Verbesserung der Reproduzierbarkeit, um minimale Informationen für Studien zu extrazellulären Vesikeln zu erfüllen Richtlinien 2018 in der Nanopartikel-Tracking-Analyse

Zusammenfassung

Die Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) ist eine weit verbreitete Methode zur Charakterisierung extrazellulärer Vesikel. Dieses Papier hebt NTA-experimentelle Parameter und Kontrollen sowie eine einheitliche Methode zur Analyse und Charakterisierung von Proben und Verdünnungsmitteln hervor, die notwendig ist, um die von MISEV2018 und EV-TRACK vorgeschlagenen Richtlinien für die Reproduzierbarkeit zwischen Laboratorien zu ergänzen.

Zusammenfassung

Die Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) ist seit 2006 eine von mehreren Charakterisierungsmethoden, die für die extrazelluläre Vesikelforschung (EV) eingesetzt werden. Viele sind der Meinung, dass NTA-Instrumente und ihre Softwarepakete nach minimaler Schulung leicht verwendet werden können und dass die Größenkalibrierung intern möglich ist. Da sowohl die NTA-Akquisition als auch die Softwareanalyse eine EV-Charakterisierung darstellen, werden sie in Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV2018) behandelt. Darüber hinaus wurden sie durch Transparent Reporting and Centralizing Knowledge in Extracellular Vesicle Research (EV-TRACK) überwacht, um die Robustheit von EV-Experimenten zu verbessern (z. B. Minimierung der experimentellen Variation aufgrund unkontrollierter Faktoren).

Trotz der Bemühungen, die Berichterstattung über Methoden und Kontrollen zu fördern, berichten viele veröffentlichte Forschungsarbeiten nicht über kritische Einstellungen, die zur Reproduktion der ursprünglichen NTA-Beobachtungen erforderlich sind. Nur wenige Artikel berichten über die NTA-Charakterisierung von Negativkontrollen oder Verdünnungsmitteln, wobei offensichtlich davon ausgegangen wird, dass kommerziell erhältliche Produkte, wie phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder ultrareines destilliertes Wasser, frei von Partikeln sind. In ähnlicher Weise werden Positivkontrollen oder Größenstandards selten von Forschern berichtet, um die Partikelgröße zu überprüfen. Die Stokes-Einstein-Gleichung enthält Probenviskositäts- und Temperaturvariablen, um die Partikelverschiebung zu bestimmen. Die Meldung der stabilen Laserkammertemperatur während der gesamten Probenvideoentnahme ist daher eine wesentliche Kontrollmaßnahme für eine genaue Replikation. Die Filtration von Proben oder Verdünnungsmitteln wird ebenfalls nicht routinemäßig gemeldet, und wenn ja, werden die Besonderheiten des Filters (Hersteller, Membranmaterial, Porengröße) und Lagerbedingungen selten berücksichtigt. Die Mindeststandards der International Society for Extracellular Vesicle (ISEV) für akzeptable experimentelle Details sollten ein gut dokumentiertes NTA-Protokoll für die Charakterisierung von EVs enthalten. Das folgende Experiment liefert den Nachweis, dass ein NTA-Analyseprotokoll vom einzelnen Forscher erstellt und in die Methoden von Publikationen einbezogen werden muss, die die NTA-Charakterisierung als eine der Optionen zur Erfüllung der MISEV2018-Anforderungen für die Charakterisierung einzelner Vesikel verwenden.

Einleitung

Die genaue und wiederholbare Analyse von Elektrofahrzeugen und anderen nanometerskaligen Partikeln stellt Forschung und Industrie vor zahlreiche Herausforderungen. Die Replikation der EV-Forschung war schwierig, zum Teil aufgrund der mangelnden Einheitlichkeit bei der Berichterstattung über die notwendigen Parameter im Zusammenhang mit der Datenerhebung. Um diese Mängel zu beheben, schlug das ISEV Industrierichtlinien als minimale Reihe von biochemischen, biophysikalischen und funktionellen Standards für EV-Forscher vor und veröffentlichte sie als Positionspapier, das allgemein als MISEV2014^{1 bezeichnet wird}. Das beschleunigte Tempo der EV-Forschung erforderte eine aktualisierte Richtlinie, und die "MISEV2018: eine Stellungnahme des ISEV" erweiterte die MISEV2014-Richtlinien². Das MISEV2018-Papier enthielt Tabellen, Umrisse der vorgeschlagenen Protokolle und Schritte, die zu befolgen sind, um die spezifische EV-assoziierte Charakterisierung zu dokumentieren. Als weitere Maßnahme zur Erleichterung der Interpretation und Replikation von Experimenten wurde EV-TRACK als Crowdsourcing-Wissensdatenbank (http://evtrack.org) entwickelt, um eine transparentere Berichterstattung über die EV-Biologie und die für die veröffentlichten Ergebnisse verwendete Methodik^{zu ermöglichen 3}. Trotz dieser Empfehlungen für eine standardisierte Berichterstattung über Methoden leidet das Feld weiterhin unter der Replikation und Bestätigung der veröffentlichten Ergebnisse.

Passend zu den Bemühungen der National Institutes of Health und der National Science Foundation um Qualitätsbewertungsinstrumente schlägt dieses Papier vor, dass ISEV eine standardisierte Berichterstattung über Methoden und Details erfordert, damit Datenbewertungsinstrumente mit dem Ziel angewendet werden können, Ergebnisse zwischen Labors zu replizieren. Die Meldung von Zellquellen, Zellkulturverfahren und EV-Isolationsmethoden sind wichtige Faktoren, um die Qualitäten der EV-Population zu definieren. Unter den NTA-Instrumenten erschweren Faktoren wie Detektionseinstellungen, der Brechungsindex von Trägerflüssigkeit, heterogene Partikelpopulationen, die zur Polydispersität beitragen, das Fehlen standardisierter Berichtspflichten und fehlende Intra- und Inter-Beobachter-Messergebnisse den NTA-Vergleich zwischen Labors.

NTA wird seit 2006 verwendet und ist eine beliebte Methode zur Bestimmung der Größe und Konzentration von Nanopartikeln, die derzeit von etwa 80% der EV-Forscher^{verwendet wird 4}. Die MISEV2018-Richtlinien erfordern zwei Formen der Einzelvesikelanalyse, von denen NTA eine der beliebtesten Optionen ist. NTA wird aufgrund seiner breiten Zugänglichkeit, der niedrigen Kosten pro Probe und seiner einfachen Gründungstheorie (der Stokes-Einstein-Gleichung) weiterhin häufig für die EV-Charakterisierung verwendet. Die EV-Bewertung durch NTA generiert eine Partikelgrößenverteilung und -konzentrationsschätzung unter Verwendung von Laserlichtstreuung und Brownscher Bewegungsanalyse, wobei die untere Nachweisgrenze durch den Brechungsindex des EV bestimmt wird. Bei Verwendung einer Flüssigkeitsprobe mit bekannter Viskosität und Temperatur werden die Flugbahnen der EVs verfolgt, um ihre mittlere quadratische Verschiebung in zwei Dimensionen zu bestimmen. Dadurch kann der Partikeldiffusionskoeffizient berechnet und durch eine modifizierte Stokes-Einstein-Gleichung ^5,6,7 in einen kugeläquivalenten hydrodynamischen Durchmesser umgewandelt werden. Die Partikel-zu-Partikel-Analyse von NTA hat weniger Interferenzen durch Agglomerate oder größere Partikel in einer heterogenen Population von EVs als andere Charakterisierungsmethoden⁷. Während einige größere Partikel nur minimale Auswirkungen auf die Größengenauigkeit haben, führt das Vorhandensein selbst winziger Mengen großer, lichtstreuender Partikel zu einer deutlichen Verringerung der Erkennung kleinerer Partikel aufgrund der reduzierten Software-EV-Erkennung und -Verfolgung⁸. Als Messtechnik wird allgemein angenommen, dass NTA nicht auf größere Partikel oder Aggregate von Partikeln ausgerichtet ist, sondern mehrere Populationen durch individuelle Partikelanalyse auflösen^{kann 9}. Aufgrund der Verwendung der Lichtstreuung durch Partikel besteht eine der Einschränkungen der NTA-Analyse darin, dass Partikel wie Staub, Kunststoff oder Pulver mit ähnlichen Brechungs- und Größeneigenschaften im Vergleich zu Elektrofahrzeugen durch diese Charakterisierungsmethode nicht von tatsächlichen Elektrofahrzeugen unterschieden werden können.

Der NanoSight LM10 (Nanopartikelgrößenanalysator) und der LM14 (Lasermodul) werden seit 2006 verkauft, und obwohl neuere Modelle dieses Instruments entwickelt wurden, ist dieses spezielle Modell in vielen Kerneinrichtungen zu finden und gilt als zuverlässiges Arbeitstier. Es ist eine Schulung erforderlich, um die NTA-Einstellungen für hochauflösende Größen- und Konzentrationsmessungen richtig zu optimieren. Die beiden wichtigsten Einstellungen, die für optimale Videoaufnahmen benötigt werden, sind (1) die Kameraebene und (2) die Erkennungsschwelle. Diese müssen vom Bediener auf der Grundlage der Eigenschaften der Probe eingestellt werden. Eine der Haupteinschränkungen der NTA-Analyse ist die Empfehlung von Probenkonzentrationen zwischen 10 7 und 10^{9 Partikeln} / ml, um diese Probenverdünnung zu erreichen,^{kann eine 10} erforderlich sein. Lösungen, die zur Verdünnung verwendet werden, wie phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 0,15 M Kochsalzlösung oder Reinstwasser, sind selten frei von Partikeln mit einer Größe von weniger als 220 μm, was die NTA-Messungen beeinflussen kann. Die NTA-Charakterisierung der für die Verdünnung verwendeten Lösungen sollte auf derselben Kameraebene und Nachweisschwelle wie die analysierten Nanopartikelproben durchgeführt werden. Die Größe und Konzentration von Nanopartikeln, die in Verdünnungsmitteln enthalten sind, die für EV-Probenverdünnungen verwendet werden, werden selten in Publikationen zur NTA-Analyse von EVs erwähnt.

Dieses Protokoll verwendet die NTA-Analyse synthetischer EV-ähnlicher Liposomen, die unter Verwendung ausgewählter Kamerapegel, Erkennungsschwellen und mechanischer Filterung der Proben ausgewertet werden, um die systematischen Auswirkungen von Kamerapegel, Erkennungsschwelle oder Probenfiltration auf den NTA-Datensatz zu analysieren. Liposomen wurden wie in Supplemental File S1 beschrieben synthetisiert. Synthetische Liposomen wurden in diesem Experiment aufgrund ihrer Größengleichmäßigkeit, physikalischen Eigenschaften und Stabilität bei der Lagerung bei 4 ° C verwendet. Obwohl tatsächliche Stichproben von Elektrofahrzeugen hätten verwendet werden können, könnte die Heterogenität und Stabilität von Elektrofahrzeugen während der Speicherung diese Studie und ihre Interpretation erschwert haben. Ähnlichkeiten in den NTA-Berichten von (A) Liposomen und (B) EVs deuten darauf hin, dass die systematischen Effekte, die in diesem Artikel für Liposomen aufgedeckt wurden, wahrscheinlich auch für die EV-Charakterisierung gelten werden (Abbildung 1). Zusammengenommen unterstützen diese Ergebnisse die Vorstellung, dass die vollständige Berichterstattung über kritische Softwareeinstellungen und die Beschreibung der Probenverarbeitung wie Verdünnungsmittel, Verdünnung und Filtration die Reproduzierbarkeit von NTA-Daten beeinflussen.

Der Zweck dieses Papiers ist es, zu zeigen, dass die Variation der NTA-Einstellungen (Temperatur, Kameraniveau und Erkennungsschwelle) und der Probenvorbereitung die gesammelten Ergebnisse verändert: Es wurden systematische, signifikante Unterschiede in Größe und Konzentration erzielt. Da NTA eine der beliebtesten Optionen zur Erfüllung der MISEV2018-Charakterisierungsspezifikation ist, zeigen diese Ergebnisse, wie wichtig es ist, die Probenvorbereitung und die NTA-Einstellungen zu melden, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.

Abbildung 1: Repräsentative NTA-Berichte zum Vergleich von Liposomen mit EVs. (A) Liposomen: ungefilterte Probe, die am 12. März 2020 auf NTA charakterisiert wurde. (B) EVs: ungefilterte Probe, die am 26. August 2021 auf NTA charakterisiert wurde. Abkürzungen: NTA = Nanoparticle tracking analysis; EVs = extrazelluläre Vesikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Protokoll

1. Allgemeine Protokollrichtlinien

1. Halten Sie das Mikroskop auf einem Lufttisch oder mindestens auf einem vibrationsfreien Tisch. Stellen Sie sicher, dass Fremdvibrationen (z. B. Fußklopfen auf den Boden, Berühren des Tisches, Türschließungen, Laborverkehr) auf ein Minimum reduziert werden.
2. Stellen und halten Sie die Temperatur des Lasermoduls für alle Videoaufnahmen auf einer konstanten Temperatur.
   HINWEIS: Die gewählte Temperatur betrug 25 °C, da der Nanopartikelgrößenanalysator auf diese Temperatur kalibriert wurde. Daher ist es wichtig, dass alle Benutzer des Instruments die kalibrierte Temperatur kennen und verwenden. Die Raumtemperatur ist keine akzeptable Einstellung, da sie variieren kann.
3. Stellen Sie sicher, dass alle Verdünnungsmittel, auch Negativkontrollen genannt (z. B. Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS), ultrareines destilliertes Wasser [DW]), alle NTA-charakterisiert sind, wobei der gleiche Kamerapegel und die gleiche Nachweisschwelle wie die zu messenden Nanopartikelproben verwendet werden. Verwenden Sie gekennzeichnete DPBS für die Spülung des Lasermoduls und die Verdünnung von Proben. Berücksichtigen Sie Verunreinigungen im Negativkontroll-DPBS in den Probenergebnissen, wenn ihre Werte signifikant sind.
4. Lagern Sie die Proben vor der Auswertung bei 4 °C und frieren Sie sie niemals ein, da dies die Liposomenprobe abbauen würde. Erwärmen Sie Proben/Standards/Verdünnungsmittel vor der Analyse 30 min lang auf Raumtemperatur.
   HINWEIS: Die Probenhandhabung war spezifisch für das zu untersuchende Material.
5. Bewerten Sie Proben und Standards mithilfe der Schnellmessung, um eine geeignete Verdünnung zu ermitteln, um 10 7 bis 10⁹ Partikel / ml (ca. 50 bis 100 Partikel / NTA-Videobildschirm) zu erhalten^, die für NTA-Analysen optimal sind.
   HINWEIS: Die Autoren haben festgestellt, dass Partikelkonzentrationen am oberen Ende dieses Bereichs konsistentere und reproduzierbarere Ergebnisse liefern.
6. Füllen Sie alle anwendbaren Felder im Feld Erfassung der Registerkarte SOP für Schnell - und Standardmessungen aus, einschließlich der verwendeten Verdünnung und des verwendeten Verdünnungsmittels.

2. Erstellung von Kalibrierstandards der Größe 50 nm und 100 nm

HINWEIS: Siehe Materialtabelle.

1. 50 nm Größe Transferstandards verdünnt 1:5.000
   1. Geben Sie 2 μL der 50-nm-Standards zu 9.998 μL 0,22 μm-filtriertem 10 mM Kaliumchlorid (KCl)/0,03% Tween 20 in ultrareiner DW in ein doppelt gespültes 15 mL konisches Rohr. Lagern Sie den verdünnten 50-nm-Standard bis zu einem Jahr bei 4 °C.
2. 100 nm Größe Transferstandards verdünnt 1:333
   1. Fügen Sie 30 μL der 100-nm-Standards zu 9.970 μL 0,22 μm-gefiltertem 10 mM KCl/0,03% Tween 20 in ultrareiner DW in ein doppelt gespültes 15-ml-konisches Rohr hinzu. Lagern Sie den verdünnten 100-nm-Standard bis zu einem Jahr bei 4 °C.

3. Reinigung und Montage des Lasermoduls

1. Untersuchen Sie die Fenster des Lasermoduls und der Durchflusszellenabdeckung visuell auf Kratzer oder Unvollkommenheiten.
   HINWEIS: Wenn eine der Glasoberflächen zerkratzt ist, kann die Bildgebung beeinträchtigt werden.
2. Reinigen Sie beide Glasoberflächen vorsichtig mit einem hochwertigen Linsenreiniger und Linsenpapier. Verwenden Sie keine Seidentücher oder Papiertücher auf Glasoberflächen.
3. Stellen Sie sicher, dass die O-Ring-Dichtung vor der Montage ordnungsgemäß in der Nut der Durchflusszellenabdeckung sitzt.
4. Platzieren Sie die Durchflusszellenabdeckung auf dem Lasermodul und stellen Sie sicher, dass sich die elektrischen Kontakte in der richtigen Ausrichtung befinden. Setzen Sie die 4 federbelasteten Rändelschrauben durch die Durchflusszellenplatte und greifen Sie die Gewinde des Lasermoduls ein, ziehen Sie sie jedoch nicht einzeln an.
5. Üben Sie gleichmäßigen Druck auf die Durchflusszellenabdeckung aus und ziehen Sie die Rändelschrauben gleichmäßig diagonal an, bis sie fest sitzen. Ziehen Sie die Rändelschrauben nur an, bis sie den Finger fest anziehen. Nicht zu straffen.
   HINWEIS: Ungleichmäßiges Anziehen der Rändelschrauben kann die Oberfläche des Lasermoduls knacken. Neuere Rändelschrauben werden bei richtigem Druck "ausweichen" und ein mögliches Überziehen vermeiden.

4. Spülvorgang für das Lasermodul vor und zwischen den Proben

1. Verwenden Sie einen neu geöffneten Behälter mit DPBS und Aliquot in dreifach gespülte 15-ml-Polypropylenröhrchen. Stellen Sie sicher, dass Produkte, die zum Spülen oder Verdünnen von Proben verwendet werden, vor der Verwendung NTA-gekennzeichnet sind (siehe Schritt 1.3).
2. Spülen Sie zwei 1-ml-Tuberkulinspritzen mit Slip-Lock-Adaptern 3-mal mit 1 ml DPBS, um Partikelrückstände zu entfernen. Verwenden Sie einen der beiden Ports als Eingabe, verwenden Sie ihn jedoch während des Experiments konsistent. Verwenden Sie keine größeren Spritzen, da die Gefahr besteht, dass die Spritzenanschlüsse durch das erhöhte Gewicht und die Größe der Spritze gebrochen werden.
3. Entfernen und entsorgen Sie den Kolben aus der 1. Tuberkulinspritze und führen Sie ihn in den verbleibenden Anschluss ein, um als leeres Verdünnungsmittel / Probenreservoir zu dienen^.
   HINWEIS: Wenn der Kolben nicht entfernt wird, führt dies zu einem erhöhten Druck in der Probenkammer und zu Leckagen um die Dichtung.
4. Füllen Sie die 2. Spritze mit 1 mL DPBS und befestigen Sie sie am Einlassanschluss der Durchflusszellenabdeckung^.
5. Halten Sie das Lasermodul geneigt, wobei der Auslassspritzenanschluss erhöht ist, damit Luft aus der Kammer gespült werden kann, während das DPBS langsam in das Lasermodul injiziert wird.
6. Spülen Sie die verbleibenden DPBS aus dem Lasermodul, indem Sie 1 ml Luft in den Einlassanschluss injizieren. Wiederholen Sie das Spülen 2 weitere Male.
7. Entleeren Sie das Lasermodul nach dem letzten Flush so vollständig wie möglich.
   HINWEIS: Nach der NTA-Analyse des 50-nm-Standards ist eine gründliche, sorgfältige Spülung erforderlich, da diese Partikel im Lasermodul verbleiben. Das Lasermodul ist nun einsatzbereit.

5. Platzierung des Lasermoduls auf dem Mikroskoptisch

1. Suchen Sie die Fokusausrichtungsführungen des Lasermoduls am Arm des Mikroskops (Abbildung 2) und richten Sie sie mit dem Fokusknopf aus.

Abbildung 2: Fokusausrichtungsführung des Lasermoduls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

2. Platzieren Sie das Lasermodul mit Blick auf das Mikroskop in der Rillenstufe und schieben Sie es vorsichtig so weit wie möglich nach rechts.
   HINWEIS: Wenn Sie sorgfältig vorgehen, sind die Ausrichtung und der Fokuspunkt zwischen den Proben leichter zu lokalisieren.
3. Schalten Sie den Wippschalter an der Lasersteuerbox ein.

6. Fokussierung und Positionierung des Lasermoduls

HINWEIS: Dies muss mit Flüssigkeit in der Kammer durchgeführt werden.

1. Laden Sie die NTA-Software (siehe Materialtabelle) vom Desktop.
   HINWEIS: Möglicherweise wird der Fehler "Temperatur H/W auf COM3 nicht gefunden" angezeigt. Schließen Sie einfach die Software und öffnen Sie sie erneut, um das Problem zu beheben.
2. Klicken Sie auf Kamera starten auf der Registerkarte Aufnahme in der oberen linken Ecke. Wenn sich die Kamera nach 5 Minuten automatisch ausschaltet, klicken Sie einfach erneut auf Kamera starten, um sie neu zu starten .
3. Stellen Sie auf derselben Registerkarte den Kamerapegel auf 14 bis 16 ein, um die Laserlinie aufzuhellen und die Partikelidentifizierung und -fokussierung zu vereinfachen.
4. Leiten Sie das Bild von der Kamera auf die Okulare um, indem Sie den oberen Schieberegler auf der linken Seite des Kopfstücks nach innen oder außen bewegen.
5. Finden Sie den Bereich mit erhöhter Dichte, der allgemein als Fingerabdruck bezeichnet wird. Zentrieren und fokussieren Sie den Fingerabdruck vertikal im Sichtfeld.
   HINWEIS: Die Laserlinie befindet sich links neben dem Fingerabdruck. Das Verdunkeln des Raums kann dazu beitragen, den Daumenabdruck zu lokalisieren und sich auf die Laserlinie zu konzentrieren.
6. Zentriere die Laserlinie im Sichtfeld; Bewegen Sie den oberen Schieberegler, um das Licht wie auf dem Computerbildschirm beobachtet zur Kamera umzuleiten.
   HINWEIS: Die Laserlinie, die jetzt auf dem Bildschirm sichtbar ist, ist ein Spiegelbild der Okularansicht; links in den Okularen ist rechts auf dem Computerbildschirm.
7. Passen Sie den Fokus an, um das Bild einzelner sich bewegender Partikel auf dem Bildschirm mit dem Fokusknopf zu schärfen.
   HINWEIS: Aufgrund der Tiefenschärfe sind nicht alle Partikel im Fokus, was akzeptabel ist. Selbst Partikel, die leicht unscharf sind, werden von der Kamera erfasst und von der Software analysiert.

7. Laden von Standards / Proben / Verdünnungsmittel in das Lasermodul für die NTA-Analyse

1. Ziehen Sie 1 ml Standard-/Probe-/Verdünnungsmittel in eine gespülte 1-ml-Tuberkulinspritze und befestigen Sie sie am Einlassanschluss der Durchflusszellenabdeckung. Bewegen Sie den Kolben vor, bis Flüssigkeit in der offenen Spritze sichtbar ist, die am Auslassanschluss befestigt ist.
2. Bewegen Sie sich in der Kameraansicht nach rechts von der Laserlinie in einen Bereich mit einer gleichmäßigen Anzahl von Partikeln. Passen Sie bei Bedarf die vertikale Ausrichtung an, um die horizontalen Lichtbänder zu zentrieren. Fokussieren Sie neu, bis die höchste Anzahl von Partikeln sichtbar ist. Stellen Sie sicher, dass diese Position bei allen nachfolgenden Maßnahmen so genau wie möglich gehalten wird.
3. Passen Sie die Kameraebene so an, dass das Symbol für dunkle Informationen in der oberen rechten Ecke der Kameraansicht zeitweise ein- und ausgeschaltet wird.
   HINWEIS: Dadurch wird sichergestellt, dass für jede Datenerfassungsserie eine konsistente Auswahl der Kamerastufe mit der minimalen Empfindlichkeitsstufe vorgenommen wird.
   HINWEIS: Die Kameraebene kann während der Aufnahme nicht geändert werden.

8. Validierung der Kalibrierung

HINWEIS: Es wird empfohlen, die Modulkalibrierung vor der Probenanalyse anhand von Größenstandards (siehe Abschnitt 2) zu validieren. Eine routinemäßige Validierung ist notwendig, um genaue Messungen zu gewährleisten. In einem Mehrbenutzerlabor können individuelle Benutzeranpassungen von Softwarekonfigurationseinstellungen versehentlich zu einer ungenauen Datenerfassung führen. Für die Erhebung kritischer Daten ist die tägliche Validierung eine Frage der guten Laborpraxis. Die tägliche Reproduzierbarkeit der Validierung muss in die berichteten Ergebnisse einbezogen werden. In der Regel wird die Kalibrierung vom Techniker festgelegt und vom einzelnen Benutzer nicht einstellbar, es sei denn, der Benutzer verfügt über Administratorzugriff. Dies verhindert eine nicht autorisierte Neukonfiguration durch einzelne Benutzer.

1. Warme verdünnte Standards (siehe Abschnitt 2) auf Raumtemperatur für 30 min.
2. Drehen Sie die Standards kurz um und laden Sie sie dann wie in Abschnitt 7 beschrieben.
3. Führen Sie eine NTA-Stichprobe wie in Abschnitt 10 beschrieben durch und zeichnen Sie Werte für die anschließende Berechnung des Variationskoeffizienten auf, der bei korrekter Kalibrierung weniger als 2 % betragen sollte.

9. Optimierung der Probenkonzentration für NTA

HINWEIS: Der Bildschirm sollte zwischen 50 und 100 messbare Partikel enthalten, wenn der Kamerapegel und die Probenkonzentration richtig eingestellt sind. Wenn es Fragen gibt, ob eine Probe eine geeignete Partikelzahl hat, kann an dieser Stelle eine Schnellmessung an der Probe durchgeführt werden (siehe Schritte 9.1 bis 9.7). Es wird verwendet, um die Probeneigenschaften vor längeren Videoaufnahmen schnell zu beurteilen. Die Registerkarte Schnellmessung befindet sich auf der Registerkarte SOP im unteren mittleren Feld.

1. Legen Sie die Aufnahmedauer auf 30 s fest.
2. Übernehmen Sie den vorhandenen Basisdateinamen, oder geben Sie einen neuen Dateinamen ein , indem Sie auf die Registerkarte ... für eine neue Speicher-Site für generierte Daten klicken.
3. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Zieltemperatur und geben Sie die gewünschte Temperatur ein.
4. Laden Sie das Beispiel wie zuvor beschrieben (Schritt 7.1), und klicken Sie auf Skript erstellen und ausführen.
5. Warten Sie, bis die Anzahl der Partikel pro Frame nach Abschluss des 30-Sekunden-Videos unten rechts auf dem Videobildschirm angezeigt wird. Wenn die Anzahl der Partikel größer als 100 ist, spülen Sie das Lasermodul 3 Mal (wie zuvor in Schritt 4.6 beschrieben).
6. Verdünnen Sie die Probe mit dem charakterisierten Verdünnungsmittel auf den gewünschten Konzentrationsbereich.
7. Laden Sie die ordnungsgemäß verdünnte Probe in das gespülte Lasermodul und führen Sie die Schnellmessung durch, um zu überprüfen, ob sich die Probe im akzeptablen Bereich befindet.

10. NTA-Beispiel-NTA

HINWEIS: Die Registerkarte Standardmessung befindet sich auf der Registerkarte SOP im unteren mittleren Feld und wird für die routinemäßige Probenanalyse verwendet (siehe Schritte 10.1 bis 10.12).

1. Stellen Sie die Dauer auf 30 oder 60 s und die Anzahl der Videos auf 5 ein.
2. Übernehmen Sie den vorhandenen Basisdateinamen, oder geben Sie einen neuen Dateinamen ein , indem Sie auf die Registerkarte ... für eine neue Speicher-Site für generierte Daten klicken.
3. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Zieltemperatur und geben Sie die gewünschte Temperatur ein.
4. Klicken Sie auf Skript erstellen , um diese Standardmessung wiederzuverwenden.
5. Sobald das Beispiel wie in Abschnitt 7 beschrieben geladen wurde und das Experiment zum Ausführen bereit ist, klicken Sie auf Skript erstellen und ausführen.
6. Füllen Sie die Felder im Popup-Fenster Berichtsdetails festlegen mit Informationen zum Bediener, zur Probenbeschreibung, zur Verdünnung der Probe und zum verwendeten Verdünnungsmittel aus.
   HINWEIS: Diese Informationen werden aufgezeichnet und in den abschließenden experimentellen Bericht gedruckt.
7. Wenn alle gewünschten Felder ausgefüllt wurden, klicken Sie auf OK, um das Skript zu starten.
   HINWEIS: Wenn Zieltemperatur ausgewählt wurde, stabilisiert die Heizung die Probe im Lasermodul für 5 s auf die gewünschte Temperatur, bevor das Skript mit der Messung fortfahren kann. Das Diagnosefeld in der unteren linken Ecke des Bildschirms zeigt HEATER ON an und zeigt die Temperatur der Probe an.
8. Suchen Sie vor jeder Videoaufnahme nach einer Eingabeaufforderung, um den Kolben manuell zu bewegen. Injizieren Sie ~ 0,05 ml der Probe in die Laserkammer und lassen Sie die Partikel "ruhen" (dh nicht fließen), und klicken Sie dann auf OK.
9. Warten Sie, bis nach Abschluss der 5. Videoaufnahme ein Feld mit der Bestätigung der Einstellungen angezeigt wird und das Feld Prozess blinkt^. Legen Sie den Erkennungsschwellenwert für die Verarbeitung der Probe fest, indem Sie die Anzahl der blauen Kreuze notieren, die Partikel auf dem Bildschirm markieren, während die Frames manuell vom unteren Rand des Videobildschirms aus verschoben werden. Wenn mehr als 3-4 blaue Kreuze vorhanden sind, die Partikel auf jedem Bildschirm markieren, während die Rahmen erweitert werden, erhöhen Sie den Erkennungsschwellenwert.
   HINWEIS: Die blauen Kreuze auf den einzelnen Partikeln sind analog zum "Schwarmeffekt" in der Durchflusszytometrie und sollten für eine optimale Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Datenerfassung minimiert werden.
10. Klicken Sie auf Einstellungen OK, wenn der Erkennungsschwellenwert akzeptabel ist.
11. Warten Sie, bis die Videos automatisch verarbeitet und ein Histogramm der Ergebnisse und eine Dialogfeldbenachrichtigung über den Abschluss angezeigt werden, bevor Sie auf OK klicken.
12. Sobald das Feld Exporteinstellungen angezeigt wird, speichern Sie die Ergebnisse, indem Sie auf Exportieren klicken.
    HINWEIS: Alle Ergebnisse von Videos und Analysen werden in der in Schritt 10.2 definierten Zieldatei gespeichert. Dies erfordert eine große Menge an Speicherplatz. Überwachung und Übertragung auf ein sekundäres Speichergerät nach Bedarf.

11. Neuanalyse der aktuellen Probe bei unterschiedlichen Nachweisschwellen

HINWEIS: Unmittelbar nach der NTA-Analyse (Schritt 10) können die Daten mit verschiedenen Einstellungen für den Erkennungsschwellenwert erneut analysiert werden. Die Kameraebene kann jedoch nach der Aufnahme nicht geändert werden.

1. Markieren Sie alle 5 Aufnahmevideos, die im aktuellen Experiment aufgeführt sind.
2. Klicken Sie auf Ausgewählte Dateien verarbeiten, und warten Sie, bis das Feld Einstellungsbestätigung angezeigt wird und das Feld Prozess blinkt, um den Erkennungsschwellenwert zu ändern.
3. Stellen Sie den Erkennungsschwellenwert auf die gewünschte Stufe ein und klicken Sie auf OK einstellen.
4. Warten Sie, bis die Videos automatisch verarbeitet und ein Histogramm der Ergebnisse und eine Dialogfeldbenachrichtigung über den Abschluss angezeigt werden, bevor Sie auf OK klicken.
5. Klicken Sie auf Exporteinstellungen. Wenn zusätzliche Auswertungen für die letzte Stichprobe durchgeführt werden, müssen Sie im aktuellen Experiment auf das Feld Ergebnisse exportieren klicken, da das Popupfeld Ergebnisse exportieren nach der Stichprobenneuanalyse nicht angezeigt wird.
   HINWEIS: Da es keine Erinnerungen gibt, dies zu tun, kann es leicht übersehen werden, und die Analyse geht verloren. Die zugrunde liegenden Daten bleiben jedoch erhalten und können später erneut analysiert werden.

12. Analyse archivierter Dateien

HINWEIS: Wenn zuvor analysierte Experimente nicht gespeichert wurden oder zusätzliche Analysen an diesen Proben durchgeführt werden müssen, können die einzelnen Dateien für zusätzliche Erkennungsschwellenwertauswertungen in die NTA-Software geladen werden. Änderungen der Kameraebene können nach der Aufnahme nicht mehr geändert werden.

1. Laden Sie die NTA-Software vom Desktop aus.
2. Klicken Sie im unteren mittleren Bereich auf die Registerkarte Analyse .
3. Klicken Sie auf Experiment öffnen und navigieren Sie zur gewünschten .nano-Datei.
   HINWEIS: Die Videodateien, die mit dem ausgewählten .nano-Experiment verknüpft sind, müssen sich im selben Ordner wie die Hauptexperimentdatei befinden. Andernfalls wird beim Versuch, die Dateien zu verarbeiten, ein Fehler angezeigt. Die ersten 6 Ziffern des Dateinamens sind das Datum, an dem das Experiment ausgeführt wurde (xx-xx-xx). Die letzten 6 Ziffern des Dateinamens sind der Zeitpunkt der Videoaufnahme (xx-xx-xx) und die individuelle Videokennung. Die PDF-Datei jedes kombinierten Experiments listet die enthaltenen .nano-Dateien für diese Analyse auf.
4. Klicken Sie auf Ausgewählte Dateien verarbeiten , um die Analyse auszuführen.
5. Sobald das Feld Prozess blinkt, um Änderungen am Erkennungsschwellenwert zuzulassen, legen Sie den Schwellenwert auf die gewünschte Stufe fest und klicken Sie auf OK.
6. Warten Sie, bis die Videos automatisch verarbeitet und ein Histogramm der Ergebnisse und eine Dialogfeldbenachrichtigung über den Abschluss angezeigt werden, bevor Sie auf OK klicken.
7. Klicken Sie auf Ergebnisse exportieren. Achten Sie darauf, im aktuellen Experiment auf das Feld Ergebnisse exportieren zu klicken, da das Popup-Fenster Ergebnisse exportieren nach der erneuten Analyse nicht angezeigt wird.
   HINWEIS: Da es keine Erinnerungen gibt, dies zu tun, kann es leicht übersehen werden, und die Analyse geht verloren.

13. Reinigung und Demontage des Lasermoduls

1. Schalten Sie die Lasersteuerungsbox aus.
2. Spülen Sie die gesamte Probe aus dem Lasermodul und entsorgen Sie sie ordnungsgemäß.
3. Halten Sie das Lasermodul mit erhöhtem offenen Spritzenanschluss geneigt, damit Luft aus der Kammer gespült werden kann, während das DPBS langsam in das Lasermodul eingespritzt und aus dem Auslassspritzenanschluss gespült wird.
4. Spülen Sie die verbleibenden DPBS aus dem Lasermodul und entsorgen Sie sie.
5. Wiederholen Sie das Spülen 2 weitere Male und leeren Sie das Lasermodul nach dem letzten Spülen so vollständig wie möglich.
6. Gleichmäßigen Druck auf die Durchflusszellenabdeckung ausüben, die Rändelschrauben gleichmäßig in abwechselnder Diagonale lösen, bis sie sich vom Gewinde lösen, die Rändelschrauben entfernen und im Lasermodulgehäuse verstauen.
7. Entfernen Sie die Durchflusszellenabdeckung vom Lasermodul.
8. Reinigen Sie beide Glasoberflächen vorsichtig mit einem hochwertigen Linsenreiniger und Linsenpapier. Verwenden Sie kein Seidenpapier oder Papierhandtücher auf Glasoberflächen.
9. Untersuchen Sie das Lasermodul und die "Fenster" der Durchflusszellenabdeckung visuell auf Kratzer oder Unvollkommenheiten nach dem Gebrauch und melden Sie dies dem Vorgesetzten.
10. Ersetzen Sie das Lasermodul und die Durchflusszellenabdeckung in ihren Gehäusen, um Schäden an Glasoberflächen während der Lagerung zu vermeiden.

14. Protokoll zur Probenanalyse

1. Unfiltrierte Proben
   1. Wirbeln Sie die Probe vor dem Laden vor und nehmen Sie 5 x 60 s Videos auf Kameraebene 12 und Erkennungsschwelle Stufe 3 auf, wie oben beschrieben. Analysieren Sie diese Videos mithilfe der Erkennungsschwellenwerte 2 und 5 erneut.
   2. Wiederholen Sie Videosammlungen derselben Probe auf Kameraebene 13 und 14 und Erkennungsschwellenwert 3. Analysieren Sie diese 2 zusätzlichen Videos erneut mit den Erkennungsschwellenwerten 2 und 5. Wiederholen Sie den gesamten Vorgang mit 5 x 30 s Videos in der SOP-Einstellung.
2. Gefilterte Proben
   1. Wirbeln Sie die Probe ein und laden und filtern Sie sie dann gleichzeitig (0,22 μm Spritzenfilter) direkt in das Lasermodul.
      HINWEIS: Der Spritzenfilter wurde vor der Verwendung mit dem 2-fachen Volumen des Filtertotraums gespült, um residente Partikel zu entfernen. Die Spritzenfilter (siehe Materialtabelle) hatten einen gemessenen Totraum von 0,5 ml und wurden vor den Messungen mit 1,0 ml der Probe gespült. Notieren Sie sich den Filtertyp in den SOP-Datenfeldern . Die gefilterte Probe wurde genau wie in Schritt 14.1 beschrieben für ungefilterte Proben verarbeitet.

15. Statistische Analyse der NTA-Ergebnisse

1. Für die Analyse der Haupteffekte oder Wechselwirkungen führen Sie eine Varianzanalyse nach einer Überprüfung der ANOVA-Annahmen (Normalität, unimodal, Homogenität der Varianz) durch. Verwenden Sie Kruskal-Wallis Einweg-ANOVA auf Rängen in Fällen des Scheiterns von ANOVA-Annahmen.
2. Verwenden Sie nach der Rückkehr signifikanter Haupteffekte die Dunn-Methode, um Bedürftigkeitsprüfungen für vorgeplante Vergleiche durchzuführen. Betrachten Sie einen p-Wert von 0,05 als signifikant in zweiseitigen Tests.
   HINWEIS: Die hier generierten Datendateien stehen den Autoren nach Abschluss eines Materialtransfervertrags zur Verfügung.

Ergebnisse

Tabelle 1 enthält die Ergebnisse der NTA-Videos für die Liposomenproben (18 gefiltert und 18 ungefiltert) und ein repräsentatives DPBS-Verdünnungsmittel. Vergleiche zwischen den beiden Gruppen wurden unabhängig von der Kamerastufe oder dem Erkennungsschwellenwert in diesem Dokument durchgeführt. Gefilterte Proben hatten einen mittleren Partikeldurchmesser von 108,5 nm, einen Partikelmodus von 86,2 nm und eine Konzentration von 7,4 × 10^{8 Partikeln} /ml. Im Gegensatz dazu hatten ungefilter...

Diskussion

Es gibt mehrere Methoden, um die Größe und Konzentration von Nanopartikeln^{abzuschätzen 11}. Dazu gehören Ensemble-Methoden, die eine Größenschätzung aus einer Population generieren, einschließlich dynamischer Lichtstreuung (DLS), zentrifugaler Sedimentation und Einzelpartikel-Level-Analyse - Elektronenmikroskopie, NTA, Rasterkraftmikroskopie und abstimmbarer resistiver Pulsmessung. Von diesen sind DLS und NTA weit verbreitete, zerstörungsfreie Größen- und Konzentrationsmessmethoden, die ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic Pipetter
Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL	Thermo Sci.	339650
Kimwipes
Lens Cleaner
Lens Paper
NanoSight LM-10	Malvern Panalytical
NanoSight LM-14 Laser Module	Malvern Panalytical
Nanosight NTA Software Ver. 3.2	Malvern Panalytical
Paper Towels
Pipette Tips, 1-200 µL, Filtered, Sterile, Low Binding	BioExpress	P -3243-200X
Pipette Tips, 50-1,000 µL, Filtered, Sterile	BioExpress	P-3243-1250
Saline, Dulbecco's Phosphate Buffered (No Ca or Mg)	Gibco	14190-144
Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL)	Malvern	NTA4088
Standards, Latex Transfer- 50 nm  (3 mL)	Malvern	NTA4087
Syringe Filter, 33 mm, .22 µm, MCE, Sterile	Fisher brand	09-720-004
Syringe, TB, 1 mL, slip tip	Becton Dickinson	309659
Waste fluid container