JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Протокол описывает простую микрофлюидную конструкцию чипа и методологию микрофабрикации, используемую для выращивания C. elegans в присутствии непрерывного питания в течение 36 ч. Устройство для роста и визуализации также обеспечивает прерывистую долгосрочную визуализацию клеточных и субклеточных процессов с высоким разрешением в течение нескольких дней.

Аннотация

Caenorhabditis elegans (C. elegans) оказался ценной модельной системой для изучения биологических процессов развития и клеток. Понимание этих биологических процессов часто требует длительной и повторной визуализации одного и того же животного. Длительное время восстановления, связанное с обычными методами иммобилизации, выполняемыми на агаровых прокладках, оказывает пагубное влияние на здоровье животных, что делает неуместным повторное изображение одного и того же животного в течение длительных периодов времени. В этой статье описывается конструкция микрофлюидного чипа, метод изготовления, протокол культивирования C. elegans на чипе и три примера долгосрочной визуализации для изучения процессов развития у отдельных животных. Чип, изготовленный из полидиметилсилоксана и склеенный на покровном стекле, обездвиживает животных на стеклянной подложке с помощью эластомерной мембраны, которая отклоняется с помощью газообразного азота. Полная иммобилизация C. elegans обеспечивает надежную покадровую визуализацию клеточных и субклеточных событий без анестезии. Геометрия канала с большим поперечным сечением позволяет животному свободно перемещаться в пределах двух частично герметичных изоляционных мембран, позволяющих расти в канале с непрерывной подачей пищи. Используя этот простой чип, можно выполнить визуализацию явлений развития, таких как рост нейронного процесса, развитие вульвы и дендритная арборизация в сенсорных нейронах PVD, когда животное растет внутри канала. Долговременный чип роста и визуализации работает с одной линией давления, без внешних клапанов, недорогими жидкими расходными материалами и использует стандартные протоколы обработки червей, которые могут быть легко адаптированы другими лабораториями с использованием C. elegans.

Введение

Caenorhabditis elegans оказался мощным модельным организмом для изучения клеточной биологии, старения, биологии развития и нейробиологии. Такие преимущества, как прозрачное тело, короткий жизненный цикл, простота обслуживания, определенное количество клеток, гомология с несколькими человеческими генами и хорошо изученная генетика, привели к тому, что C. elegans стал популярной моделью как для открытий фундаментальной биологии, так и для прикладных исследований 1,2. Понимание биологических и эволюционных процессов клетки из повторяющихся долгосрочных наблюдений за отдельными животными может оказаться полезным. Условно C. elegans обезболивают на агаровых подушечках и визуализируют под микроскопом. Неблагоприятное воздействие анестетиков на здоровье животных ограничивают применение анестезируемых животных для длительной и повторной прерывистой визуализации одного и того же животного 3,4. Последние достижения в области микрофлюидных технологий и их адаптация к безанестезному отлову C. elegans с незначительной опасностью для здоровья позволяют получать изображения одного и того же животного с высоким разрешением в течение короткого и длительного периода времени.

Микрофлюидные чипы были разработаны для высокопроизводительного скрининга C. elegans'5 6,7,8, улавливания и дозирования 9, скрининга лекарств10,11, стимуляции нейронов с помощью визуализации высокого разрешения12 и визуализации животного с высоким разрешением 12,13,14. Также разработаны ультратонкие микрофлюидные листы для иммобилизации на слайдах15. Долгосрочные исследования C. elegans были выполнены с использованием изображений животных с низким разрешением, растущих в жидкой культуре, для наблюдения за ростом, динамикой кальция, влиянием лекарств на их поведение 16,17,18,19, их долголетием и старением 20. Долгосрочные исследования с использованием микроскопии высокого разрешения были проведены для оценки синаптического развития21, регенерации нейронов22 и митохондриального добавления23. Долгосрочная визуализация высокого разрешения и отслеживание судьбы и дифференцировки клеток были выполнены в многоканальных устройствах24,25. Несколько клеточных и субклеточных событий происходят в течение нескольких часов и требуют захвата одного и того же человека в разные моменты времени во время их развития, чтобы охарактеризовать все промежуточные этапы процесса для понимания клеточной динамики in vivo. Чтобы изобразить биологический процесс, такой как органогенез, развитие нейронов и миграция клеток, животное должно быть обездвижено в одной и той же ориентации в нескольких точках времени. Ранее мы опубликовали протокол для визуализации C. elegans с высоким разрешением в течение более 36 ч, чтобы определить, где митохондрии добавляются вдоль нейронов сенсорных рецепторов (TRNs)23.

В этой статье представлен протокол для создания методологии на основе микрофлюидики для повторного изображения с высоким разрешением. Это устройство с одним каналом потока лучше всего подходит для повторной визуализации одного животного на устройство. Чтобы улучшить пропускную способность и изображение многих животных одновременно, несколько устройств могут быть подключены к одной и той же линии давления, но с отдельными трехсторонними разъемами, управляющими одним животным в каждом устройстве. Дизайн полезен для исследований, которые требуют покадровых изображений с высоким разрешением, таких как постэмбриональные процессы развития, миграция клеток, транспорт органелл, исследования экспрессии генов и т. Д. Технология может быть ограниченной для некоторых применений, таких как исследования продолжительности жизни и старения, которые требуют параллельного роста и визуализации многих животных на поздней стадии. Для изготовления этого устройства использовался эластомер полидиметилсилоксана (PDMS) из-за его биостабильности26, биосовместимости 27,28, газопроницаемости 29,30 и перестраиваемого модуля упругости31. Это двухслойное устройство позволяет выращивать животных с непрерывной подачей пищи в микрофлюидном канале и улавливать отдельных C. elegans через мембранное сжатие PDMS с использованием газообразного азота. Это устройство является расширением ранее опубликованного устройства с преимуществом выращивания и визуализации одного и того же животного в микроканале под непрерывной подачей пищи3. Дополнительная изоляционная мембранная сеть и улавливающая мембрана шириной 2 мм обеспечивают эффективную иммобилизацию развивающихся животных. Устройство использовалось для наблюдения за развитием нейронов, развитием вульвы и дендритной арборизацией в сенсорных нейронах PVD. Животные растут без неблагоприятных последствий для здоровья в устройстве и могут быть многократно обездвижены, чтобы облегчить визуализацию субклеточных событий у одного и того же животного во время его развития.

Весь протокол разделен на пять частей. Часть 1 описывает изготовление устройства для чипа роста и визуализации. В части 2 описывается, как настроить систему давления для отклонения мембраны PDMS для иммобилизации и изоляции отдельных C. elegans. Часть 3 описывает, как синхронизировать C. elegans на пластине среды роста нематод (NGM) для визуализации устройства. Часть 4 описывает, как загрузить одно животное в устройство и вырастить животное внутри микрофлюидного устройства в течение нескольких дней. Часть 5 описывает, как обездвижить отдельное животное в нескольких точках времени, захватить изображения с высоким разрешением с использованием различных целей и проанализировать изображения с помощью Фиджи.

протокол

1. Изготовление устройства роста и визуализации

  1. Изготовление пресс-форм SU8
    1. Проектирование шаблонов 1 (проточный слой) и 2 (контрольный слой) с использованием прямоугольных форм в программном обеспечении для обработки текстов (или программном обеспечении автоматизированного проектирования САПР) и печать фотомаск с помощью лазерного плоттера с минимальным размером объекта 8 мкм на пленке на основе полиэстера (рисунок 1).
    2. Кремниевые пластины нарезать кусочками по 2,5 см × 2,5 см и очистить их 20% KOH в течение 1 мин. Промыть пластины в деионизированной (DI) воде. Используйте по одной пластине для потока и регулирующего слоя.
      ВНИМАНИЕ: KOH является коррозионным и должен обрабатываться с осторожностью.
    3. Высушите кусочки сжатым газообразным азотом 14 фунтов на квадратный дюйм с последующим обезвоживанием на конфорке при 120 °C в течение 4 часов. Прежде чем перейти к следующему шагу, охладите две части до комнатной температуры.
    4. Возьмите один из кусочков кремния и положите его на патрон спин-коатера и включите вакуум, чтобы удерживать пластину на месте. На кусок кремния нанесите ~ 20 мкл гексаметилдисилана (HMDS) и покройте его с помощью спин-коатера со скоростью 500 оборотов в минуту (об/мин) в течение 5 с последующим 3000 оборотами в минуту в течение 30 с.
      ВНИМАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен при желтом свете. Не используйте белый свет в комнате.
    5. Чтобы получить однородную толщину фоторезиста ~ 40 мкм (специфичную для слоя потока; подходит для визуализации животных ранней личиночной стадии 1 до стадии 3 (L1 - L3), покройте кремниевую пластину ~ 1,5 мл отрицательного фоторезиста-1 с использованием спин-коатера при 500 об/мин в течение 5 с последующим 2000 оборотами в минуту в течение 30 с.
    6. Повторите шаги 1.1.4 и 1.1.5 со второй пластиной для получения однородной толщины фоторезиста ~40 мкм, специфичной для контрольного слоя.
    7. Альтернативно, чтобы увеличить толщину проточного слоя до ~80 мкм для пожилых животных, покрывайте кремниевые пластины ~1,5 мл отрицательного фоторезиста-2 с помощью спин-коатера при 500 об/мин в течение 5 с последующим 2000 об/мин в течение 30 с. Такая толщина подходит для стадии L3 для взрослых животных.
      ВНИМАНИЕ: Держите кремниевые пластины по бокам, чтобы избежать повреждения слоев со спин-покрытием. Держите белый свет выключенным во время этого шага.
    8. Выпекайте кремниевые кусочки с фоторезистическим покрытием (для проточных и контрольных слоев) на конфорке при 65 °C в течение 1 мин, а затем 95 °C в течение 10 мин. Охладить запеченные кусочки до комнатной температуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обожженные кусочки кремния можно хранить в течение одного дня, прежде чем перейти к следующему шагу. Хранить в темноте и не подвергать воздействию белого света.
    9. Поместите мягкие обожженные кусочки кремния на стадию экспозиции УФ-осветителя с поверхностью с фоторезистическим покрытием, обращенной к УФ-лампе. Подвергайте две части отдельно воздействию ультрафиолета в течение 15 с, используя лампу мощностью 200 Вт, через фотомаску с узорами 1 и 2, чтобы получить слои потока и управления соответственно.
      ВНИМАНИЕ: Носите защитные очки и избегайте прямого воздействия ультрафиолетового излучения. Не включайте белый свет в комнате на этом этапе.
    10. Выпекайте два открытых кусочка кремния с покрытием, обращенным вверх, при 65 °C, а затем 95 °C в течение 1 мин и 10 мин соответственно. Охладите кусочки до комнатной температуры, прежде чем перейти к следующему шагу.
    11. Разработайте паттерны, замочив кусочки кремния в растворе разработчика фоторезиста (разбавление разработчика 1:3 в изопропаноле) в течение 20 мин. Как только рисунок будет виден, промойте кусочки чистым изопропиловым спиртом (IPA) и осторожно высушите феном с использованием газообразного азота (14 фунтов на квадратный дюйм).
      ВНИМАНИЕ: Используйте хорошо проветриваемую среду для этой химической обработки, чтобы избежать воздействия на человека. Используйте белый свет только после того, как будут разработаны и промыты IPA.
    12. Храните кусочки кремния в осушителе с покрытой поверхностью вверх. Подвергайте кусочки воздействию паров силана, наливая 50 мкл чистого трихлора (1H, 1H, 2H, 2H-перфтороктил) силана на небольшой пластиковый стаканчик или стеклянную горку. Поместите чашку/горку внутрь осушителя и инкубируйте в течение 2 ч.
      ВНИМАНИЕ: Избегайте прямого воздействия паров силана. Всегда используйте герметичную камеру для обработки паров силана.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости разработанные кремниевые кусочки можно хранить в течение 1-2 дней, прежде чем перейти к следующему этапу.
  2. Изготовление чипов PDMS
    1. Сделайте PDMS в пластиковом стаканчике, смешав эластомерную основу с отверждающим агентом в соотношении 10:1. Хорошо перемешайте содержимое, постоянно помешивая в течение 3 мин. Смешивание создаст много пузырьков воздуха в смеси PDMS.
    2. Дегазируйте смесь PDMS в осушителе в течение 30 минут, чтобы удалить все пузырьки воздуха.
      ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что пузырьки воздуха удалены из смеси PDMS, прежде чем она будет вылита на объекты, так как пузырьки могут привести к дефектным и нефункциональным устройствам.
    3. Поместите кремниевые пластины с контрольным слоем (рисунок 2) в чашку Петри. Аккуратно налейте слой смеси PDMS толщиной 5 мм на кусок кремния, избегая образования пузырьков.
    4. Дегазируйте смесь PDMS в осушителе для удаления дополнительных пузырьков, которые образуются в процессе заливки PDMS.
    5. Поместите кремниевую пластину с проточным слоем (рисунок 1) на спиннер-патрон, применяя вакуумное давление 200-500 мТорр для удержания пластины. Налейте ~ 1 мл PDMS на кремниевую пластину и покройте ее с помощью спин-коатера при 500 об/мин в течение 5 с, а затем 1000 об/мин в течение 30 с, чтобы получить слой толщиной ~ 80 мкм.
    6. Выпекайте две кремниевые пластины с отжимным покрытием PDMS и налитыми слоями PDMS при 50 °C в конвекционной печи горячего воздуха в течение 6 ч. После выпечки подождите, пока кусочки остынут при комнатной температуре.
    7. Вырежьте слой PDMS толщиной 5 мм из кремниевого куска вокруг контрольного слоя (рисунок 2) с помощью острого лезвия и отклейте его от кремниевой подложки.
    8. Пробивайте два отверстия диаметром ~1 мм с помощью перфоратора Harris в резервуаре блока PDMS для подключения иммобилизационного канала и входов изоляционного канала к газовым линиям для прогибов мембраны PDMS.
    9. Поместите кремниевый кусок со слоем PDMS со спиновым покрытием на рисунок 1 (слой потока), с поверхностью, покрытой PDMS, обращенной вверх, на пластиковый лоток. Держите перфорированный блок PDMS с рисунком 2 (контрольный слой) на лотке с формованной стороной вверх.
    10. Держите пластиковый лоток внутри плазмоочистителя и подвергайте две поверхности PDMS воздействию воздушной плазмы мощностью 18 Вт в течение 2 мин при низком вакууме (200-600 мТорр). Применяйте вакуум до тех пор, пока камера не станет ярко-фиолетовой. Выполните этот шаг при слабом освещении, чтобы увидеть изменение цвета плазмы.
    11. Выньте два блока, обработанных плазмой, и осторожно свяжите блоки, прижав обработанные плазмой поверхности узоров 1 и 2 вместе. Выпекать склеенные узоры при 50 °C в течение 2 ч в конвекционной печи горячего воздуха.
    12. Выньте склеенное устройство из духовки. Вырежьте склеенное устройство из кремниевой пластины с рисунком 1 и рисунком 2 и пробьете отверстия во входном и выходном резервуарах проточного слоя с помощью перфоратора Harris.
    13. Поместите склеенный блок PDMS с проточным слоем вверх на пластиковый лоток. Держите чистое покровное стекло (#1.5) на том же лотке. Подвергайте блоки и покровное стекло воздействию воздушной плазмы 18 Вт в течение 2 мин. Отрегулируйте вакуумное давление, чтобы увидеть фиолетовую камеру.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен при слабом освещении, чтобы увидеть изменение цвета плазмы. Чтобы очистить покровное стекло, вымойте его IPA и высушите феном, используя газообразный азот при 14 фунтах на квадратный дюйм.
    14. Поместите плазменный блок PDMS поверх покровного стекла и выпекайте склеенную структуру в духовке при температуре 50 °C в течение 2 ч. Храните устройство в чистой камере для любого будущего эксперимента.

2. Мембранная грунтовка PDMS

  1. Возьмите прибор и поставьте его на стереомикроскоп и прикрепите трубки. Подключите микрогибную трубку (внутренний диаметр ~5 мм, наружный диаметр ~8 мм) к газовой линии сжатого азота на одном конце. Подключите трехсторонний разъем на другом конце. Трубки 1 и 2 трехходовых соединителей будут соединены с ловушкой и изолирующей мембранами соответственно.
  2. Подключите две микрогибные трубки (внутренний диаметр ~1,6 мм, наружный диаметр ~5 мм) к двум выходным портам трехстороннего запорного крана. Соедините другой конец двух трубок с иглой длиной 18 г длиной 8 мм.
  3. Заполните слой потока буфером M9 с помощью микропипетки через входной порт. Заполните обе трубки водой DI через конец, соединенный с иглой. Вставьте две иглы в перфорированные отверстия, соединив изолирующую и улавливающую мембрану соответственно.
  4. Откройте регулятор газообразного азота при 14 фунтах на квадратный дюйм и поверните трехсторонний клапан из трубки 1, чтобы протолкнуть воду в устройство через микрофлюидные каналы в слоях управления, а именно, ловушку и изоляционные мембраны.
  5. Подождите, пока вода не заполнит канал без присутствия каких-либо капель воздуха в обоих каналах. Как только каналы полностью заполнены водой, каналы считаются загрунтованными.
  6. Снимите давление с помощью трехстороннего запорного крана, как только каналы будут заполнены водой и загрунтованы. Грунтовка может привести к образованию пузырьков в проточном слое, удалить пузырьки путем протекания дополнительной среды через канал потока.

3. Обслуживание и синхронизация C. elegans

ПРИМЕЧАНИЕ: Штаммы C. elegans : В исследовании использовались следующие трансгены PS3239 (dpy-20(e1282) syIs49 IV [MH86p(dpy-20(+) + pJB100(ZMP-1::GFP)]) для развития вульвы32, jsIs609 (mec7p::MLS(сигнал локализации митохондриальной матрицы)::GFP)33 для развития нейронов сенсорных рецепторов (TRN) и визуализации транспорта митохондрий и wdIs51(F49H12.4::GFP + unc-119(+)) для отслеживания развития PVD34. Стандарт C. elegans культуры и протокола поддержания былсоблюден 35.

  1. Выращивайте C. elegans на пластинах Петри из среды роста нематод (NGM) с E. coli OP50 в качестве источника пищи при 22 °C. Поддерживайте штаммы C. elegans , многократно перенося несколько гермафродитов или разбивая небольшое количество агара с несколькими животными на новую пластину NGM с газоном OP50.
  2. Через 3-5 дней проверьте пластину NGM на наличие роста животных и яиц C. elegans . Соберите и переложите около 30 яиц с тарелки на свежую тарелку NGM с газоном OP50.
  3. Чтобы синхронизировать животных для визуализации, переносите все невылупившиеся яйца с тарелки каждые 2 ч на свежую тарелку и поддерживайте их при 22 °C. Примерно 15-20 яиц вылупятся на каждой тарелке.
  4. Подберите животных между 14-16 ч и 28-30 ч после вылупления на стадии личинок 2 (L2) и личинки 3 (L3) соответственно. Перенесите животных на микрофлюидное устройство для визуализации. Добавьте запас пищи, как описано в следующем разделе, чтобы поддерживать животное внутри устройства для долгосрочного роста и экспериментов с визуализацией.

4. Рост C. elegans внутри микрофлюидного устройства роста и визуализации

  1. Установите микрофлюидное устройство для роста и визуализации на перевернутом микроскопе и просмотрите рисунок 2 после соединения изоляционных мембран и иммобилизационной мембраны при низком увеличении (4x или 10x). Убедитесь, что каналы заполнены чистой дистиллированной водой.
  2. Готовят свежий 1 л растворА S-среды, используя 10 мл 1 М калия цитрата рН 6,0, 10 мл раствора следовых металлов, 3 мл 1 МCaCl2, 3 мл 1 М МгСО4. Готовят раствор в стерильных условиях. Не автоклавируйте S-среду.
  3. Заполните канал потока питательными средами (S-средой) за 10 мин до начала эксперимента. Избегайте пузырьков воздуха в канале потока. При необходимости пропустите дополнительную среду для удаления пузырьков воздуха.
  4. Выберите одно животное из требуемой стадии развития из пластины NGM в 10 мкл S-среды с помощью микропипетки и протолкните животное в канал потока через входное отверстие.
  5. Контролируйте положение животного в канале потока, используя объектив с низким увеличением. Пропустите дополнительную среду через входное или выходное отверстие, чтобы подтолкнуть животное и расположить его в канале потока, ограниченном между двумя изоляционными мембранами.
  6. Откройте трехсторонний запорный кран, чтобы применить давление 14 фунтов на квадратный дюйм в изоляционных каналах и протолкнуть мембраны вниз в канал потока.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мембрана частично герметизирует канал потока и ограничивает движение животных в области между двумя изоляционными мембранами.
  7. Используйте одну колонию E. coli OP50 из полосатой пластины для прививки 250 мл L Бульона (2,5 г бакто-триптона, 1,25 г бакто-дрожжей, 1,25 г NaCl вH2O). Выращивайте привитую культуру в течение ночи при 37 °C.
  8. Aliquot 500 мкл культуры OP50 в 1,5 мл стерильных центрифужных трубок и хранить запас и аликвоту в течение 2 недель при 4 °C.
  9. Гранулированная культура OP50 методом центрифугирования при 1,3 х г в течение 5 мин. Растворить гранулу с 1 мл свежей S-среды (0,5-кратное разведение) и хранить при комнатной температуре в течение 3-4 дней. Используйте этот разбавленный OP50 для кормления C. elegans внутри микрофлюидных устройств.
  10. Оставьте каплю S-среды поверх впускного и выпускного резервуаров, чтобы уменьшить испарение S-среды в канале потока.
  11. Принимают разбавленный раствор OP50 в микропипетке объемом 10 мкл. Извлеките микрокончик, заполненный раствором OP50, из пипетки и вставьте наконечник во входной резервуар. Затем поместите еще один наконечник микропипетки с 10 мкл пищевого раствора и вставьте его в выходной резервуар.
  12. Запечатайте головку наконечника, применяя давление пальцем, чтобы обеспечить непрерывность пищевых растворов без какого-либо воздушного зазора. Меняйте наконечник микропипетки раствором OP50 каждый день, который не старше 3-4 дней.
  13. Заполните дополнительно 20-30 мкл пищевого раствора в обоих кончиках. Добавьте или удалите пищевой раствор на кончик микропипетки и с него, чтобы отрегулировать градиент, чтобы подтолкнуть животное в канал потока и отрегулировать положение животного под улавливающей мембраной для визуализации.
  14. Контролируйте поток бактерий, чтобы обеспечить его непрерывность через частично закрытые изоляционные мембраны в канале потока, используя изображения яркого поля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При отсутствии потока бактерий животные могут съесть доступные бактерии в канале потока между двумя изоляционными мембранами. В случае отсутствия бактерий или потока в канале замените два наконечника микропипетки на входе и выходе новыми наконечниками пипетки, заполненными свежеприготовленными продуктами питания.

5. Иммобилизация и визуализация C. elegans

  1. Иммобилизация C. elegans под улавливающей мембраной
    1. Найдите одно животное в канале роста при небольшом увеличении. Отрегулируйте высоту пищевого раствора в двух наконечниках микропипетки, соединенных с входным и выходным резервуарами. Толкайте животное в нужном направлении, используя перепады гидростатического давления в проточном канале.
    2. Расположите животное в центре улавливающей мембраны и контролируйте его поведение при плавании с помощью объектива с низким увеличением (4x).
    3. Поворачивайте трехсторонний запорный кран, чтобы медленно увеличивать давление в канале ловушки. Обездвиживают животное под мембраной ловушки в прямой позе вдоль пограничной стенки канала роста.
      ВНИМАНИЕ: Избегайте захвата животного через канал потока в положении Z или U изгиба. Это заставляет тело животного сжиматься с большим давлением и наносит непоправимый ущерб его здоровью.
  2. C. визуализация элеганса и высвобождение из мембраны
    1. Переносите и загружайте устройство на ступень микроскопа. Настройте инвертированный микроскоп на требуемых настройках изображения со всеми необходимыми оптическими компонентами (объектив, источник света, флуоресцентные фильтры и детектор) для яркого поля высокого разрешения, дифференциального контраста изображения (DIC) или флуоресцентной визуализации (дополнительный рисунок 1).
    2. Получение одного или нескольких покадровых флуоресцентных изображений для захвата клеточных и субклеточных событий.
    3. Получение флуоресцентных изображений нейронов C. elegans в зависимости от их развития с помощью объектива 60x, 1,4 числовой апертуры (NA), лазера с длиной волны 488 нм с мощностью лазера 7%-10%, ПЗС-камеры на вращающемся дисковом микроскопе. Выполняйте покадровую визуализацию с помощью программного обеспечения, поставляемого с микроскопом, и получайте изображения со скоростью 4 кадра в секунду (дополнительный рисунок 1).
    4. После получения снимков отпустите давление отлова и следите за передвижением животного при малых увеличениях – 4х и 10х. Держите животное ограниченным в пределах области, определенной изолирующими мембранами (держали под 14 фунтов на квадратный дюйм на протяжении всего эксперимента).
    5. Отрегулируйте объем пищевого раствора в двух наконечниках микропипетки, чтобы продолжить медленный гравитационный поток пищи в канале роста. Этот пищевой поток получают путем регулировки уровней пищевых растворов в микропипетках на входе и выходе (обычно разница высот 1-5 мм).
    6. Визуализируйте поток под ярким полем от структуры потока бактерий в канале роста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При отсутствии потока животное съедает имеющиеся бактерии OP50, канал кажется прозрачным, и животное голодает в течение нескольких часов. У голодающего животного обычно развивается высокая автофлуоресценция, которую легко наблюдать при получении покадровых флуоресцентных изображений. Такие события оказывают пагубное влияние на физиологию животных и избегались в экспериментах.
    7. Повторите шаги 5.2.1-5.2.3 через заданный интервал времени для получения флуоресцентных/ОВС/ярко-полевых изображений одного и того же человека в нескольких точках времени.
    8. После того, как изображения получены в несколько желаемых временных точек от одного и того же отдельного животного, освободите давление изоляции и захвата. Промыть канал буфером М9 и протолкнуть животное через входной резервуар. Извлеките животное из резервуара и поместите его на свежую пластину NGM для дальнейшего мониторинга здоровья.
    9. Промывайте канал буфером M9 несколько раз, чтобы удалить бактерии. Промыть проточный канал 70% этиловым спиртом (разведенным в дистиллированной воде). Высушите каналы, протолкнув воздух с помощью шприца. Храните устройство в сухом беспыльном месте для повторного использования в будущем.
  3. Анализ изображений и статистика
    1. Используйте программное обеспечение FIJI ImageJ для анализа изображений tiff. Откройте tiff изображения PVD-покадровых изображений животных wdIs51 в Fiji ImageJ. Извлеките лучшие плоскости из стека z-плоскостей, показывающих основные процессы, выбрав вкладку Изображение > Стеки > проекта Z.
    2. Просмотрите всю серию изображений и найдите конкретные кадры изображения, которые успешно охватывают все нейронные процессы, используя перекрывающиеся участки рамок изображения животных. Выберите Плагин > Анализировать счетчик ячеек > на панели инструментов FIJI. Это откроет окно для нумерации различных ветвей и подсчета каждого выбранного нейрона.
    3. Выберите Инициализировать счетчики > > Type1, затем отметьте дополнительные ветви. Затем выберите Тип 2 и отметьте Четвертичный, нажмите окно Результаты, показывающее количество всех ветвей (Дополнительный рисунок 2). Этот метод отобразит ветви, которые уже подсчитаны.
    4. Откройте следующее перекрывающееся изображение и подсчитайте оставшиеся ветви. Этот процесс предотвратит двойной учет и обеспечит подсчет каждого процесса. Определите и подсчитайте общее количество первичных ветвей, присутствующих на ранних личиночных стадиях C. elegans. Выполните аналогичный анализ для изображений вторичных и четвертичных процессов у пожилых животных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Взрослые показывают много процессов, которые иннервируют в мышцах стенки тела и могут быть трудными для подсчета. Убедитесь, что каждый процесс учитывается только один раз.
    5. Рассчитайте расстояние между телами pvD-клеток у животных wdIs51 , проведя сегментированную линию от тела PVD-клетки (CB) до PVC CB. Для животных стадии 4 (L4) клеточные тела находятся далеко друг от друга и не находятся в одном кадре при изображении с 60-кратным объективом.
    6. Выберите перекрывающиеся изображения из стека, чтобы покрыть всю длину животного от головы до хвоста, используя вкладку «Изображение» > проекта «Стеки > Z » из ImageJ. Нарисуйте сегментированные линии вдоль нейронного процесса между PVD и PVC CB.
    7. Измерьте длины для всех сегментированных линий с помощью ImageJ > Analyze > Measure. Добавьте длины для всех сегментов, чтобы рассчитать общее расстояние между PVD и PVC CB для каждой точки времени.
    8. Для длины нейронов TRN у животных jsIs609 загрузите изображения на Фиджи. Проведите сегментированную линию вдоль задних боковых микротрубочек (PLM; видимых с растворимым GFP) от тела клетки до центроида первой митохондрии. Вычислите длину линии для первого значения расстояния.
    9. Нарисуйте сегментированную линию от центра первой до второй митохондрии. Повторяйте этот процесс для каждой пары митохондрий до конца длины нейронного процесса. Сложите все длины, чтобы рассчитать общую длину нейронного процесса.
    10. Для анализа клеточной линии загрузите все изображения вульвы на Фиджи и извлеките наилучшее фокусное изображение клеток из покадровых изображений нескольких z-плоскостей.
    11. Представьте данные как среднее ± стандартной погрешности среднего значения (SEM). Рассчитайте статистическую значимость, используя одностороннюю ANOVA для более чем двух выборок или t-тест с двумя выборками для пары образцов. Обозначьте значимость p-значением < 0,05 (*), p-значением < 0,005 (**) и p-значением > 0,05 (ns, незначимое).

Результаты

Характеристика устройства: Устройство роста и визуализации состоит из двух слоев PDMS, связанных вместе (рисунок 1) с использованием необратимой плазменной связи. Слой потока (рисунок 1), который составляет 10 мм в длину и 40 мкм или 80 мкм в высоту, позволяет выращива...

Обсуждение

В данной работе описан протокол изготовления и использования простого микрофлюидного устройства для выращивания C. elegans с постоянным питанием и визуализацией высокого разрешения одного животного во время его развития. Этот процесс изготовления прост и может быть выполнен в несте...

Раскрытие информации

S.M. и S.P.K. являются авторами патента на микрофлюидное устройство для роста и визуализации (патентная заявка No 640/CHE/2011).

Благодарности

Мы благодарим центр визуализации CIFF, NCBS за использование конфокальных микроскопов, поддерживаемых DST - Центром нанотехнологий (No. SR/55/NM-36-2005). Мы благодарим финансирование исследований от DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), вращающийся диск при поддержке DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK и Gautam Menon) и грант HHMI-IECS номер 55007425 (SPK). Штаммы HB101, PS3239 и wdIs51 были предоставлены Центром генетики Caenorhabditis (CGC), который финансируется Управлением исследовательских инфраструктурных программ NIH (P40 OD010440). S.P.K. сделал jsIs609 в лаборатории Майка Нонета.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
18 G needlesSigma-Aldrich, Bangalore, IndiaGauge 18
3-way stopcockCole-ParmerWW-30600-02Masterflex fitting with luer lock
CCD cameraAndor TechnologyEMCCD C9100-13no
Circuit board filmFine Line Imaging, Colorado, USAThe designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)
Convection OvenMeta-Lab Scientific Industries, IndiaMSI-5
CoverslipsBlue stat microscopic cover glass22mm x 10Gms
EthanolHi media
Harris uni-core puncher 1mmQiagenZ708801
HexamethyldisilazaneSigma-Aldrich, Bangalore, India440191
Hot plate IKARCT B S 22
IsopropanolFisher Scientific26895
KOHFisher Scientific
Laser Scanning MicroscopeZEISSLSM 5 LIVE
Micropipette tipsTarsons0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply
Negative Photoresist-1MicrochemSU8-2025http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2MicrochemSU8-2050http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Nitrogen gasLocal SupplierCommercial nitrogen gasCylinder volume of 7 cubic meter
PDMS (Curing solution)Dow Corning Corporation, MI, USA Sylgard curing solutioncuring agent
Petri platesPraveen Scientific Corporation
Plasma cleanerHarrick Plasma, NY, USA PDC-32G
Razor and bladesLister surgical Blade
Silicon Elastomer (Base)Dow Corning Corporation, MI, USASylgard 184 baseelastomer base
Silicon tubesFisher ScientificPlastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm
Silicon waferUniversity Wafer, MA, USA[100] orientation, 4-inch diameterSmall pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer
Spin CoaterSPS-Europe B.V., The NetherlandsSPIN 150
Spinning Disk microscopePerkin Elmer ultra-view VOX systemCSU-X1-A3 NThe system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.
SU8 developerMicrochem, MA, USASU8 Developer
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silaneSigma-Aldrich, Bangalore, India448931Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic
UV lampOriel Instruments, Bangalore, India200 Watt and collimated UV light source
Volocity softwarePerkin-ElmerImage analysis

Ссылки

  1. Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy. PloS One. 5 (11), 15435 (2010).
  2. Hobert, O. Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2010).
  3. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12 (4), 372-385 (2011).
  4. Steele, L. M., Sedensky, M. M. Approaches to Anesthetic Mechanisms: The C. elegans Model. Methods in Enzymology. 602, 133-151 (2018).
  5. San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2013).
  6. Cáceres, I. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally orienting C. elegans using geometry at microscale for high-throughput visual screens in neurodegeneration and neuronal development studies. PloS One. 7 (4), 35037 (2012).
  7. Ai, X., Zhuo, W., Liang, Q., McGrath, P. T., Lu, H. A high-throughput device for size based separation of C. elegans developmental stages. Lab on a Chip. 14 (10), 1746-1752 (2014).
  8. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
  9. Desta, I. T., et al. Detecting and Trapping of a Single C. elegans Worm in a Microfluidic Chip for Automated Microplate Dispensing. SLAS Technology. 22 (4), 431-436 (2017).
  10. Ben-Yakar, A. High-Content and High-Throughput In Vivo Drug Screening Platforms Using Microfluidics. Assay and Drug Development Technologies. 17 (1), 8-13 (2019).
  11. Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7, 13023 (2016).
  12. Fehlauer, H., et al. Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. Elegant. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56530 (2018).
  13. Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
  14. Cornaglia, M., et al. An automated microfluidic platform for C. elegans embryo arraying, phenotyping, and long-term live imaging. Scientific Reports. 5, 10192 (2015).
  15. Suzuki, M., et al. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).
  16. Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  17. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  18. Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis Elegans. Methods in Molecular Biology. 1327, 159-179 (2015).
  19. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  20. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
  21. Allen, P. B., et al. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 20-26 (2008).
  22. Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
  23. Mondal, S., et al. Tracking Mitochondrial Density and Positioning along a Growing Neuronal Process in Individual C. elegans Neuron Using a Long-Term Growth and Imaging Microfluidic Device. eNeuro. 8 (4), (2021).
  24. Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-Term High-Resolution Imaging of Developing C. elegans Larvae with Microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
  25. Gritti, N., Kienle, S., Filina, O., Van Zon, J. S. Long-term time-lapse microscopy of C. Elegans post-embryonic development. Nature Communications. 7, 12500 (2016).
  26. Kim, S., et al. A biostable, anti-fouling zwitterionic polyurethane-urea based on PDMS for use in blood-contacting medical devices. Journal of materials chemistry B. 8 (36), 8305-8314 (2020).
  27. Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: cell culture and flow studies with glial cells. Journal of Biomedical Materials ResearchPart A. 72 (1), 10-18 (2005).
  28. Folch, A., Toner, M. Cellular micropatterns on biocompatible materials. Biotechnology Progress. 14 (3), 388-392 (1998).
  29. Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes. Biotechnology Progress. 20 (3), 750-755 (2004).
  30. Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomedical Microdevices. 9 (2), 123-134 (2007).
  31. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PloS One. 7 (12), 51499 (2012).
  32. Inoue, T., et al. Gene expression markers for Caenorhabditis elegans vulval cells. Mechanisms of Development. 119, 203-209 (2002).
  33. Fatouros, C., et al. Inhibition of Tau aggregation in a novel caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).
  34. Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-speci fi c expression pro fi ling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Developmental Biology. 345 (1), 18-33 (2010).
  35. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  36. Oren-Suissa, M., Hall, D. H., Treinin, M., Shemer, G., Podbilewicz, B. The fusogen EFF-I controls sculpting of mechanosensory dendrites. Science. 328 (5983), 1285-1288 (2010).
  37. Smith, C. J., et al. Sensory neuron fates are distinguished by a transcriptional switch that regulates dendrite branch stabilization. Neuron. 79 (2), 266-280 (2013).
  38. Shrestha, B. R., Grueber, W. B. Neuronal morphogenesis: worms get an EFF in dendritic arborization. Current Biology: CB. 20 (16), 673-675 (2010).
  39. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884-9894 (2008).
  40. Sure, G. R., et al. UNC-16/JIP3 and UNC-76/FEZ1 limit the density of mitochondria in C. elegans neurons by maintaining the balance of anterograde and retrograde mitochondrial transport. Scientific Reports. 8 (1), 8938 (2018).
  41. Awasthi, A., et al. Regulated distribution of mitochondria in touch receptor neurons of C. elegans influences touch response. bioRxiv. , (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

182C elegans

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены