Drosophila'da Koku Alma Devresi Düzeneğinin Hızlandırılmış Görüntüleme Çalışmaları için Bir Explant Sistemi

Özet

Bu protokol, koku alma devresi düzeneğinin incelenmesi için diseksiyon prosedürünü, kültür durumunu ve anten-beyin eksplant sisteminin canlı görüntülenmesini açıklar.

Özet

Nöronlar, beynin düzgün çalışması için gerekli devreleri oluşturmak için tam olarak birbirine bağlanır. Drosophila koku alma sistemi, antenlerden ve maksiller palplardan gelen 50 tip koku alma reseptör nöronu (ORN) aksonlarını anten lobunda 50 tanımlanabilir glomerüle yansıttığından ve 50 tip ikinci dereceden projeksiyon nöronundan (PN) dendritlerle sinaptik bağlantılar oluşturduğundan, bu süreci araştırmak için mükemmel bir model sunar. Önceki çalışmalar temel olarak sabit dokular kullanarak koku alma devresindeki hassas hedeflemeyi düzenleyen önemli molekülleri tanımlamaya odaklanmıştır. Burada, kültürdeki koku alma devresi düzeneğinin temel gelişimsel kilometre taşlarını özetleyen bir anten-beyin eksplant sistemi açıklanmaktadır. Dış kütikülün diseksiyonu ve gelişmekte olan pupa beynini kaplayan opak yağ cisimlerinin temizlenmesiyle, canlı beyinlerden tek nöronların yüksek kaliteli görüntüleri iki foton mikroskobu kullanılarak toplanabilir. Bu, canlı dokudan tek ORN akson hedeflemesinin hızlandırılmış görüntülenmesini sağlar. Bu yaklaşım, daha önce tanımlanmış önemli genlerin önemli hücre biyolojik bağlamlarını ve işlevlerini ortaya çıkarmaya ve devre montajının dinamik sürecini destekleyen mekanizmaları tanımlamaya yardımcı olacaktır.

Giriş

Nöronlar, beynin düzgün çalışması için gerekli devreleri oluşturmak için tam olarak birbirine bağlanır. 100 yılı aşkın bir süredir, sinirbilimciler nöritlerin orta ve nihai hedeflerine doğru nasıl aşırı hassasiyetle uzandıklarını anlamaya çalışıyorlar. Sonuç olarak, nöronal süreçlerin geliştirilmesi için rehberlik ipuçlarını kodlayan önemli genleri tanımladılar¹. Drosophila koku alma sistemi, koku alma reseptör nöronları (ORN'ler, birincil duyusal nöronlar) basmakalıp boyut, şekil ve göreceli konuma sahip 50 tanımlanabilir glomerüle yansıtıldığından, her biri 50 glomerülden birine dendrit gönderen 50 tip ikinci dereceden projeksiyon nöronundan (PN'ler) dendritlerle sinaptik bağlantılar oluşturdukları için bu süreci araştırmak için mükemmel bir model sunar² (Şekil 1A) ). Bu nedenle, sinek koku alma sisteminde sinaptik (glomerüler) çözünürlükte mutant fenotipleri tanımlamak nispeten kolaydır. Bu, koku devresi düzeneğini düzenleyen önemli genlerin keşfedilmesine yol açtı³.

Sinek koku alma devresinin montajı, geçici ve mekansal olarak koordine edilmiş gelişimsel süreçlere dayanır³. ORN'ler ve PN'ler, kablolama özgüllükleri için programı ayarlayan farklı hücre kaderleri kazanırlar. Daha sonra, PN dendritleri anten lobunu önceden şekillendirir (Şekil 1B). ORN'lerin aksonları daha sonra ipsilateral anten lobunun etrafında döner ve kontralateral anten lobuna ulaşmak için beynin orta hattını geçer. Daha sonra, ORN aksonları hem ipsi hem de kontralateral anten loblarını istila eder ve spesifik glomerüllerde partner PN'lerinin dendritleri ile sinapslar oluşturur. Koku alma devresi montajı için bu kaba model, geliştirme sırasında ara zaman noktalarından sabit numunelerin karakterizasyonuna dayanarak önerilmiştir. Zayıf zamansal çözünürlük ve sabit dokudan gelişim boyunca aynı nöronal süreçleri takip edememe, devre montaj sürecinin mekanik anlayışını sınırlar.

Görüntü ORN ve PN işlemlerini in vivo olarak yaşamak teknik olarak zordur, çünkü kablolama işlemi, anten lobunun pupa kasası içindeki opak yağ gövdesi ile çevrili olduğu pupa aşamasının ilk yarısında gerçekleşir. Bu nedenle, gelişmekte olan koku alma devresini sağlam pupalardan doğrudan görüntülemek imkansızdır. Exvivo kültürlenmiş disseke dokular doku opaklığını atlatabilir ve nöral gelişimi incelemek için başarıyla kullanılmıştır ^4,5,6. Pupa beynindeki nöronal kablolamayı incelemek için benzer bir ex vivo eksplant kültürü stratejisi kullanmanın zorluğu, bir kültür durumunda kesin nöron hedeflemesini özetleyip özetlemediğidir. Sinek gözü-beyin kompleksi⁷ için daha önce bildirilen bir ex vivo kültür durumuna dayanarak, tüm pupa beynini, antenleri ve bağlantı anten sinirlerini bozulmadan içeren, koku alma devresinin hassas hedeflemesini koruyan ve her 20 dakikada bir 24 saate kadar iki foton mikroskopi tabanlı canlı görüntülemeye tabi tutulabilen bir eksplant yakın zamanda geliştirilmiştir⁸ . Burada, eksplant kültürü ve görüntülemenin ayrıntılı bir protokolü açıklanmaktadır. Eksplant sistemi, koku alma devresinin ve potansiyel olarak merkezi beyindeki diğer devrelerin montajını incelemek için güçlü bir yöntem sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Reaktiflerin hazırlanması

NOT: Bu protokoldeki tüm adımlar, aksi açıklanmadıkça oda sıcaklığında (20-25 °C) gerçekleştirilir.

1. Kültür kabını hızlandırılmış görüntüleme sırasında eksplantı hareketsiz hale getirmek üzere hazırlamak için, 60 mm x 15 mm Petri kabının alt yüzeyine 0,5 cm kalınlığında Sylgard (kullanımdan önce 10: 1 oranında iki sıvı bileşeni iyice karıştırın) yerleştirin ve oda sıcaklığında 48 saat kürlenmesini sağlayın (Şekil 2A, aşağıdaki metinde Sylgard plakası olarak anılacaktır).
2. Bu plaka üzerinde eksplantı hareketsiz hale getirmek için mikro pimler hazırlamak için, keskin uçları bir tarafa hizalanmış bir bant üzerine birden fazla mikro pim yapıştırmak için bir çift forseps kullanın (Şekil 2B). Mikro pimlerin keskin uçlarından ~2 mm kesmek için bir çift makas kullanın (Şekil 2B'). Kesilmiş mikro pimleri tutmak ve önceden hazırlanmış bir Sylgard plakasının Sylgard tabakasına yerleştirmek için forseps kullanın (Şekil 2C). Bir eksplantı hareketsiz hale getirmek için iki mikro pim kullanılır.
3. 1 saat içinde puparyum oluşturan beyaz pupaları hsFLP, çakıl taşlı-GAL4 / +'dan toplamak için bir fırça kullanın; UAS-FRT 100-stop-FRT^{100-mCD8-GFP 8} genotipi ve yeni şişelere aktarın. Rastgele tiplerden seyrek ORN klonlarını indüklemek için 37 °C su banyosunda 40 dakika boyunca ısı şoku. Isı şokundan sonra, şişeleri 30 saat boyunca 25 ° C'ye koyun, bu da puparyum oluşumundan (APF) sonra 30 saatte yaşlanan pupalarla sonuçlanır.
4. Kültür ortamını eksplanta hazırlamaya hazırlamak için, 500 mL Schneider'in Drosophila Medium'una 5 mL Penisilin-Streptomisin (10.000 U / mL) ekleyin. Ortamı filtreleyin ve 50 mL konik tüplerde 45 mL aliquots yapın. Ortam 4 °C'de 1-2 ay saklanabilir.
5. Görüntüleme gününde, 45 mL'lik Schneider's Drosophila besiyerinin bir tüpünü alın ve 5 mL Fetal Sığır Serumu (% 10 v / v), 125 μL 4 mg / mL insan insülin stok çözeltisi (10 μg / mL nihai konsantrasyon), etanol içinde çözünmüş 50 μL 1 mg / mL 20-hidroksiekdison stok çözeltisi (1 μg / mL nihai konsantrasyon) ekleyin. İyice karıştırın ve 15 mL tam ortamı yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın. Tam ortamın geri kalanı bir hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir. Fetal sığır serumu, insan insülin stok çözeltisi ve 20-hidroksiekdison stok çözeltisi aliquoted edilir ve -20 ° C'de depolanır.
6. Oksijen kabarcıklarını sıvı yüzeyinin altındaki bir oksijen tüpünden steril 5 mL'lik pipet ucundan 20-30 dakika boyunca bir kabarcık/s oranında pompalayarak 15 mL tam ortamı oksijenlendirin. Bu işlem sırasında tüpün açılmasını örtmek için bir parafin film kullanın.
7. Diseksiyon kuyusu yüzeyini ve Sylgard plakasını (Sylgard tabakasına yerleştirilmiş, A1 ve A2 adımlarında hazırlanan mikro pimlerle)% 70 etanol ile sterilize edin. Kullanmadan önce kurumasını bekleyin.

2. Explant diseksiyonu

1. 30 saatlik APF (puparyum oluşumundan 30 saat sonra) pupaları bir kağıt mendile aktarmak için bir fırça kullanın ve pupaların dış yüzeyini 5 dakika kurutun.
2. Bir cam slayta bir parça çift taraflı bant koyun. Kurutulmuş pupaları, sırt tarafı yukarı bakacak şekilde bandın yapışkan yüzeyine dikkatlice takın. Pupaların ventral tarafının banda iyice yapışmasına yardımcı olmak için pupaya bir fırça ile hafifçe bastırın (Şekil 3A). Pupaya zarar vermeyin.
3. Başın dorsal tarafını kaplayan kahverengi pupa kılıfını çıkarmak için bir çift forseps kullanın (Şekil 3A, B). Forsepslerin keskin bir ucunu kahverengi pupa kasası ile pupa arasına lateral taraftan yerleştirin ve kahverengi pupa vakasını pupanın arka ucuna doğru bir çizgi boyunca dikkatlice kırın (Şekil 3B, C). Kahverengi pupa kasasını açın. Pupa'yı nazikçe tutmak için bir çift forseps kullanın ve 1 mL oksijenli tam ortam ile diseksiyona iyi aktarın. Yüzen pupa'yı kuyunun dibine batmasına yardımcı olmak için orta yüzeye batırın (Şekil 3D).
   NOT: Pupa'nın forsepslerle yaralanmasını önlemek için forseps ucunu kahverengi pupa kılıfının içine çok derin bir şekilde sokmayın.
4. Anten beynini pupadan çıkarmak için, pupayı bir elinizle nazikçe tutmak için forseps kullanın ve diğer elinizle pupanın arka tarafından küçük bir delik açmak için bir çift mikromakas kullanın (Şekil 3E). Bu küçük delik, pupanın içindeki yüksek basıncı serbest bırakır.
5. Pupa'nın ventral orta hattını delikten boyuna (baş ve göğüs kafesini birbirine bağlayan dar yapı) kadar mikromakasla kesin (Şekil 3F). Daha sonra, kafayı pupa'nın gövdesinden ayırmak için boynun çevresini kesin (Şekil 3G). Vücudu çıkarın ve farklı bir kuyuya yerleştirin.
   NOT: Boynu doğrudan pupanın dorsal / ventral tarafından kesmeyin, bu da beyni sıkıştırabilir.
6. Beynin dorsal tarafını kaplayan şeffaf kütikülü kesin (Şekil 3H). Bu, beynin üstündeki şişman vücudu ortaya çıkaracaktır. Retina ve antenlerin bağlı olduğu bir miktar kütikül tutun. Aynı prosedürü beynin ventral tarafına tekrarlayın.
   NOT: Makasın bıçağını kütikülün altına çok derin sokmayın, çünkü bu, antenleri ve beyni birbirine bağlayan anten sinirlerinin kopmasına neden olur (Şekil 3H').
7. Beyni ve antenleri kaplayan yağ gövdesini, ortamı başın dorsal ve ventral taraflarındaki açık bölgelere doğru pipetleyerek nazikçe yıkamak için bir P10 pipet kullanın (Şekil 3I).
   NOT: Ortamı pipetlerken çok nazik olun, çünkü beyin kütikülden kolayca ayrılabilir. Bu adımda tüm yağ vücudunun alındığından emin olun. ORN aksonlarının tutuklanmış gelişimi, muhtemelen ortamdan zayıf oksijen erişimi nedeniyle, yağ gövdesi iyi temizlenmediğinde gözlendi.
8. İki taraflı ORN aksonları veya ORN aksonlarının PN dendrit hedefleme ile etkileşimini incelemek için, bu aşama⁸ sırasında mikromakasla bir veya iki anten sinirini ayırın (Şekil 3J). Makasın bıçaklarını kütikül ve beyin arasına dikkatlice yerleştirin ve ilgilenen anten sinirlerini ayırın.
9. Disseke edilmiş eksplantı Sylgard plakasına aktarmak için, Sylgard yüzeyine oksijenli tam ortam (~ 200 μL) damlacığı yerleştirin. 200 μL genişliğinde bir pipet ucunun iç yüzeyini, disseke edilmiş gövdeden yağ gövdesiyle (adım 1.6) yağ gövdesini birkaç kez pipetleyerek kaplayın, bu da eksplantların transfer sırasında pipet ucunu yapışmasını önler. Ardından, eksplantı diseksiyon kuyusundan kültür plakasındaki orta damlacığa aktarmak için bu geniş uçlu pipet ucunu kullanın (Şekil 3K).
10. Explant'ı iki optik lobdaki Sylgard tabakasına sabitlemek için forseps kullanın (Şekil 3L). Sylgard plakasını görüntüleme istasyonuna dikkatlice yerleştirin ve plakayı bantlarla hareketsiz hale getirin. P1000 pipet kullanarak Sylgard plakasına yavaşça 10 mL oksijenli tam ortam ekleyin.
    NOT: Ortamı Sylgard plakasına eklerken eksplantı bozmaktan kaçının.

3. İki foton mikroskopi tabanlı canlı görüntüleme

1. Hızlandırılmış görüntüleme yapmak için, iki fotonlu mikroskop, bir Ti: Safir lazer, 20x suya daldırma hedefi (1.0 NA) ve bir görüntüleme yazılımı kullanın. GFP proteinlerini görüntülemek için 920 nm'deki uyarma dalga boyunu kullanın. Pikselin bekleme süresini 10 μs olarak ayarlayın.
2. Görüntüleme istasyonu konumunu, eksplantlar kabaca hedefin altında kalacak şekilde ayarlayın. Görüntülemeden önce lensi sterilize etmek için% 70 etanol kullanın. Eksplantlara yakın ortamın altındaki hedefi yavaşça indirin. Objektif merceğinde herhangi bir kabarcık olup olmadığını kontrol edin.
   1. Eğer öyleyse, hedefi ortamın üzerine kaldırın ve kabarcık gidene kadar bunu tekrarlayın. Göz merceğini kullanarak eksplantları bulun ve tarlada bir eksplantı ortalayın.
3. Hızlandırılmış görüntüleme için seyrek olarak etiketlenmiş birkaç ORN'ye sahip bir eksplant sağlamak için, her seferinde ~ 10 eksplantı disseke edin ve kültür plakası üzerindeki y ekseninde hizalayın. Hedefi y ekseni boyunca hareket ettirerek tüm eksplantları tarayın ve birkaç tek ORN aksonunun görüntüleme için anten lobuna yeni ulaştığı bir eksplant seçin (Şekil 4A).
   1. Anten lobunu oval şeklinden ve onu çevrelemeye başlayan ORN aksonlarından tanıyın. xy düzleminde ~150 μm x 150 μm alan görüntüleyin (20x objektifle 3x yakınlaştırma). İki anten lobunun sınırını tahmin edin ve bunları görüntüleme alanında ortalayın.
4. Taramanın alt bölümünü ve üst bölümünü tanımlayarak z ekseni boyunca bir başlangıç görüntüleme bölgesi seçin. Z ekseni boyunca görüntüleme alanı ayarlayın. İlk görüntüleme seansı olarak ORN akson sinyalleri ile en derin bölümü ve son görüntüleme seansı olarak 100 μm yukarıdaki seansı (daha yüzeysel taraf) olarak ayarlayın (Şekil 4B).
   NOT: Bu, bazı bölümleri ORN aksonlarının üstünde (yüzeysel tarafta) bırakır ve kültür sırasında beynin büyümesi nedeniyle ORN aksonlarının görüntüleme alanının dışına doğru yukarı doğru kaymasını önler.
   1. 2 μm aralıklarla görüntü. Görüntüleme yazılımını kullanarak otomatik görüntüleme taramasını her 20 dakikada bir frekansta ayarlayın.
5. İlk 4 saatlik görüntülemeden sonra görüntüleme bölgesini z ekseni boyunca 20 μm yukarı doğru ve 16 saatlik görüntülemeden sonra z ekseni boyunca 20 μm yukarı doğru kaydırın. Bu, görüntüleme yazılımında bir komut dosyası ve farklı z yığınları ayarlayarak elde edilebilir.
6. Bir nöropil belirteci olan N-kadherin ile fiksasyon ve boyama işleminden önce, hedeflediği glomerulus tarafından her bir ORN'nin genetik kimliğini ortaya çıkarmak için görüntüleme sonrası (24 saate kadar ex vivo) ek bir süre için eksplantı kültürleyin.

4. Görüntü işleme

1. Fiji yazılımı kullanılarak her zaman noktasında çekilen bölüm serilerinden z yığını görüntülerini işlemek için, görüntü bölümü serisini açın, Görüntü | Yığınlar | Z projesi [/].
2. Kültür sırasında numunenin yanal sürüklenmesini düzeltmek için Fiji'de TurboReg Plugin'i kurun.
   1. Bir z yığını görüntü serisi ve seriden tek bir z yığını görüntüsü açın. Açık Eklentiler | Kayıt | TurboReg.
   2. Kaynak'ta z yığını görüntü serisini ve Hedef |'da tek z yığını görüntüsünü seçin Çeviri. Açılan z yığını görüntü serisindeki tüm görüntüleri kaydetmek için Toplu İşlem düğmesine tıklayın.
3. Resimli örneklerin faydasını en üst düzeye çıkarmak için, birbirine yakın seyrek etiketlenmiş tek aksonları 3B görüntü bölümlerini izleyen z yığını görüntülerinden ayırın.
   1. Aynı görüntüdeki birkaç aksondan tek bir ORN aksonunu çıkarmak için, görüntü bölümü serisini açın, Eklentiler | Segmentasyon | Segmentasyon Düzenleyicisi [/]. Fırça aracını seçin ve her görüntü bölümündeki "+" veya "-" düğmelerini kullanarak Segmentasyon Düzenleyicisi çalışma penceresinde ilgilenen ORN aksonunu maskeleyin.
   2. İşlem |'na tıklayın Görüntü Hesaplayıcı [/]. Resim 1'de "Resim X"i, İşlemde "Çarp"ı, Resim 2'de "Resim X. etiketleri"ni seçin , [/]. Bu, yalnızca ilgili aksonla yeni bir görüntü serisi dosyası oluşturur. Z yığını görüntüsünü işlemek için adım 4.1'i gerçekleştirin. Bir zaman serisi görüntü dosyası oluşturmak için tüm zaman noktaları için bu adımı yineleyin.
4. Aynı görüntüden farklı aksonları sözde renklendirmek için, önce her aksonun zaman serisi görüntü dosyasını ayrı ayrı oluşturmak üzere adım 4.3'ü gerçekleştirin. Aynı ham veri görüntüsünden farklı tek aksonlar için zaman serisi görüntü dosyalarını açın. Resim | üzerine tıklayın Renk | Kanalları Birleştir. Farklı renk kanallarında farklı zaman serisi görüntü dosyaları seçin ve Tamam'ı tıklatın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

ORN aksonları anten lobuna 18 saat ile 36 saat APF arasında ulaşır. Daha sonra anten lobunda gezinir, orta çizgiyi geçer ve glomerülleri innerve ederler. Video 1 , 24 saat boyunca her 20 dakikada bir frekansta çekilen, bireysel olarak tanımlanabilir birkaç akson için tüm süreci gösteren temsili bir videodur. TurboReg kullanarak kayıt olmadan önce, aksonlar beyin geliştikçe bazı yanal sürüklenmeler sergiler (videonun ilk yarısı). Kayıttan sonra, sürüklenme düzeltilir (videonun i...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Drosophila anten-beyin eksplantı, koku alma devresinin normal hedeflemesini korur. Gelişimin in vivo'ya kıyasla 2 kat daha yavaş ex vivo olduğunu fark ettik. Explant sisteminin, altı tip ORN'ye ev sahipliği yapan maksiller palp'ı tutmadığı belirtilmektedir. Normal gelişimin ex vivo olarak özetlenmesini sağlamak için, eksplant diseksiyonu sırasında anten sinirlerinin gerilmesinden kaçınılmalıdır. Ex vivo kültür sırasında bakteri büyümesi genellikle k...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
20-hydroxyecdysone	Sigma	H5142
Chameleon Ti:Sapphire laser	Coherent	Coherent MRU X1
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10082147
Human insulin	Thermo Fisher Scientific	12585014
Imaging software	Prairie
Micro Scissors	World Precision Instruments	501778
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Oxygen cylinder	Praxair	OX M-E
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Schneider’s Drosophila Medium	Thermo Fisher Scientific	21720024
SYLGARD 184 Silicone Elastomer	Thermo Fisher Scientific	NC0162601
Two-photon microscopy	Bruker
water immerse objective (20X)	Zeiss	421452-9800-000