Un chip microfluídico simple para el crecimiento a largo plazo y la obtención de imágenes de Caenorhabditis elegans

Resumen

El protocolo describe un diseño simple de chip microfluídico y una metodología de microfabricación utilizada para cultivar C. elegans en presencia de un suministro continuo de alimentos durante hasta 36 h. El dispositivo de crecimiento e imágenes también permite obtener imágenes intermitentes de alta resolución a largo plazo de procesos celulares y subcelulares durante el desarrollo durante varios días.

Resumen

Caenorhabditis elegans (C. elegans) ha demostrado ser un valioso sistema modelo para estudiar los procesos biológicos celulares y de desarrollo. La comprensión de estos procesos biológicos a menudo requiere imágenes a largo plazo y repetidas del mismo animal. Los largos tiempos de recuperación asociados con los métodos convencionales de inmovilización realizados en almohadillas de agar tienen efectos perjudiciales para la salud animal, por lo que es inapropiado obtener imágenes repetidas del mismo animal durante largos períodos de tiempo. Este documento describe un diseño de chip microfluídico, método de fabricación, protocolo de cultivo de C. elegans en chip y tres ejemplos de imágenes a largo plazo para estudiar los procesos de desarrollo en animales individuales. El chip, fabricado con polidimetilsiloxano y unido a un vidrio de cubierta, inmoviliza a los animales en un sustrato de vidrio utilizando una membrana elastomérica que se desvía con gas nitrógeno. La inmovilización completa de C. elegans permite obtener imágenes robustas de lapso de tiempo de eventos celulares y subcelulares sin anestesia. Una geometría de canal con una gran sección transversal permite al animal moverse libremente dentro de dos membranas de aislamiento parcialmente selladas que permiten el crecimiento en el canal con un suministro continuo de alimentos. Usando este simple chip, se pueden realizar imágenes de fenómenos de desarrollo como el crecimiento del proceso neuronal, el desarrollo vulvar y la arborización dendrítica en las neuronas sensoriales PVD, a medida que el animal crece dentro del canal. El chip de crecimiento e imágenes a largo plazo funciona con una sola línea de presión, sin válvulas externas, consumibles fluídicos de bajo costo y utiliza protocolos estándar de manejo de gusanos que pueden ser fácilmente adaptados por otros laboratorios que utilizan C. elegans.

Introducción

Caenorhabditis elegans ha demostrado ser un poderoso organismo modelo para estudiar la biología celular, el envejecimiento, la biología del desarrollo y la neurobiología. Ventajas como su cuerpo transparente, ciclo de vida corto, fácil mantenimiento, un número definido de células, homología con varios genes humanos y genética bien estudiada han llevado a C. elegans a convertirse en un modelo popular tanto para los descubrimientos de biología fundamental como para la investigación aplicada ^1,2. Comprender los procesos biológicos y de desarrollo de las células a partir de la observación repetida a largo plazo de animales individuales puede resultar beneficioso. Convencionalmente, C. elegans se anestesia en almohadillas de agar y se obtiene una imagen bajo el microscopio. Los efectos adversos de los anestésicos sobre la salud de los animales limitan el uso de animales anestesiados para imágenes intermitentes repetidas y a largo plazo del mismo animal ^3,4. Los avances recientes en las tecnologías microfluídicas y su adaptación para la captura sin anestesia de C. elegans con riesgos insignificantes para la salud permiten obtener imágenes de alta resolución del mismo animal durante un período de tiempo corto y largo.

Los chips microfluídicos han sido diseñados para C. elegans'5 cribado de alto rendimiento ^6,7,8, captura y dispensación⁹, cribado de fármacos 10,11, estimulación neuronal con imágenes de alta resolución 12 e imágenes de alta resolución del animal ^12,13,14. También se han desarrollado láminas microfluídicas ultrafinas para la inmovilización en portaobjetos¹⁵. Se han realizado estudios a largo plazo de C. elegans utilizando imágenes de baja resolución de animales que crecen en cultivo líquido para observar el crecimiento, la dinámica del calcio, los efectos de los medicamentos en su comportamiento^16,17,18,19, su longevidad y el envejecimiento²⁰. Se han realizado estudios a largo plazo con microscopía de alta resolución para evaluar el desarrollo sináptico²¹, la regeneración neuronal 22 y la adición mitocondrial²³. Las imágenes de alta resolución a largo plazo y el rastreo del destino y la diferenciación celular se han realizado en dispositivos multicanal^24,25. Varios eventos celulares y subcelulares ocurren en las escalas de tiempo de varias horas y requieren atrapar al mismo individuo en diferentes puntos de tiempo durante su desarrollo para caracterizar todos los pasos intermedios en el proceso para comprender la dinámica celular in vivo. Para obtener imágenes de procesos biológicos como la organogénesis, el desarrollo neuronal y la migración celular, el animal necesita ser inmovilizado en la misma orientación en múltiples puntos de tiempo. Anteriormente hemos publicado un protocolo para imágenes de alta resolución de C. elegans durante más de 36 h para determinar dónde se agregan las mitocondrias a lo largo de las neuronas receptoras del tacto (TRN)²³.

Este documento proporciona un protocolo para establecer una metodología basada en microfluídica para imágenes repetidas de alta resolución. Este dispositivo, con un solo canal de flujo, es el más adecuado para imágenes repetidas de un solo animal por dispositivo. Para mejorar el rendimiento y la imagen de muchos animales a la vez, se pueden conectar múltiples dispositivos a la misma línea de presión pero con conectores separados de tres vías que controlan un solo animal en cada dispositivo. El diseño es útil para estudios que exigen imágenes de lapso de tiempo de alta resolución, como procesos de desarrollo postembrionario, migración celular, transporte de orgánulos, estudios de expresión génica, etc. La tecnología podría ser limitante para algunas aplicaciones, como la vida útil y los estudios de envejecimiento que requieren crecimiento paralelo e imágenes de muchos animales en etapa tardía. El elastómero de polidimetilsiloxano (PDMS) se utilizó para fabricar este dispositivo debido a su bioestabilidad²⁶, biocompatibilidad 27,28, permeabilidad al gas ^29,30 y módulo elástico sintonizable ³¹. Este dispositivo de dos capas permite el crecimiento de animales con suministro continuo de alimentos en un canal microfluídico y la captura de C. elegans individuales a través de la compresión de membrana PDMS utilizando gas nitrógeno. Este dispositivo es una extensión del dispositivo publicado anteriormente con la ventaja de crecer e imaginar el mismo animal en el microcanal bajo un suministro continuo de alimentos³. La red de membranas de aislamiento adicional y una membrana de captura de 2 mm de ancho permiten la inmovilización eficiente de los animales en desarrollo. El dispositivo se ha utilizado para observar el desarrollo neuronal, el desarrollo vulvar y la arborización dendrítica en neuronas PVD sensoriales. Los animales crecen sin efectos adversos para la salud en el dispositivo y pueden inmovilizarse repetidamente para facilitar la obtención de imágenes de eventos subcelulares en el mismo animal durante su desarrollo.

Todo el protocolo se divide en cinco partes. La Parte 1 describe la fabricación del dispositivo para el chip de crecimiento e imagen. La Parte 2 describe cómo configurar un sistema de presión para la deflexión de la membrana PDMS para inmovilizar y aislar C. elegans individuales. La Parte 3 describe cómo sincronizar C. elegans en una placa de medio de crecimiento de nematodos (NGM) para obtener imágenes del dispositivo. La Parte 4 describe cómo cargar un solo animal en el dispositivo y hacer crecer al animal dentro del dispositivo microfluídico durante varios días. La Parte 5 describe cómo inmovilizar a un animal individual en múltiples puntos de tiempo, capturar imágenes de alta resolución utilizando diferentes objetivos y analizar las imágenes usando Fiji.

Protocolo

1. Fabricación del dispositivo de crecimiento e imagen

1. Fabricación de moldes SU8
   1. Diseñe patrones 1 (capa de flujo) y 2 (capa de control) utilizando formas rectangulares en un software de procesamiento de textos (o un software CAD de diseño asistido por computadora) e imprima las fotomáscaras con la ayuda de un trazador láser con un tamaño mínimo de característica de 8 μm en película basada en poliéster (Figura 1).
   2. Corte las obleas de silicio en trozos de 2,5 cm × 2,5 cm y límpielos con KOH al 20% durante 1 min. Enjuague las obleas con agua desionizada (DI). Utilice una oblea para el flujo y la capa de control.
      PRECAUCIÓN: KOH es corrosivo y debe manejarse con cuidado.
   3. Secar las piezas con gas nitrógeno comprimido de 14 psi seguido de deshidratación en una placa caliente a 120 °C durante 4 h. Antes de continuar con el siguiente paso, enfríe las dos piezas a temperatura ambiente.
   4. Tome una de las piezas de silicona y colóquela en el mandril de una recubridora de centrifugado y encienda la aspiradora para mantener la oblea en su lugar. En la pieza de silicio, coloque ~ 20 μL de hexametildisilano (HMDS) y cúbralo con el recubridor de centrifugado a 500 rotación por minuto (rpm) durante 5 s seguido de 3.000 rpm durante 30 s.
      PRECAUCIÓN: Este paso debe realizarse con luz amarilla. No utilice luz blanca en la habitación.
   5. Para obtener un espesor fotorresistente uniforme de ~40 μm (específico para la capa de flujo; adecuado para obtener imágenes de animales de la etapa larval temprana 1 a la etapa 3 (L1 - L3), cubra la oblea de silicio con ~ 1.5 ml de fotorresistencia-1 negativa usando una recubridora de centrifugado a 500 rpm durante 5 s seguida de 2,000 rpm durante 30 s.
   6. Repita los pasos 1.1.4 y 1.1.5 con la segunda oblea para obtener un espesor fotorresistente uniforme de ~40 μm específico para la capa de control.
   7. Alternativamente, para aumentar el grosor de la capa de flujo a ~80 μm para animales más viejos, cubra las obleas de silicio con ~1.5 ml de fotorresistencia-2 negativa usando el recubridor de centrifugado a 500 rpm durante 5 s seguido de 2,000 rpm durante 30 s. Este grosor es adecuado para la etapa L3 a animales adultos.
      PRECAUCIÓN: Sostenga las obleas de silicio por sus lados para evitar cualquier daño a las capas recubiertas de centrifugado. Mantenga las luces blancas apagadas durante este paso.
   8. Hornear las piezas de silicio recubiertas de fotorresistencia (para capas de flujo y control) en una placa caliente a 65 °C durante 1 minuto seguido de 95 °C durante 10 min. Enfríe las piezas horneadas a temperatura ambiente.
      NOTA: Las piezas de silicona horneadas se pueden almacenar durante un día antes de continuar con el siguiente paso. Almacenar en la oscuridad y no exponer a la luz blanca.
   9. Coloque piezas de silicona cocidas suavemente en la etapa de exposición del iluminador UV con la superficie recubierta de fotorresistencia frente a la lámpara UV. Exponga las dos piezas por separado a UV durante 15 s, utilizando una lámpara de 200 W, a través de una fotomáscara con patrones 1 y 2 para obtener capas de flujo y control, respectivamente.
      PRECAUCIÓN: Use gafas de seguridad y evite la exposición directa a la luz UV. No encienda la luz blanca en la habitación durante esta etapa.
   10. Hornea las dos piezas de silicona expuestas con la capa recubierta hacia arriba, a 65 °C seguido de 95 °C durante 1 min y 10 min respectivamente. Enfríe las piezas a temperatura ambiente antes de continuar con el siguiente paso.
   11. Desarrolle los patrones remojando las piezas de silicio en la solución reveladora fotorresistente (dilución 1:3 del revelador en isopropanol) durante 20 min. Una vez que el patrón sea visible, enjuague las piezas con alcohol isopropílico puro (IPA) y séquelas suavemente con gas nitrógeno (14 psi).
       PRECAUCIÓN: Utilice un ambiente bien ventilado para este tratamiento químico para evitar la exposición humana. Use luz blanca solo después de desarrollar las características y enjuagar con IPA.
   12. Mantenga las piezas de silicona en un desecador con la superficie recubierta hacia arriba. Exponga las piezas a vapores de silano vertiendo 50 μL de tricloro puro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silano en un pequeño vaso de plástico o un portaobjetos de vidrio. Colocar la taza/portaobjetos dentro de un desecador e incubar durante 2 h.
       PRECAUCIÓN: Evite la exposición directa al vapor de silano. Utilice siempre una cámara sellada para el tratamiento con vapor de silano.
       NOTA: Si es necesario, las piezas de silicio desarrolladas se pueden almacenar durante 1-2 días antes de continuar con el siguiente paso.
2. Fabricación de chips PDMS
   1. Haga PDMS en un vaso de plástico mezclando la base de elastómero con el agente de curado en una proporción de 10: 1. Mezclar bien el contenido revolviendo constantemente durante 3 min. La mezcla creará muchas burbujas de aire en la mezcla PDMS.
   2. Desgasifica la mezcla PDMS en un desecador durante 30 minutos para eliminar todas las burbujas de aire.
      PRECAUCIÓN: Asegúrese de que las burbujas de aire se eliminen de la mezcla PDMS antes de verterla en las características, ya que las burbujas pueden causar dispositivos defectuosos y no funcionales.
   3. Coloque las obleas de silicio con la capa de control (patrón 2) en una placa de Petri. Vierta suavemente una capa de mezcla PDMS de 5 mm de espesor sobre la pieza de silicona evitando la formación de burbujas.
   4. Desgasifica la mezcla de PDMS en un desecador para eliminar burbujas adicionales que se forman durante el proceso de vertido de PDMS.
   5. Coloque la oblea de silicio con capa de flujo (patrón 1) en el mandril del spinner aplicando una presión de vacío de 200-500 mTorr para sostener la oblea. Vierta ~ 1 ml de PDMS en la oblea de silicio y cúbrala con una recubridora de centrifugado a 500 rpm durante 5 s seguido de 1,000 rpm durante 30 s para obtener una capa de ~ 80 μm de espesor.
   6. Hornear las dos obleas de silicio con el PDMS recubierto por centrifugado y verter las capas de PDMS a 50 °C en un horno de convección de aire caliente durante 6 h. Después de hornear, espere a que las piezas se enfríen a temperatura ambiente.
   7. Corte la capa PDMS de 5 mm de espesor de la pieza de silicio alrededor de la capa de control (patrón 2) con una cuchilla afilada y despegue del sustrato de silicio.
   8. Perfore dos orificios de ~ 1 mm de diámetro utilizando un perforador Harris en el depósito del bloque PDMS para conectar el canal de inmovilización y las entradas del canal de aislamiento a las líneas de gas para las deflexiones de membrana PDMS.
   9. Coloque la pieza de silicona con la capa PDMS recubierta de espín en el patrón 1 (capa de flujo), con la superficie recubierta de PDMS hacia arriba, en una bandeja de plástico. Mantenga el bloque PDMS perforado con el patrón 2 (capa de control) en la bandeja con el lado moldeado hacia arriba.
   10. Mantenga la bandeja de plástico dentro de un limpiador de plasma y exponga las dos superficies PDMS a plasma de aire de 18 W durante 2 minutos a bajo vacío bajo bajo vacío (200-600 mTorr). Aplique vacío hasta que la cámara se vuelva violeta brillante. Realice este paso con poca luz para ver el cambio de color del plasma.
   11. Saque los dos bloques tratados con plasma y únalos suavemente presionando las superficies tratadas con plasma de los patrones 1 y 2. Hornear los patrones unidos a 50 °C durante 2 h en un horno de convección de aire caliente.
   12. Saque el dispositivo unido del horno. Corte el dispositivo unido de la oblea de silicio con el patrón 1 y el patrón 2, y perfore los orificios en los depósitos de entrada y salida de la capa de flujo con el perforador Harris.
   13. Coloque el bloque PDMS unido con la capa de flujo hacia arriba en una bandeja de plástico. Mantenga un vaso de cubierta limpio (#1.5) en la misma bandeja. Exponga los bloques y el vidrio de la cubierta al plasma de aire de 18 W durante 2 min. Ajuste la presión del vacío para ver una cámara violeta.
       NOTA: Este paso debe hacerse con poca luz para ver el cambio de color del plasma. Para limpiar el vidrio de la cubierta, lávelo con IPA y séquelo con gas nitrógeno a 14 psi.
   14. Coloque el bloque PDMS expuesto con plasma en la parte superior del vidrio de la cubierta y hornee la estructura unida en un horno a 50 °C durante 2 h. Guarde el dispositivo en una cámara limpia para cualquier experimento futuro.

2. Cebado de membrana PDMS

1. Tome el dispositivo y colóquelo en un microscopio estereoscópico y conecte los tubos. Conecte el tubo micro flex (diámetro interior ~5 mm, diámetro exterior ~8 mm) a una línea de gas nitrógeno comprimido en un extremo. Conecte un conector de tres vías en el otro extremo. Los tubos 1 y 2 de los conectores de tres vías se conectarán a la trampa y a las membranas aislantes, respectivamente.
2. Conecte dos tubos micro flex (diámetro interior ~1,6 mm, diámetro exterior ~5 mm) a los dos puertos de salida de la llave de paso de tres vías. Conecte el otro extremo de los dos tubos a una aguja de 18 G de 8 mm de largo.
3. Llene la capa de flujo con tampón M9 utilizando una micropipeta a través del puerto de entrada. Llene ambos tubos con agua DI a través del extremo conectado a la aguja. Inserte las dos agujas en los orificios perforados, conectando la membrana aislante y la membrana de captura, respectivamente.
4. Abra el regulador de gas nitrógeno a 14 psi y gire la válvula de tres vías del tubo 1 para empujar el agua hacia el dispositivo a través de los canales microfluídicos en las capas de control, a saber, las membranas de trampa y aislamiento.
5. Espere hasta que el agua llene el canal sin la presencia de ninguna gota de aire en ambos canales. Una vez que los canales están completamente llenos de agua, los canales se consideran cebados.
6. Libere la presión usando la llave de paso de tres vías una vez que los canales estén llenos de agua y cebados. El cebado puede provocar burbujas en la capa de flujo, elimine las burbujas haciendo fluir medios adicionales a través del canal de flujo.

3. Mantenimiento y sincronización de C. elegans

NOTA: Cepas de C. elegans: El estudio utilizó los siguientes transgenes PS3239 (dpy-20(e1282) syIs49 IV [MH86p(dpy-20(+) + pJB100(ZMP-1::GFP)]) para el desarrollo vulvar 32, jsIs609 (mec7p::MLS(señal de localización de matriz mitocondrial)::GFP)33 para el desarrollo de neuronas receptoras táctiles (TRN) e imágenes de transporte de mitocondrias, y wdIs51(F49H12.4::GFP + unc-119(+)) para rastrear el desarrollo de PVD ³⁴. Se siguió el protocolo estándar de cultivo y mantenimiento de C. elegans ³⁵.

1. Cultivar C. elegans en las placas de Petri del medio de crecimiento de nematodos (NGM) con E. coli OP50 como fuente de alimento a 22 °C. Mantenga las cepas de C. elegans transfiriendo repetidamente algunos hermafroditas o fragmentando una pequeña cantidad de agar con algunos animales a una nueva placa NGM con un césped OP50.
2. Después de 3-5 días, revise la placa NGM para el crecimiento de animales y huevos de C. elegans. Recoja y transfiera aproximadamente 30 huevos de un plato a un plato NGM fresco con césped OP50.
3. Para sincronizar los animales para la obtención de imágenes, transfiera todos los huevos no eclosionados de la placa cada 2 h a una placa nueva y manténgalos a 22 °C. Aproximadamente 15-20 huevos eclosionarán en cada plato.
4. Recoger los animales entre 14-16 h y 28-30 h después de la eclosión para las etapas larvaria 2 (L2) y larval 3 (L3), respectivamente. Transfiera los animales al dispositivo microfluídico para obtener imágenes. Agregue el suministro de alimentos como se describe en la siguiente sección para mantener al animal dentro del dispositivo para el crecimiento a largo plazo y los experimentos de imágenes.

4. Crecimiento de C. elegans dentro del dispositivo microfluídico de crecimiento e imágenes

1. Monte un dispositivo microfluídico de crecimiento e imágenes en un microscopio invertido y vea el patrón 2, después de conectar las membranas de aislamiento y la membrana de inmovilización, a bajas ampliaciones (4x o 10x). Asegúrese de que los canales estén llenos de agua destilada limpia.
2. Preparar una solución fresca de 1 L de medio S utilizando 10 mL de citrato de potasio 1 M pH 6.0, 10 mL de solución de metales traza, 3 mL de 1 M CaCl₂, 3 mL de 1 M MgSO₄. Prepare la solución en condiciones estériles. No esterilice en autoclave el medio S.
3. Llene el canal de flujo con medios de crecimiento (medio S) 10 min antes del experimento. Evite cualquier burbuja de aire en el canal de flujo. Fluya un medio adicional si es necesario para eliminar las burbujas de aire.
4. Elija un solo animal de la etapa de desarrollo requerida de una placa NGM en 10 μL de medio S usando una micropipeta y empuje al animal hacia el canal de flujo a través del orificio de entrada.
5. Monitoree la posición del animal en el canal de flujo utilizando un objetivo de bajo aumento. Fluya un medio adicional a través de la entrada o salida para empujar al animal y colocarlo dentro del canal de flujo restringido entre las dos membranas de aislamiento.
6. Abra la llave de paso de tres vías para aplicar una presión de 14 psi en los canales de aislamiento y empuje las membranas hacia abajo en el canal de flujo.
   NOTA: La membrana sella parcialmente el canal de flujo y restringe el movimiento de los animales a la región entre las dos membranas de aislamiento.
7. Utilizar una sola colonia de E. coli OP50 de una placa rayada para inocular 250 mL de caldo L (2,5 g de bactotriptona, 1,25 g de bacto-levadura, 1,25 g de NaCl en_H2O). Cultivar el cultivo inoculado durante la noche a 37 °C.
8. Alícuota 500 μL de cultivo de OP50 en tubos de centrífuga estériles de 1,5 ml y almacenar el material y la alícuota durante 2 semanas a 4 °C.
9. Granular el cultivo OP50 por centrifugación a 1,3 x g durante 5 min. Disuelva el pellet con 1 ml de medio S fresco (dilución 0.5x) y guárdelo a temperatura ambiente durante 3-4 días. Utilice este OP50 diluido para alimentar a C. elegans dentro de dispositivos microfluídicos.
10. Deje una gota de medio S en la parte superior de los depósitos de entrada y salida para reducir la evaporación del medio S en el canal de flujo.
11. Tomar la solución OP50 diluida en una micropipeta de 10 μL. Retire la micropunta llena con la solución OP50 de la pipeta y coloque la punta a presión en el depósito de entrada. A continuación, coloque otra punta de micropipeta con 10 μL de solución alimenticia e insértela en el depósito de salida.
12. Selle la cabeza de la punta aplicando presión con un dedo para garantizar la continuidad de las soluciones alimentarias sin ningún espacio de aire. Cambie la punta de micropipeta con la solución OP50 todos los días que no tenga más de 3-4 días.
13. Llene 20-30 μL adicionales de solución alimenticia en ambas puntas. Agregue o retire la solución alimenticia hacia y desde la punta de la micropipeta para ajustar el gradiente para empujar al animal en el canal de flujo y para ajustar la posición del animal debajo de la membrana de captura para obtener imágenes.
14. Controle el flujo de bacterias para asegurarse de que sea continuo a través de las membranas de aislamiento parcialmente cerradas en el canal de flujo utilizando imágenes de campo claro.
    NOTA: En ausencia de flujo de bacterias, los animales pueden comer las bacterias disponibles en el canal de flujo entre las dos membranas de aislamiento. En caso de que no haya bacterias o no haya flujo presente en el canal, sustituya las dos puntas de micropipeta en la entrada y salida por puntas de pipeta nuevas llenas de suministros de alimentos recién preparados.

5. Inmovilización e imagen de C. elegans

1. Inmovilización de C. elegans bajo la membrana de captura
   1. Localice un solo animal en el canal de crecimiento a bajas ampliaciones. Ajuste las alturas de la solución alimentaria en las dos puntas de micropipeta conectadas a los depósitos de entrada y salida. Empuje al animal en la dirección requerida utilizando las diferencias de presión hidrostática en el canal de flujo.
   2. Coloque al animal en el centro de la membrana de captura y controle su comportamiento de natación utilizando un objetivo de bajo aumento (4x).
   3. Gire la llave de paso de tres vías para aumentar lentamente la presión en el canal de trampa. Inmovilice al animal debajo de la membrana de la trampa en una postura recta a lo largo de la pared límite del canal de crecimiento.
      PRECAUCIÓN: Evite atrapar al animal a través del canal de flujo en una posición de curvatura Z o U. Esto hace que el cuerpo del animal sea apretado con mayor presión y causa daños permanentes a su salud.
2. Imágenes de C. elegans y liberación de la membrana
   1. Lleve y cargue el dispositivo en una plataforma de microscopio. Configure un microscopio invertido en la configuración de imagen deseada con todos los componentes ópticos necesarios (objetivo, fuente de luz, filtros de fluorescencia y un detector) para imágenes de campo brillante de alta resolución, contraste diferencial de imágenes (DIC) o fluorescencia (Figura complementaria 1).
   2. Adquiera una o varias imágenes de fluorescencia de lapso de tiempo para capturar eventos celulares y subcelulares.
   3. Adquirir imágenes de fluorescencia de las neuronas de C. elegans en función de su desarrollo utilizando un objetivo de apertura numérica (NA) de 60x, 1.4, un láser de longitud de onda de 488 nm con 7% -10% de potencia láser, una cámara CCD, en un microscopio de disco giratorio. Realice imágenes de lapso de tiempo utilizando el software provisto con el microscopio y adquiera imágenes a una velocidad de 4 cuadros por segundo (Figura complementaria 1).
   4. Después de la adquisición de imágenes, libere la presión de captura y monitoree la locomoción del animal a bajas ampliaciones: 4x y 10x. Mantenga al animal restringido dentro de la región definida por membranas aislantes (mantenidas por debajo de 14 psi durante todo el experimento).
   5. Ajuste el volumen de solución alimenticia en las dos puntas de micropipeta para continuar un flujo lento de alimentos impulsado por la gravedad en el canal de crecimiento. Este flujo de alimentos se obtiene ajustando los niveles de las soluciones alimentarias en micropipetas en la entrada y la salida (típicamente 1-5 mm de diferencia de altura).
   6. Visualice el flujo bajo un campo brillante del patrón de flujo de las bacterias en el canal de crecimiento.
      NOTA: En ausencia de flujo, el animal come la bacteria OP50 disponible, el canal parece despejado y el animal muere de hambre durante unas pocas horas. Un animal hambriento típicamente desarrolla una alta autofluorescencia, fácilmente observable al adquirir imágenes de fluorescencia de lapso de tiempo. Tales eventos tienen efectos perjudiciales sobre la fisiología animal y se evitaron en los experimentos.
   7. Repita los pasos 5.2.1-5.2.3 después de un intervalo de tiempo predeterminado para adquirir imágenes de fluorescencia/DIC/campo claro del mismo individuo en múltiples puntos de tiempo.
   8. Después de que las imágenes se adquieran en múltiples puntos de tiempo deseados del mismo animal individual, libere el aislamiento y la presión de captura. Enjuague el canal con tampón M9 y empuje al animal a través del depósito de entrada. Recupere al animal del reservorio y colóquelo en una placa de NGM fresca para un mayor control de la salud.
   9. Enjuague el canal con tampón M9 varias veces para eliminar las bacterias. Enjuague el canal de flujo con alcohol etílico al 70% (diluido en agua destilada). Seque los canales empujando el aire con una jeringa. Guarde el dispositivo en un lugar seco y libre de polvo para usarlo repetidamente en el futuro.
3. Análisis de imágenes y estadísticas
   1. Utilice el software FIJI ImageJ para el análisis de imágenes tiff. Abra imágenes tiff de las imágenes de lapso de tiempo PVD de los animales wdIs51 en Fiji ImageJ. Extraiga los mejores planos de la pila de planos z que muestran los procesos primarios seleccionando la pestaña Imagen > Proyecto Pilas > Z.
   2. Filtre toda la serie de imágenes y encuentre marcos de imagen específicos que cubran con éxito todos los procesos neuronales utilizando secciones superpuestas de los marcos de imágenes de animales. Seleccione Plugin > Analyze > Cell Counter en la barra de herramientas de FIJI. Esto abrirá una ventana para numerar diferentes ramas y mantener un recuento de cada neurona seleccionada.
   3. Seleccione Inicializar contadores > > Tipo1 y, a continuación, marque las ramas secundarias. A continuación, seleccione Tipo 2 y marque Cuaternario, haga clic en la ventana Resultados que muestra los recuentos de todas las ramas (Figura complementaria 2). Este método mostrará las ramas que ya están contadas.
   4. Abra la siguiente imagen superpuesta y cuente las ramas restantes. Este proceso evitará el doble conteo y garantizará que se cuente cada proceso. Identificar y contar el número total de ramas primarias presentes en las primeras etapas larvales de C. elegans. Realizar análisis similares para las imágenes para procesos secundarios y cuaternarios en animales más viejos.
      NOTA: Los adultos muestran muchos procesos que inervan en los músculos de la pared corporal y pueden ser difíciles de contar. Asegúrese de que cada proceso se cuente solo una vez.
   5. Calcule la distancia entre los cuerpos celulares PVD en los animales wdIs51 dibujando una línea segmentada desde el cuerpo celular PVD (CB) hasta PVC CB. Para los animales en etapa larval 4 (L4), los cuerpos celulares están muy separados y no están en el mismo marco cuando se toman imágenes con un objetivo de 60x.
   6. Seleccione imágenes superpuestas de la pila para cubrir toda la longitud del animal de la cabeza a la cola usando la pestaña Imagen > proyecto Pilas > Z de ImageJ. Dibuje líneas segmentadas a lo largo del proceso neuronal entre los CB PVD y PVC.
   7. Mida las longitudes de todas las líneas segmentadas con ImageJ > Analyze > Measure. Suma las longitudes de todos los segmentos para calcular la distancia total entre PVD y PVC CB para cada punto de tiempo.
   8. Para la longitud neuronal de los TRN en animales jsIs609 , cargue las imágenes en Fiji. Dibujar una línea segmentada a lo largo de los microtúbulos laterales posteriores (PLM; visible con GFP soluble) desde el cuerpo celular hasta el centroide de la primera mitocondria. Calcule la longitud de la línea para el primer valor de distancia.
   9. Dibuja una línea segmentada desde el centro de la primera a la segunda mitocondria. Repita este proceso para cada par de mitocondrias hasta el final de la longitud del proceso neuronal. Suma todas las longitudes para calcular la longitud total del proceso neuronal.
   10. Para el análisis del linaje celular, cargue todas las imágenes vulvares en Fiji y extraiga la mejor imagen de enfoque de las células de las imágenes de lapso de tiempo de múltiples planos z.
   11. Representar los datos como media ± error estándar de la media (SEM). Calcule la significación estadística utilizando ANOVA unidireccional para más de dos muestras o una prueba t de dos muestras para un par de muestras. Denote significación por valor de p < 0,05 (*), valor de p < 0,005 (**) y valor de p > 0,05 (ns, no significativo).

Resultados

Caracterización del dispositivo: El dispositivo de crecimiento e imagen consiste en dos capas de PDMS unidas entre sí (Figura 1) utilizando enlaces de plasma irreversibles. La capa de flujo (patrón 1) que tiene 10 mm de longitud y 40 μm u 80 μm de altura nos permite cultivar al animal en cultivo líquido (Figura 1A). La capa de captura (patrón 2) tiene una membrana de 2 mm de ancho (Figura 1B) para inmoviliza...

Discusión

En este artículo, se ha descrito un protocolo para la fabricación y el uso de un dispositivo microfluídico simple para el cultivo de C. elegans con suministro constante de alimentos e imágenes de alta resolución de un solo animal durante su desarrollo. Este proceso de fabricación es simple y se puede hacer en un ambiente no estéril. Un entorno libre de polvo es crítico durante los pasos de fabricación. La presencia de partículas de polvo conduciría a un contacto inadecuado entre las dos superficies de...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G needles	Sigma-Aldrich, Bangalore, India	Gauge 18
3-way stopcock	Cole-Parmer	WW-30600-02	Masterflex fitting with luer lock
CCD camera	Andor Technology	EMCCD C9100-13no
Circuit board film	Fine Line Imaging, Colorado, USA		The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)
Convection Oven	Meta-Lab Scientific Industries, India	MSI-5
Coverslips	Blue stat microscopic cover glass		22mm x 10Gms
Ethanol	Hi media
Harris uni-core puncher 1mm	Qiagen	Z708801
Hexamethyldisilazane	Sigma-Aldrich, Bangalore, India	440191
Hot plate	IKA	RCT B S 22
Isopropanol	Fisher Scientific	26895
KOH	Fisher Scientific
Laser Scanning Microscope	ZEISS	LSM 5 LIVE
Micropipette tips	Tarsons		0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply
Negative Photoresist-1	Microchem	SU8-2025	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2	Microchem	SU8-2050	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Nitrogen gas	Local Supplier	Commercial nitrogen gas	Cylinder volume of 7 cubic meter
PDMS (Curing solution)	Dow Corning Corporation, MI, USA	Sylgard curing solution	curing agent
Petri plates	Praveen Scientific Corporation
Plasma cleaner	Harrick Plasma, NY, USA	PDC-32G
Razor and blades	Lister surgical Blade
Silicon Elastomer (Base)	Dow Corning Corporation, MI, USA	Sylgard 184 base	elastomer base
Silicon tubes	Fisher Scientific		Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm
Silicon wafer	University Wafer, MA, USA	[100] orientation, 4-inch diameter	Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer
Spin Coater	SPS-Europe B.V., The Netherlands	SPIN 150
Spinning Disk microscope	Perkin Elmer ultra-view VOX system	CSU-X1-A3 N	The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.
SU8 developer	Microchem, MA, USA	SU8 Developer
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane	Sigma-Aldrich, Bangalore, India	448931	Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic
UV lamp	Oriel Instruments, Bangalore, India		200 Watt and collimated UV light source
Volocity software	Perkin-Elmer		Image analysis