערך תחת המטרה. השתמשו ב-70% אתנול כדי לעקר את העדשה לפני ההדמיה. לאט לאט הנמיכו את המטרה מתחת למדיום הקרוב למוציאים. בדוק אם יש בועה כלשהי על העדשה של האובייקטיבי.
   1. אם כן, הרם את המטרה מעל המדיום וחזור על כך עד שהבועה נעלמת. מצאו את הגולשים באמצעות העינית והמרכז אחד בשדה.
3. כדי להבטיח אקספלנט עם כמה ORNs המסומנים בדלילות להדמיית קיטועי זמן, נתחו ~10 explants בכל פעם והתיישרו על ציר y בלוח התרבית. מסננים את כל האקסלנטים על ידי הזזת המטרה לאורך ציר y ובוחרים אקספלנט שבו כמה אקסונים בודדים של ORN הגיעו זה עתה לאונת האנטנה להדמיה (איור 4A).
   1. זהה את אונת האנטנה לפי צורתה הסגלגלה ואת האקסונים של ORN שמתחילים להקיף אותה. דמיינו אזור של כ-150 מיקרומטר x 150 מיקרומטר במישור xy (זום של 3x עם המטרה של 20x). להעריך את הגבול של שתי אונות האנטנה ולרכז אותן באזור ההדמיה.
4. בחר אזור הדמיה ראשוני לאורך ציר z על-ידי הגדרת החלק התחתון והחלק העליון של הסריקה. הגדר אזור הדמיה לאורך ציר z. הגדר את הקטע העמוק ביותר עם אותות האקסון של ORN כהפעלה הראשונה של ההדמיה ואת ההפעלה 100 מיקרומטר למעלה (הצד השטחי יותר) כפגישת ההדמיה האחרונה (איור 4B).
   הערה: פעולה זו משאירה חלקים מסוימים בצד העליון (השטחי) של אקסוני ORN ומונעת תזוזה של אקסוני ORN כלפי מעלה מחוץ לאזור ההדמיה עקב צמיחת המוח במהלך התרבית.
   1. תמונה במרווחים של 2 מיקרומטר. הגדר סריקת הדמיה אוטומטית בתדר של כל 20 דקות באמצעות תוכנת הדמיה.
5. הזיזו את אזור ההדמיה 20 μm כלפי מעלה לאורך ציר z לאחר ההדמיה הראשונה של 4 שעות ועוד 20 μm כלפי מעלה לאורך ציר z לאחר הדמיה של 16 שעות. ניתן להשיג זאת על ידי הגדרת סקריפט וערימות z שונות בתוכנת ההדמיה.
6. תרבית את האקספלנט לתקופה נוספת לאחר ההדמיה (עד 24 שעות ex vivo) לפני קיבוע וכתם עם N-cadherin, סמן נוירופיל, כדי לחשוף את הזהות הגנטית של כל ORN בודד על ידי הגלומרולוס שאליו הוא מכוון.

4. עיבוד תמונה

1. כדי לעבד תמונות z stack מסדרות מקטעים שצולמו בכל נקודת זמן באמצעות תוכנת פיג'י, פתח את סדרת מקטעי התמונות, לחץ על תמונה | ערימות | פרויקט Z [/].
2. כדי לתקן סחף רוחבי של המדגם במהלך התרבית, התקן את תוסף TurboReg בפיג'י.
   1. פתח סדרת תמונות של מחסנית z ותמונת מחסנית z בודדת מהסדרה. פתח את | התוספים | הרשמה טורבו-רג.
   2. בחר את סדרת התמונות z stack במקור ואת תמונת מחסנית z הבודדת ב- Target | תרגום. לחץ על לחצן אצווה כדי לרשום את כל התמונות מסדרת התמונות z stack שנפתחה.
3. כדי למקסם את התועלת של דוגמאות עם תמונה, הפרד אקסונים בודדים המסומנים בדלילות בסביבה זה לזה מתמונות z stack לאחר מקטעי תמונה תלת-ממדיים.
   1. כדי לחלץ אקסונים בודדים של ORN מכמה אקסונים באותה תמונה, פתח את סדרת מקטעי התמונות, לחץ על תוספים | | סגמנטציה עורך סגמנטציה [/]. בחר את כלי המברשת ואת המסיכה המעוניינת ב- ORN axon בחלון העבודה של עורך הסגמנטציה באמצעות הלחצנים בחר "+" או "-" בכל מקטע תמונה.
   2. לחץ על תהליך | מחשבון תמונה [/]. בחר "תמונה X" בתמונה 1, "הכפל" בפעולה, "תמונה X. תוויות" בתמונה 2, [/]. פעולה זו יוצרת קובץ סדרת תמונות חדש עם האקסון המעוניין בלבד. בצע את שלב 4.1 כדי לעבד את תמונת מחסנית z. חזור על שלב זה עבור כל נקודות הזמן כדי ליצור קובץ תמונה מסדרת זמן.
4. כדי לפסבדו-צבע אקסונים שונים מאותה תמונה, תחילה בצע את שלב 4.3 כדי ליצור את קובץ התמונה של סדרת הזמן של כל אקסון בנפרד. פתח את קבצי התמונה של סדרת הזמן עבור אקסונים בודדים שונים מאותה תמונת נתונים גולמית. לחץ על תמונה | | צבע מיזוג ערוצים. בחר קבצי תמונה שונים מסדרות זמן בערוצי צבעים שונים ולחץ על אישור.

תוצאות

אקסונים של ORN מגיעים לאונת האנטנה בין 18 שעות ל-36 שעות APF. לאחר מכן הם מנווטים את אונת האנטנה, חוצים את קו האמצע ומעצימים את הגלומרולי. סרטון 1 הוא סרטון מייצג המציג את כל התהליך עבור מספר אקסונים הניתנים לזיהוי בנפרד, שצולמו בתדירות של כל 20 דקות במשך 24 שעות. לפני ההרשמה באמצעות TurboReg, ה?...

Discussion

האקספלנט המוחי של אנטנות Drosophila שומר על מיקוד תקין של מעגל חוש הריח. שמנו לב שההתפתחות איטית פי 2 ב-ex vivo בהשוואה ל-in vivo. צוין כי מערכת ההסבר אינה שומרת על מישוש מקסילרי, המארח שישה סוגים של ORNs. כדי להבטיח שהתפתחות תקינה תחזור על עצמה ex vivo, יש להימנע ממתיחה של עצבי האנטנה במהל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
20-hydroxyecdysone	Sigma	H5142
Chameleon Ti:Sapphire laser	Coherent	Coherent MRU X1
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10082147
Human insulin	Thermo Fisher Scientific	12585014
Imaging software	Prairie
Micro Scissors	World Precision Instruments	501778
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Oxygen cylinder	Praxair	OX M-E
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Schneider’s Drosophila Medium	Thermo Fisher Scientific	21720024
SYLGARD 184 Silicone Elastomer	Thermo Fisher Scientific	NC0162601
Two-photon microscopy	Bruker
water immerse objective (20X)	Zeiss	421452-9800-000