나노 입자 추적 분석의 2018 지침 세포 밖 소포 연구에 대한 최소한의 정보를 충족하기위한 재현성 향상

요약

나노입자 추적 분석(NTA)은 세포밖 소포를 특성화하기 위해 널리 사용되는 방법이다. 이 백서에서는 NTA 실험 파라미터 및 제어와 실험실 간 재현성을 위해 MISEV2018 및 EV-TRACK이 제안한 지침을 보완하는 데 필요한 샘플 및 희석제의 균일한 분석 및 특성화 방법을 강조합니다.

초록

나노입자 추적 분석(NTA)은 2006년부터 세포밖 소포(EV) 연구에 사용되는 여러 특성화 방법 중 하나였습니다. 많은 사람들은 NTA 기기와 소프트웨어 패키지를 최소한의 교육만으로 쉽게 활용할 수 있으며 크기 교정이 사내에서 가능하다고 생각합니다. NTA 획득 및 소프트웨어 분석이 모두 EV 특성화를 구성하므로 세포 밖 소포 연구를위한 최소 정보 2018 (MISEV2018)에서 다룹니다. 또한, EV 실험의 견고성을 향상시키기 위해 EV (EV-TRACK)의 투명한보고 및 중앙 집중화 지식에 의해 모니터링되었습니다 (예 : 통제되지 않은 요인으로 인한 실험 변동 최소화).

방법 및 제어에 대한보고를 장려하려는 노력에도 불구하고 많은 출판 된 연구 논문은 원래의 NTA 관찰을 재현하는 데 필요한 중요한 설정을보고하지 못합니다. 음성 대조군 또는 희석제의 NTA 특성화를보고하는 논문은 거의 없으며, 인산염 완충 식염수 또는 초순수 증류수와 같은 상업적으로 이용 가능한 제품이 미립자가 없다고 분명히 가정합니다. 마찬가지로, 긍정적 인 통제 또는 크기 표준은 입자 크기를 확인하기 위해 연구자에 의해보고되는 경우는 거의 없습니다. Stokes-Einstein 방정식은 입자 변위를 결정하기 위해 샘플 점도와 온도 변수를 통합합니다. 따라서 전체 샘플 비디오 수집 동안 안정적인 레이저 챔버 온도를 보고하는 것은 정확한 복제를 위한 필수적인 제어 측정입니다. 샘플 또는 희석제의 여과는 또한 일상적으로 보고되지 않으며, 만약 그렇다면, 필터의 특이성(제조자, 막 물질, 기공 크기) 및 저장 조건은 거의 포함되지 않는다. 국제 세포밖 소포 학회 (ISEV)의 허용 가능한 실험 세부 사항에 대한 최소한의 표준에는 EV의 특성화를위한 잘 문서화 된 NTA 프로토콜이 포함되어야합니다. 다음 실험은 NTA 분석 프로토콜이 개별 연구자에 의해 수립되어야 한다는 증거를 제공하며, 단일 소포 특성화에 대한 MISEV2018 요구 사항을 충족하기 위한 옵션 중 하나로 NTA 특성화를 사용하는 출판물 방법에 포함되어야 한다는 증거를 제공합니다.

서문

EV 및 기타 나노미터 크기의 입자에 대한 정확하고 반복 가능한 분석은 연구 및 산업 전반에 걸쳐 수많은 과제를 제시합니다. EV 연구의 복제는 부분적으로 데이터 수집과 관련된 필요한 매개 변수를보고하는 데 균일 성이 없기 때문에 어려웠습니다. 이러한 결함을 해결하기 위해 ISEV는 EV 연구원을위한 생화학적, 생물 물리학 적 및 기능적 표준의 최소 세트로 산업 지침을 제안하고 일반적으로 MISEV2014¹이라고하는 입장 성명서로 발표했습니다. EV 연구의 속도가 빨라지면서 업데이트 된 지침이 필요했으며 "MISEV2018 : ISEV의 입장 진술"은 MISEV2014 지침²를 확장했습니다. MISEV2018 논문에는 테이블, 제안된 프로토콜의 개요 및 특정 EV 관련 특성을 문서화하기 위해 따라야 할 단계가 포함되어 있습니다. 실험의 해석 및 복제를 용이하게하기위한 추가 조치로서 EV-TRACK은 EV 생물학 및 발표 된 결과에 사용 된 방법론에 대한보다 투명한보고를 가능하게하는 크라우드 소싱 지식 기반 (http://evtrack.org)으로 개발되었습니다³. 표준화 된 방법보고에 대한 이러한 권장 사항에도 불구하고이 분야는 게시 된 결과를 복제하고 확인하는 것과 관련하여 계속 어려움을 겪고 있습니다.

이 논문은 국립 보건원 (National Institutes of Health)과 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 품질 평가 도구 노력에 부합하여 ISEV가 실험실간에 결과를 복제하는 목적으로 데이터 평가 도구를 적용 할 수 있도록 방법과 세부 사항에 대한 표준화 된보고가 필요하다고 제안합니다. 보고된 세포 공급원, 세포 배양 절차 및 EV 분리 방법은 EV 집단의 특성을 정의하는 중요한 요소이다. NTA 기기 중에는 검출 설정, 담체 유체의 굴절률, 다분산성에 기여하는 이종 입자 집단, 표준화 된 보고 요구 사항 부족, 관찰자 내 및 관찰자 간 측정 결과 부재와 같은 요인으로 인해 실험실 간의 NTA 비교가 어렵거나 불가능 해집니다.

2006 년부터 사용중인 NTA는 현재 EV 연구원의 약 80 %가 사용하는 나노 입자 크기 및 농도 측정을위한 인기있는 방법입니다⁴. MISEV2018 지침에는 두 가지 형태의 단일 베시클 분석이 필요하며 그 중 NTA는 인기있는 옵션 중 하나입니다. NTA는 광범위한 접근성, 샘플 당 저렴한 비용 및 간단한 창립 이론 (Stokes-Einstein 방정식)으로 인해 EV 특성화에 계속 공통적으로 사용되고 있습니다. NTA에 의한 EV 평가는 레이저 광 산란 및 브라운 운동 분석을 사용하여 입자 크기 분포 및 농도 추정치를 생성하며, EV의 굴절률에 의해 결정된 검출의 하한을 갖는다. 알려진 점도 및 온도의 유체 샘플을 사용할 때, EV의 궤적은 두 차원에서 평균 제곱 변위를 결정하기 위해 추적됩니다. 이것은 입자 확산 계수가 계산되고 변형된 스토크스-아인슈타인 방정식 ^5,6,7에 의해 구체 등가 유체역학 직경으로 변환될 수 있게 한다. NTA의 입자-입자간 분석은 다른 특성화 방법들보다 EV들의 이질적인 집단에서 응집체 또는 더 큰 입자들에 의한 간섭이 적다⁷. 몇 개의 더 큰 입자가 사이징 정확도에 미치는 영향은 거의 없지만, 미세한 양의 크고 높은 광산란 입자가 존재하면 소프트웨어 EV 검출 및 추적 감소로 인해 더 작은 입자의 검출이 현저하게 감소합니다⁸. 측정 기술로서, NTA는 일반적으로 더 큰 입자 또는 입자의 응집체에 편향되지 않는 것으로 간주되지만 개별 입자 분석⁽⁹)을 통해 다중 크기 집단을 해결할 수 있다. 입자에 의한 광산란의 사용으로 인해 NTA 분석의 한계 중 하나는 EV와 비교하여 유사한 굴절 및 크기 특성을 가진 먼지, 플라스틱 또는 분말과 같은 미립자가 이러한 특성화 방법으로 실제 EV와 구별 될 수 없다는 것입니다.

NanoSight LM10 (나노 입자 크기 분석기) 및 LM14 (레이저 모듈)는 2006 년부터 판매되었으며이 기기의 새로운 모델이 개발되었지만이 특정 모델은 많은 핵심 시설에서 발견되며 신뢰할 수있는 작업으로 간주됩니다. 크기와 농도의 고해상도 측정을 위해 NTA 설정을 적절하게 최적화하려면 교육이 필요합니다. 최적의 비디오 녹화에 필요한 두 가지 중요한 설정은 (1) 카메라 레벨과 (2) 감지 임계값입니다. 이는 작업자가 샘플의 특성에 따라 설정해야 합니다. NTA 분석의 주요 제약 조건 중 하나는 10⁷ ~ 10 9 입자 / mL 사이의 샘플 농도^를 권장하는 것이며,이 샘플 희석을 달성하기 위해서는¹⁰이 필요할 수 있습니다. 인산염 완충 식염수, 0.15M 식염수 또는 초순수와 같은 희석에 사용되는 용액은 크기가 220μm 미만인 입자가 거의 없어 NTA 측정에 영향을 줄 수 있습니다. 희석에 사용되는 용액의 NTA 특성화는 분석되는 나노입자 샘플과 동일한 카메라 레벨 및 검출 임계값에서 수행되어야 한다. EV 샘플 희석에 사용되는 희석제에 존재하는 나노입자의 크기 및 농도는 EV의 NTA 분석을 포함하는 간행물에 거의 포함되지 않는다.

이 프로토콜은 선택된 카메라 레벨, 검출 임계값 및 샘플의 기계적 필터링을 사용하여 평가된 합성 EV 유사 리포좀의 NTA 분석을 사용하여 NTA 데이터 세트에 대한 카메라 레벨, 검출 임계값 또는 샘플 여과의 체계적인 영향을 분석합니다. 리포솜은 보충 파일 S1에 기재된 바와 같이 합성되었다. 합성 리포좀은 4°C에서 보관시 크기 균일성, 물리적 특성 및 안정성 때문에 본 실험에 사용되었다. EV의 실제 샘플이 사용될 수 있었지만, 저장 중 EV의 이질성과 안정성은이 연구와 해석을 복잡하게 만들 수 있습니다. (A) 리포솜과 (B) EV의 NTA 보고서의 유사성은 이 논문에서 리포솜에 대해 밝혀진 체계적인 효과가 EV 특성화에도 적용될 가능성이 높다는 것을 나타낸다(그림 1). 이러한 결과는 중요한 소프트웨어 설정에 대한 완전한 보고와 희석제, 희석 및 여과와 같은 샘플 처리에 대한 설명이 NTA 데이터의 재현성에 영향을 미친다는 개념을 지원합니다.

이 논문의 목적은 NTA 설정(온도, 카메라 레벨 및 검출 임계값)과 샘플 준비에 따라 수집된 결과가 변경된다는 것을 입증하는 것입니다: 체계적이고 크기 및 농도의 유의한 차이가 얻어졌다. NTA는 MISEV2018 특성화 사양을 충족하는 데 널리 사용되는 옵션 중 하나이므로 이러한 결과는 재현성을 보장하기 위해 샘플 준비 및 NTA 설정을 보고하는 것이 중요하다는 것을 보여줍니다.

그림 1: 리포좀과 EV를 비교하기 위한 대표적인 NTA 보고서. (A) 리포솜: 2020년 3월 12일 NTA에 특징지어지는 여과되지 않은 샘플. (B) EVs: 2021년 8월 26일에 NTA에 특징지어지는 여과되지 않은 샘플. 약어: NTA = 나노입자 추적 분석; EVs = 세포밖 소포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜

1. 일반 프로토콜 지침

1. 현미경을 공기 테이블 위에 유지하거나 진동이 없는 테이블에 최소한 유지하십시오. 외부 진동 (예 : 바닥에서 발 두드리기, 테이블 만지기, 문 닫힘, 실험실 교통)이 최소한으로 유지되도록하십시오.
2. 레이저 모듈의 온도를 모든 비디오 녹화에 대해 일정한 온도로 설정하고 유지하십시오.
   참고: 선택한 온도는 25°C였는데, 이는 나노입자 크기 분석기가 그 온도에서 교정되었기 때문입니다. 따라서 계측기의 모든 사용자가 보정된 온도를 알고 사용하는 것이 중요합니다. 실내 온도는 다양 할 수 있기 때문에 허용 할 수있는 설정이 아닙니다.
3. 음성 대조군(예: 둘베코의 인산염 완충 식염수(DPBS), 초순수 증류수[DW])이라고도 하는 모든 희석제가 모두 측정되는 나노입자 샘플과 동일한 카메라 수준 및 검출 임계값을 사용하여 NTA로 특성화되었는지 확인하십시오. 레이저 모듈의 플러싱 및 샘플의 희석을 위해 특성화된 DPBS를 사용하십시오. 음성 대조군 DPBS의 인자 오염물질은 그들의 수준이 유의한 경우 샘플 결과로.
4. 평가 전에 샘플을 4°C에 보관하고 리포좀 샘플을 분해하므로 절대로 동결시키지 마십시오. 분석 전에 샘플/표준/희석제를 30분 동안 실온으로 가온합니다.
   참고: 샘플 취급은 검사 중인 재료에 따라 다릅니다.
5. NTA 분석에 최적으로 결정된 10⁷ ~ 10⁹ 입자 / mL (약 50 ~ 100 입자 / NTA 비디오 스크린)를 얻기 위해 적절한 희석을 설정하기 위해 빠른 측정을 사용하여 샘플 및 표준을 평가하십시오.
   참고 : 저자들은 이 범위의 더 높은 끝에있는 입자 농도가보다 일관되고 재현 가능한 결과를 산출한다는 것을 발견했습니다.
6. 사용된 희석액 및 희석제를 포함하여 빠른 및 표준 측정을 위해 SOP 탭의 캡처 상자 내에 적용 가능한 모든 필드를 채웁니다.

2. 50nm 및 100nm 크기 교정 표준의 제조

참고: 재료 표를 참조하십시오.

1. 50nm 크기 전송 표준 희석 1:5,000
   1. 초순수 DW에서 0.22 μm로 여과된 10 mM 염화칼륨(KCl)/0.03% 트윈 20의 9,998 μL에 50 nm 표준물질 2 μL를 2회 헹구어 15 mL 코니컬 튜브에 첨가한다. 희석된 50 nm 표준을 4°C에서 최대 일 년 동안 보관한다.
2. 100 nm 크기 전송 표준 희석 1:333
   1. 초순수 DW에서 0.22 μm로 여과된 10 mM KCl/0.03% 트윈 20의 9,970 μL에 100 nm 표준의 30 μL를 두 번 헹구어 낸 15 mL 코니컬 튜브에 첨가한다. 희석된 100 nm 표준을 4°C에서 최대 1년 동안 보관한다.

3. 레이저 모듈의 청소 및 조립

1. 레이저 모듈과 플로우 셀 커버 창문에 긁힘이나 결함이 있는지 육안으로 검사합니다.
   참고: 두 유리 표면 중 하나가 긁힌 경우 이미징에 영향을 줄 수 있습니다.
2. 좋은 품질의 렌즈 클리너와 렌즈 종이로 두 유리 표면을 부드럽게 청소하십시오. 유리 표면에 티슈 와이프나 종이 타월을 사용하지 마십시오.
3. 조립하기 전에 O-링 씰이 플로우셀 커버의 홈에 제대로 장착되었는지 확인하십시오.
4. 유동 셀 커버를 레이저 모듈 위에 놓고 전기 접점이 올바른 방향에 있는지 확인합니다. 스프링이 장착된 손잡이 나사 4개를 유동 셀 플레이트에 넣고 레이저 모듈의 나사를 맞물지만 개별적으로 조이지는 마십시오.
5. 플로우 셀 커버에 균일한 압력을 가하고 꼭 맞을 때까지 대각선 방식으로 손잡이 나사를 균일하게 조입니다. 손가락이 꽉 조일 때까지 손잡이 나사만 조이십시오. 너무 조이지 마십시오.
   참고: 손잡이 나사를 고르지 않게 조이면 레이저 모듈 표면이 깨질 수 있습니다. 새로 설계된 손잡이 나사는 적절한 압력에서 "바닥으로"나가 과도한 조임을 피할 수 있습니다.

4. 샘플 전과 샘플 사이의 레이저 모듈에 대한 플러싱 절차

1. DPBS와 분취량의 새로 열린 용기를 사용하여 트리플 헹굼 된 15 mL 폴리 프로필렌 튜브에 넣으십시오. 샘플을 플러시하거나 희석하는 데 사용되는 제품이 사용 전에 NTA 특성화되었는지 확인하십시오(1.3단계 참조).
2. 1mL 튜버큘린 주사기 두 개를 슬립 락 어댑터로 3회 플러시하여 DPBS 1mL와 함께 미립자 잔여물을 제거합니다. 두 포트 중 하나를 입력으로 사용하지만 실험 중에 일관되게 사용합니다. 주사기의 무게와 크기 증가로 인해 주사기 포트가 파손 될 위험이 있으므로 더 큰 주사기를 사용하지 마십시오.
3. 1^st tuberculin 주사기에서 플런저를 제거하고 버리고 나머지 포트에 삽입하여 빈 희석제 / 샘플 저장소로 사용하십시오.
   참고: 플런저를 제거하지 않으면 샘플 챔버의 압력이 증가하고 씰 주위가 누출됩니다.
4. 2^번째 주사기를 DPBS 1mL로 채우고 플로우 셀 커버의 입구 포트에 부착합니다.
5. DPBS가 레이저 모듈에 천천히 주입될 때 챔버에서 공기가 정화될 수 있도록 출구 주사기 포트를 상승된 상태에서 기울어진 레이저 모듈을 잡으십시오.
6. 1mL의 공기를 입구 포트에 주입하여 레이저 모듈에서 나머지 DPBS를 플러시합니다. 플러싱을 2 번 더 반복하십시오.
7. 마지막 플러시 후 레이저 모듈을 가능한 한 완전히 비우십시오.
   참고: 이러한 입자가 레이저 모듈에서 지속되기 때문에 50nm 표준에 대한 NTA 분석 후 철저하고 신중한 플러싱이 필요합니다. 이제 레이저 모듈을 사용할 준비가 되었습니다.

5. 현미경 단계에 레이저 모듈의 배치

1. 현미경의 암에 있는 레이저 모듈 초점 정렬 가이드(그림 2)를 찾아 초점 노브를 사용하여 정렬합니다.

그림 2: 레이저 모듈 초점 정렬 가이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 현미경을 마주보고 레이저 모듈을 홈이 있는 스테이지에 놓고 가능한 한 오른쪽으로 부드럽게 밀어 넣습니다.
   참고: 신중하게 수행하면 정렬 및 초점 스폿을 샘플 간에 쉽게 찾을 수 있습니다.
3. 레이저 컨트롤 박스의 로커 스위치를 켭니다.

6. 레이저 모듈의 초점과 위치 지정

참고 : 이것은 챔버의 유체로 수행되어야합니다.

1. 데스크탑에서 NTA 소프트웨어( 자료 표 참조)를 로드합니다.
   참고: "COM3에서 온도 H/W를 찾을 수 없습니다." 오류가 나타날 수 있습니다. 소프트웨어를 닫았다가 다시 열어 문제를 해결하기만 하면 됩니다.
2. 왼쪽 위 모서리 상자의 캡처 탭에서 카메라 시작을 클릭합니다. 5분 후에 카메라가 자동으로 꺼지면 카메라 시작을 다시 클릭하여 다시 시작하십시오.
3. 동일한 탭에서 카메라 레벨 을 14에서 16으로 조정하여 레이저 라인을 밝게하고 입자 식별 및 초점을 단순화하십시오.
4. 헤드피스의 왼쪽에 있는 상단 슬라이더를 안팎으로 이동하여 카메라에서 아이피스로 이미지를 전환합니다.
5. 일반적으로 지문이라고 하는 증가된 밀도의 영역을 찾습니다. 시야각에서 지문을 세로로 가운데에 맞추고 초점을 맞춥니다.
   참고: 레이저 라인은 지문의 왼쪽에 있습니다. 방을 어둡게하면 지문을 찾고 레이저 라인에 초점을 맞추는 데 도움이 될 수 있습니다.
6. 레이저 라인을 시야에 중심을 맞추십시오. 상단 슬라이더를 움직여 컴퓨터 화면에서 볼 수 있는 대로 빛을 카메라로 전환합니다.
   참고 : 이제 화면에 보이는 레이저 라인은 아이피스보기의 거울 이미지입니다. 아이피스의 왼쪽은 컴퓨터 화면에 오른쪽입니다.
7. 초점을 조정하여 초점 노브로 화면에서 움직이는 개별 파티클의 이미지를 선명하게 합니다.
   참고 : 초점의 깊이로 인해 모든 입자가 초점이 맞지 않으므로 수용 할 수 있습니다. 초점이 약간 맞지 않는 입자조차도 카메라에 의해 캡처되어 소프트웨어에 의해 분석됩니다.

7. NTA 분석을 위한 레이저 모듈에 표준 / 샘플 / 희석제 로딩

1. 헹굼된 1mL의 튜버큘린 주사기에 표준/샘플/희석제 1mL를 뽑아 유동 세포 덮개의 입구 포트에 부착합니다. 출구 포트에 부착된 개방 주사기에서 유체가 뚜렷해질 때까지 플런저를 전진시킨다.
2. 카메라 뷰에서 레이저 라인의 오른쪽으로 이동하여 균일한 수의 입자 영역으로 이동합니다. 필요한 경우 수직 방향을 조정하여 수평 빛의 밴드를 가운데에 맞춥니다. 가장 많은 수의 파티클이 표시될 때까지 다시 초점을 맞춥니다. 모든 후속 조치에 대해이 위치가 가능한 한 가깝게 유지되도록하십시오.
3. 카메라 뷰의 오른쪽 상단에서 어두운 정보 기호가 간헐적으로 켜지고 꺼지는 지점으로 카메라 레벨을 조정합니다.
   참고: 이렇게 하면 각 데이터 수집 계열의 최소 감도 수준에서 일관된 카메라 수준 선택이 이루어지도록 할 수 있습니다.
   참고: 캡처 하는 동안 카메라 레벨 을 변경할 수 없습니다.

8. 교정의 검증

참고: 샘플 분석 전에 크기 표준(섹션 2 참조)을 사용하여 모듈 교정의 유효성을 검사하는 것이 좋습니다. 정확한 측정을 보장하기 위해서는 일상적인 검증이 필요합니다. 다중 사용자 실험실에서 소프트웨어 구성 설정을 개별적으로 조정하면 실수로 부정확한 데이터 수집이 발생할 수 있습니다. 중요한 데이터 수집의 경우 일일 검증은 훌륭한 실험실 관행의 문제입니다. 검증의 일상적인 재현성은 보고된 결과에 포함되어야 합니다. 일반적으로 교정은 기술자에 의해 설정되며 사용자가 관리자 액세스 권한을 갖지 않는 한 개별 사용자가 조정할 수 없습니다. 이렇게 하면 개별 사용자의 무단 재구성을 방지할 수 있습니다.

1. 희석 표준물질 (섹션 2 참조)을 30 분 동안 실온으로 따뜻하게하십시오.
2. 표준을 간략하게 와류한 다음 섹션 7에 설명된 대로 로드합니다.
3. 섹션 10에 설명된 대로 샘플 NTA를 수행하고 변동 계수의 후속 계산을 위해 값을 기록하며, 올바르게 보정된 경우 2% 미만이어야 합니다.

9. NTA에 대한 시료 농도 최적화

참고: 카메라 레벨과 샘플 농도가 적절하게 조정될 때 화면에는 측정 가능한 입자가 50~100개 포함되어야 합니다. 샘플에 적절한 입자 번호가 있는지 여부에 대한 질문이 있는 경우 이 시점에서 샘플에서 빠른 측정 을 실행할 수 있습니다(9.1~9.7단계 참조). 더 긴 비디오 캡처 전에 샘플 특성을 신속하게 평가하는 데 사용됩니다. 빠른 측정 탭은 하단 중간 상자의 SOP 탭에 있습니다.

1. 캡처 지속 시간을 30초로 설정합니다.
2. 기존 기본 파일 이름을 적용하거나 생성된 데이터에 대한 새 저장소 사이트의 ... 탭을 클릭하여 새 파일 이름을 입력합니다.
3. 목표 온도 확인란을 선택하고 원하는 온도를 입력합니다.
4. 앞에서 설명한 대로 샘플을 로드하고(7.1단계) 스크립트 만들기 및 실행을 클릭합니다.
5. 30 초 비디오가 완료된 후 비디오 화면의 오른쪽 하단에 프레임 당 입자 수가 표시 될 때까지 기다리십시오. 입자 수가 100보다 크면 레이저 모듈을 3회 플러시합니다(단계 4.6에서 앞서 설명한 대로).
6. 특성화된 희석제를 사용하여 샘플을 원하는 농도 범위로 희석한다.
7. 적절하게 희석된 샘플을 플러싱된 레이저 모듈에 로드하고 빠른 측정 을 실행하여 샘플이 허용 범위 내에 있는지 확인합니다.

10. 샘플 NTA

참고: 표준 측정 탭은 하단 중간 상자의 SOP 탭 내에 있으며 일상적인 샘플 분석에 사용됩니다(10.1~10.12단계 참조).

1. 지속 시간을 30초 또는 60초 로 설정하고 동영상 수를 5로 설정합니다.
2. 기존 기본 파일 이름을 적용하거나 생성된 데이터에 대한 새 저장소 사이트의 ... 탭을 클릭하여 새 파일 이름을 입력합니다.
3. 목표 온도 확인란을 선택하고 원하는 온도를 입력합니다.
4. 스크립트 생성을 클릭하여 이 표준 측정을 재사용합니다.
5. 섹션 7에 설명된 대로 샘플이 로드되고 실험을 실행할 준비가 되면 스크립트 만들기 및 실행을 클릭합니다.
6. 보고서 세부 정보 설정 팝업 화면의 필드에 연산자, 샘플 설명, 샘플 희석 및 사용된 희석제에 대한 정보를 입력합니다.
   참고: 이 정보는 최종 실험 보고서에 기록되고 인쇄됩니다.
7. 원하는 필드가 모두 채워지면 확인을 클릭하여 스크립트를 시작합니다.
   참고: 목표 온도를 선택한 경우 히터는 스크립트가 측정을 진행하기 전에 레이저 모듈의 샘플을 5초 동안 원하는 온도로 안정화합니다. 화면의 왼쪽 하단에있는 진단 패널은 HEATER ON을 읽고 샘플의 온도를 표시합니다.
8. 각 비디오 캡처 전에 플런저를 수동으로 진행 하라는 프롬프트를 찾습니다. ~ 0.05 mL의 샘플을 레이저 챔버에 주입하고 입자가 "휴식"(즉, 흐르지 않음)에 도달하도록하고 확인을 클릭하십시오.
9. 5^번째 비디오 캡처가 완료되면 설정 확인 상자가 나타나고 프로세스 상자가 깜박일 때까지 기다립니다. 비디오 화면 하단에서 프레임이 수동으로 진행될 때 화면에 파티클을 표시하는 파란색 십자선의 수를 기록하여 샘플 처리를 위한 감지 임계값을 설정합니다. 프레임이 진행됨에 따라 각 화면에 파티클을 표시하는 파란색 십자선이 3-4개 이상 있는 경우 감지 임계값을 높입니다.
   참고: 개별 입자의 파란색 십자가는 유세포 분석기의 "떼" 효과와 유사하며 데이터 수집의 최적 정확성과 재현성을 위해 최소화해야 합니다.
10. 검색 임계값이 허용되는 경우 설정 확인을 클릭합니다.
11. 확인을 클릭하기 전에 비디오가 자동으로 처리되고 결과 히스토그램 및 완료에 대한 대화 상자 알림이 표시 될 때까지 기다리십시오.
12. 내보내기 설정 상자가 나타나면 내보내기를 클릭하여 결과를 저장합니다.
    참고: 비디오 및 분석의 모든 결과는 10.2단계에서 정의된 대상 파일에 저장됩니다. 이를 위해서는 많은 양의 저장소가 필요합니다. 필요에 따라 보조 저장 장치를 모니터링하고 전송합니다.

11. 다른 검출 임계값에서 현재 샘플의 재분석

참고: NTA 분석 직후(단계 10), 다른 감지 임계값 설정을 사용하여 데이터를 다시 분석할 수 있습니다. 그러나 캡처 후 카메라 레벨 은 수정할 수 없습니다.

1. 현재 실험에 나열된 캡처 비디오 5개를 모두 강조 표시합니다.
2. 선택한 파일 처리를 클릭하고 설정 확인 상자가 나타나고 프로세스 상자가 깜박일 때까지 기다렸다가 감지 임계값을 변경합니다.
3. 감지 임계값을 원하는 수준으로 조정하고 설정 확인을 클릭합니다.
4. 확인을 클릭하기 전에 비디오가 자동으로 처리되고 결과 히스토그램 및 완료에 대한 대화 상자 알림이 표시 될 때까지 기다리십시오.
5. 설정 내보내기를 클릭합니다. 가장 최근 샘플에 대해 추가 평가가 수행되는 경우 샘플 재분석 후 결과 내보내기 팝업 상자가 표시되지 않으므로 현재 실험에서 결과 내보내기 상자를 클릭해야 합니다.
   참고 :이 작업을 수행 할 알림이 없으므로 쉽게 간과 할 수 있으며 분석이 손실됩니다. 그러나 기본 데이터는 그대로 유지되며 나중에 다시 분석할 수 있습니다.

12. 보관된 파일 분석

참고: 이전에 분석한 실험이 저장되지 않았거나 이러한 샘플에서 추가 분석을 수행해야 하는 경우 추가 탐지 임계값 평가를 위해 개별 파일을 NTA 소프트웨어로 다시 로드할 수 있습니다. 카메라 레벨 변경 사항은 캡처 후 수정할 수 없습니다.

1. 데스크톱에서 NTA 소프트웨어를 로드합니다.
2. 아래쪽 중간 패널에서 분석 탭을 클릭합니다.
3. 실험 열기를 클릭하고 원하는 .nano 파일로 이동합니다.
   참고: 선택한 .nano 실험과 관련된 비디오 파일은 기본 실험 파일과 동일한 폴더에 있어야 합니다. 그렇지 않으면 파일을 처리하려고 할 때 오류가 나타납니다. 파일 이름의 처음 6자리는 실험이 실행된 날짜(xx-xx-xx)입니다. 파일 이름의 마지막 6자리는 비디오가 녹화된 시간(xx-xx-xx)과 개별 비디오 식별자입니다. 결합된 각 실험의 PDF 파일에는 해당 분석에 포함된 .nano 파일이 나열됩니다.
4. 선택한 파일 처리를 클릭하여 분석을 실행합니다.
5. 검색 임계값의 변경을 허용하도록 프로세스 상자가 깜박이면 임계값을 원하는 수준으로 설정하고 확인을 클릭합니다.
6. 확인을 클릭하기 전에 비디오가 자동으로 처리되고 결과 히스토그램 및 완료에 대한 대화 상자 알림이 표시 될 때까지 기다리십시오.
7. 결과 내보내기를 클릭합니다. 재분석 후 결과 내보내기 팝업 상자가 표시되지 않으므로 현재 실험에서 결과 내보내기 상자를 클릭해야 합니다.
   참고 :이 작업을 수행 할 알림이 없으므로 쉽게 간과 할 수 있으며 분석이 손실됩니다.

13. 레이저 모듈의 청소 및 분해

1. 레이저 컨트롤 박스를 끕니다.
2. 레이저 모듈에서 전체 샘플을 플러시하고 올바르게 폐기하십시오.
3. DPBS가 레이저 모듈에 천천히 주입되고 출구 주사기 포트에서 플러시될 때 챔버에서 공기가 정화될 수 있도록 개방된 주사기 포트로 기울어진 레이저 모듈을 잡으십시오.
4. 레이저 모듈에서 나머지 DPBS를 플러시하고 버립니다.
5. 플러싱을 2번 더 반복하고 마지막 플러시 후 레이저 모듈을 가능한 한 완전히 비우십시오.
6. 플로우 셀 커버에 균일한 압력을 가하고, 나사에서 분리될 때까지 대각선 방식으로 손잡이 나사를 균일하게 풀고, 손잡이 나사를 제거하고, 레이저 모듈 케이스에 보관합니다.
7. 레이저 모듈에서 플로우 셀 커버를 분리합니다.
8. 좋은 품질의 렌즈 클리너와 렌즈 종이로 두 유리 표면을 부드럽게 청소하십시오. 유리 표면에 티슈 페이퍼나 종이 타월을 사용하지 마십시오.
9. 레이저 모듈과 플로우 셀 커버 "창"을 육안으로 검사하여 사용 후 긁힘이나 결함이 있는지 검사하고 감독자에게보고하십시오.
10. 레이저 모듈과 플로우 셀 커버를 케이스에 교체하여 보관 중 유리 표면이 손상되지 않도록 하십시오.

14. 시료 분석 프로토콜

1. 필터링되지 않은 샘플
   1. 로드하기 전에 샘플을 볼텍스하고 위에서 설명한 대로 카메라 레벨 12 및 감지 임계값 레벨 3에서 5 x 60초 비디오를 녹화합니다. 감지 임계값 2 및 5를 사용하여 이러한 비디오를 다시 분석합니다.
   2. 카메라 레벨 13 및 14 및 감지 임계값 레벨 3에서 동일한 샘플의 비디오 수집을 반복합니다. 감지 임계값 2 및 5를 사용하여 이러한 2개의 추가 비디오를 다시 분석합니다. SOP 설정에서 5 x 30 s 비디오를 사용하여 전체 프로세스를 반복하십시오.
2. 필터링된 샘플
   1. 샘플을 볼텍스 한 다음 동시에 로딩하고 여과하십시오 (0.22 μm 주사기 필터) 레이저 모듈에 직접 삽입하십시오.
      참고: 주사기 필터는 상주 미립자를 제거하기 위해 사용하기 전에 필터 데드 스페이스의 2배 부피로 플러시되었습니다. 주사기 필터 ( 물질 표 참조)는 0.5 mL의 측정된 데드 스페이스를 가지며, 측정 전에 1.0 mL의 샘플로 플러싱되었다. SOP 데이터 필드에서 필터 유형을 기록해 둡니다. 여과된 샘플은 단계 14.1에서 여과되지 않은 샘플에 대해 설명된 대로 정확하게 처리되었다.

15. NTA 결과의 통계 분석

1. 주효과 또는 상호 작용의 분석을 위해, ANOVA 가정(정상성, 단모달, 분산의 동질성)의 확인에 따라 분산 분석을 수행하십시오. ANOVA 가정이 실패한 경우 Kruskal-Wallis 단방향 ANOVA를 순위에 사용하십시오.
2. 중요한 주효과가 반환 된 후 Dunn의 방법을 사용하여 미리 계획된 비교를위한 평균 테스트를 수행하십시오. p-값 0.05가 두 꼬리 테스트에서 유의하다고 생각하십시오.
   참고: 여기에 생성된 데이터 파일은 자재 이전 계약이 완료된 후 작성자로부터 사용할 수 있습니다.

결과

표 1 은 리포좀 샘플(18개의 여과 및 18개의 여과되지 않은) 및 대표적인 DPBS 희석제에 대한 NTA 비디오의 결과를 함유한다. 두 그룹에 걸친 비교는 이 백서의 카메라 레벨 또는 감지 임계값에 관계없이 완료되었습니다. 여과된 샘플은 평균 입경이 108.5nm, 입자 모드가 86.2nm, 농도가 7.4 ×^10,8 입자/mL였다. 대조적으로, 여과되지 않은 샘플은 평균 입자 직경이 159.1 nm, 입자 모드가 105.7 ...

토론

나노입자⁽¹¹)의 크기 및 농도를 추정하기 위해 이용가능한 몇 가지 방법이 있다. 여기에는 동적 광 산란 (DLS), 원심 침강 및 단일 입자 레벨 분석 - 전자 현미경, NTA, 원자력 현미경 및 조정 가능한 저항 펄스 감지를 포함하여 집단으로부터 크기 추정치를 생성하는 앙상블 방법이 포함됩니다. 이 중 DLS와 NTA는 이상적인 매질에서의 브라운 운동을 기반으로 한 비파괴 크기 및 농도 측?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic Pipetter
Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL	Thermo Sci.	339650
Kimwipes
Lens Cleaner
Lens Paper
NanoSight LM-10	Malvern Panalytical
NanoSight LM-14 Laser Module	Malvern Panalytical
Nanosight NTA Software Ver. 3.2	Malvern Panalytical
Paper Towels
Pipette Tips, 1-200 µL, Filtered, Sterile, Low Binding	BioExpress	P -3243-200X
Pipette Tips, 50-1,000 µL, Filtered, Sterile	BioExpress	P-3243-1250
Saline, Dulbecco's Phosphate Buffered (No Ca or Mg)	Gibco	14190-144
Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL)	Malvern	NTA4088
Standards, Latex Transfer- 50 nm  (3 mL)	Malvern	NTA4087
Syringe Filter, 33 mm, .22 µm, MCE, Sterile	Fisher brand	09-720-004
Syringe, TB, 1 mL, slip tip	Becton Dickinson	309659
Waste fluid container