Mejorar la reproducibilidad para cumplir con la información mínima para estudios de vesículas extracelulares 2018 Directrices en el análisis de seguimiento de nanopartículas

Resumen

El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) es un método ampliamente utilizado para caracterizar vesículas extracelulares. Este artículo destaca los parámetros y controles experimentales de NTA, además de un método uniforme de análisis y caracterización de muestras y diluyentes necesarios para complementar las pautas propuestas por MISEV2018 y EV-TRACK para la reproducibilidad entre laboratorios.

Resumen

El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) ha sido uno de los varios métodos de caracterización utilizados para la investigación de vesículas extracelulares (EV) desde 2006. Muchos consideran que los instrumentos NTA y sus paquetes de software se pueden utilizar fácilmente después de una capacitación mínima y que la calibración del tamaño es factible internamente. Como tanto la adquisición de NTA como el análisis de software constituyen la caracterización de EV, se abordan en Información mínima para estudios de vesículas extracelulares 2018 (MISEV2018). Además, han sido monitoreados por Transparent Reporting y Centralizing Knowledge in Extracellular Vesicle Research (EV-TRACK) para mejorar la robustez de los experimentos ev (por ejemplo, minimizar la variación experimental debido a factores no controlados).

A pesar de los esfuerzos para fomentar el informe de métodos y controles, muchos trabajos de investigación publicados no informan los entornos críticos necesarios para reproducir las observaciones originales de NTA. Pocos artículos informan de la caracterización NTA de controles o diluyentes negativos, asumiendo evidentemente que los productos disponibles comercialmente, como la solución salina tamponada con fosfato o el agua destilada ultrapura, están libres de partículas. Del mismo modo, los controles positivos o los estándares de tamaño rara vez son reportados por los investigadores para verificar el tamaño de las partículas. La ecuación de Stokes-Einstein incorpora variables de viscosidad y temperatura de la muestra para determinar el desplazamiento de partículas. Informar de la temperatura estable de la cámara láser durante toda la recolección de video de muestra es, por lo tanto, una medida de control esencial para una replicación precisa. La filtración de muestras o diluyentes tampoco se informa rutinariamente, y si es así, rara vez se incluyen los detalles del filtro (fabricante, material de membrana, tamaño de poro) y las condiciones de almacenamiento. Los estándares mínimos de detalle experimental aceptable de la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV) deben incluir un protocolo NTA bien documentado para la caracterización de EV. El siguiente experimento proporciona evidencia de que el investigador individual debe establecer un protocolo de análisis NTA e incluirlo en los métodos de publicaciones que utilizan la caracterización NTA como una de las opciones para cumplir con los requisitos MISEV2018 para la caracterización de una sola vesícula.

Introducción

El análisis preciso y repetible de vehículos eléctricos y otras partículas a escala nanométrica presenta numerosos desafíos en toda la investigación y la industria. La replicación de la investigación ev ha sido difícil, en parte, debido a la falta de uniformidad en el informe de los parámetros necesarios asociados con la recopilación de datos. Para abordar estas deficiencias, el ISEV propuso pautas de la industria como un conjunto mínimo de estándares bioquímicos, biofísicos y funcionales para los investigadores de vehículos eléctricos y los publicó como una declaración de posición, comúnmente conocida como MISEV2014¹. El ritmo acelerado de la ....

Protocolo

1. Directrices generales del protocolo

1. Mantenga el microscopio en una mesa de aire o como mínimo en una mesa libre de vibraciones. Asegúrese de que las vibraciones extrañas (por ejemplo, golpes con los pies en el suelo, tocar la mesa, cierres de puertas, tráfico de laboratorio) se mantengan al mínimo.
2. Ajuste y mantenga la temperatura del módulo láser a una temperatura constante para todas las grabaciones de video.
   NOTA: La temperatura elegida fue de 25 °C porque el analizador de tamaño de nanopartículas se calibró a esa temperatura. Por lo tanto, es importante que todos los usuarios del instrumento conozcan y utilicen la tempera....

Resultados

La Tabla 1 contiene los resultados de los videos NTA para las muestras de liposomas (18 filtradas y 18 sin filtrar) y un diluyente DPBS representativo. Las comparaciones entre los dos grupos se completaron independientemente del nivel de la cámara o el umbral de detección en este documento. Las muestras filtradas tenían un diámetro medio de partículas de 108,5 nm, un modo de partículas de 86,2 nm y una concentración de 7,4 × 10⁸ partículas/ml. Por el contrario, las muestras sin filtra.......

Discusión

Existen varios métodos disponibles para estimar el tamaño y la concentración de nanopartículas¹¹. Estos incluyen métodos de conjunto que generan una estimación del tamaño de una población, incluida la dispersión dinámica de la luz (DLS), la sedimentación centrífuga y el análisis a nivel de partícula única: microscopía electrónica, NTA, microscopía de fuerza atómica y detección de pulso resistivo sintonizable. De estos, DLS y NTA son métodos de medición de tamaño y concentrac.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic Pipetter
Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL	Thermo Sci.	339650
Kimwipes
Lens Cleaner
Lens Paper
NanoSight LM-10	Malvern Panalytical
NanoSight LM-14 Laser Module	Malvern Panalytical
Nanosight NTA Software Ver. 3.2	Malvern Panalytical
Paper Towels
Pipette Tips, 1-200 µL, Filtered, Sterile, Low Binding	BioExpress	P -3243-200X
Pipette Tips, 50-1,000 µL, Filtered, Sterile	BioExpress	P-3243-1250
Saline, Dulbecco's Phosphate Buffered (No Ca or Mg)	Gibco	14190-144
Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL)	Malvern	NTA4088
Standards, Latex Transfer- 50 nm  (3 mL)	Malvern	NTA4087
Syringe Filter, 33 mm, .22 µm, MCE, Sterile	Fisher brand	09-720-004
Syringe, TB, 1 mL, slip tip	Becton Dickinson	309659
Waste fluid container