Ein einfacher mikrofluidischer Chip für Langzeitwachstum und Bildgebung von Caenorhabditis elegans

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt ein einfaches mikrofluidisches Chipdesign und eine Mikrofabrikationsmethodik, die verwendet wird, um C. elegans in Gegenwart einer kontinuierlichen Nahrungszufuhr für bis zu 36 h zu züchten. Das Wachstums- und Bildgebungsgerät ermöglicht auch eine intermittierende langfristige hochauflösende Bildgebung von zellulären und subzellulären Prozessen während der Entwicklung für mehrere Tage.

Zusammenfassung

Caenorhabditis elegans (C. elegans) haben sich als wertvolles Modellsystem zur Untersuchung entwicklungs- und zellbiologischer Prozesse erwiesen. Um diese biologischen Prozesse zu verstehen, ist oft eine langfristige und wiederholte Bildgebung desselben Tieres erforderlich. Lange Erholungszeiten, die mit herkömmlichen Immobilisierungsmethoden auf Agarpads verbunden sind, haben schädliche Auswirkungen auf die Tiergesundheit, so dass es unangemessen ist, dasselbe Tier über lange Zeiträume hinweg wiederholt abzubilden. Dieser Artikel beschreibt ein mikrofluidisches Chipdesign, eine Herstellungsmethode, ein On-Chip-C . elegans-Kulturprotokoll und drei Beispiele für Langzeitbildgebung zur Untersuchung von Entwicklungsprozessen bei einzelnen Tieren. Der mit Polydimethylsiloxan hergestellte und auf einem Deckglas verklebte Chip immobilisiert Tiere auf einem Glassubstrat mit einer Elastomermembran, die mit Stickstoffgas abgelenkt wird. Die vollständige Immobilisierung von C. elegans ermöglicht eine robuste Zeitraffer-Bildgebung von zellulären und subzellulären Ereignissen in einer anästhesiefreien Weise. Eine Kanalgeometrie mit großem Querschnitt ermöglicht es dem Tier, sich innerhalb von zwei teilweise abgedichteten Isolationsmembranen frei zu bewegen, was ein Wachstum im Kanal mit kontinuierlicher Nahrungszufuhr ermöglicht. Mit diesem einfachen Chip kann die Bildgebung von Entwicklungsphänomenen wie neuronalem Prozesswachstum, Vulvaentwicklung und dendritischen Arborisation in den PVD-sensorischen Neuronen durchgeführt werden, wenn das Tier im Kanal wächst. Der Langzeitwachstums- und Bildgebungschip arbeitet mit einer einzigen Druckleitung, ohne externe Ventile, kostengünstigen fluidischen Verbrauchsmaterialien und verwendet Standard-Schneckenbehandlungsprotokolle, die von anderen Labors mit C. elegans leicht angepasst werden können.

Einleitung

Caenorhabditis elegans hat sich als leistungsfähiger Modellorganismus erwiesen, um Zellbiologie, Alterung, Entwicklungsbiologie und Neurobiologie zu untersuchen. Vorteile wie sein transparenter Körper, kurzer Lebenszyklus, einfache Wartung, eine definierte Anzahl von Zellen, Homologie mit mehreren menschlichen Genen und gut untersuchte Genetik haben dazu geführt, dass C. elegans zu einem beliebten Modell sowohl für grundlegende biologische Entdeckungen als auch für angewandte Forschung geworden^{ist 1,2}. Das Verständnis der biologischen und Entwicklungsprozesse von Zellen durch wiederholte Langzeitbeobachtungen einzelner Tiere kann sich als vorteilhaft erweisen. Herkömmlicherweise wird C. elegans auf Agarpads betäubt und unter dem Mikroskop abgebildet. Schädliche Auswirkungen von Anästhetika auf die Gesundheit von Tieren beschränken die Verwendung von betäubten Tieren für die langfristige und wiederholte intermittierende Bildgebung desselben Tieres ^3,4. Jüngste Fortschritte in der mikrofluidischen Technologie und ihre Anpassung an das anästhesiefreie Fangen von C. elegans mit vernachlässigbaren Gesundheitsgefahren ermöglichen eine hochauflösende Bildgebung desselben Tieres über einen kurzen und langen Zeitraum.

Mikrofluidische Chips wurden für ^das Hochdurchsatz-Screening ^6,7,8 von C. elegans5, das Fangen und Dosieren 9, das Arzneimittelscreening^10,11, die Neuronenstimulation mit hochauflösender Bildgebung 12 und die hochauflösende Bildgebung des Tieres^12,13,14 entwickelt. Ultradünne mikrofluidische Folien für die Immobilisierung auf Objektträgern wurden ebenfalls entwickelt¹⁵. Langzeitstudien von C. elegans wurden unter Verwendung von niedrig aufgelösten Bildern von Tieren durchgeführt, die in flüssiger Kultur wachsen, um Wachstum, Kalziumdynamik, Arzneimittelwirkungen auf ihr Verhalten^16,17,18,19, ihre Langlebigkeit und Alterung²⁰ zu beobachten. Langzeitstudien mit hochauflösender Mikroskopie wurden durchgeführt, um die synaptische Entwicklung²¹, die neuronale Regeneration 22 und die mitochondriale Addition²³ zu bewerten. Langfristige hochauflösende Bildgebung und Verfolgung des Zellschicksals und der Zelldifferenzierung wurden in Mehrkanalgeräten^{durchgeführt 24,25}. Mehrere zelluläre und subzelluläre Ereignisse treten über Zeitskalen von mehreren Stunden auf und erfordern das Einfangen desselben Individuums zu verschiedenen Zeitpunkten während ihrer Entwicklung, um alle Zwischenschritte im Prozess zu charakterisieren, um die zelluläre Dynamik in vivo zu verstehen. Um biologische Prozesse wie Organogenese, neuronale Entwicklung und Zellmigration abzubilden, muss das Tier zu mehreren Zeitpunkten in der gleichen Ausrichtung immobilisiert werden. Wir haben zuvor ein Protokoll für hochauflösende Bildgebung von C. elegans für mehr als 36 Stunden veröffentlicht, um zu bestimmen, wo Mitochondrien entlang der Berührungsrezeptorneuronen (TRNs) hinzugefügt ^werden23.

Dieses Papier enthält ein Protokoll zur Etablierung einer mikrofluidikbasierten Methodik für wiederholte hochauflösende Bildgebung. Dieses Gerät mit einem einzigen Strömungskanal eignet sich am besten für die wiederholte Abbildung eines einzelnen Tieres pro Gerät. Um den Durchsatz zu verbessern und viele Tiere gleichzeitig abzubilden, können mehrere Geräte an dieselbe Druckleitung angeschlossen werden, jedoch mit separaten Drei-Wege-Anschlüssen, die ein einzelnes Tier in jedem Gerät steuern. Das Design ist nützlich für Studien, die hochauflösende Zeitrafferbilder erfordern, wie postembryonale Entwicklungsprozesse, Zellmigration, Organellentransport, Genexpressionsstudien usw. Die Technologie könnte für einige Anwendungen wie Lebensdauer- und Alterungsstudien, die paralleles Wachstum und Bildgebung vieler Tiere im Spätstadium erfordern, einschränkend sein. Polydimethylsiloxan (PDMS) -Elastomer wurde aufgrund seiner Biostabilität²⁶, Biokompatibilität ^27,28, Gaspermeabilität ^29,30 und des abstimmbaren Elastizitätsmoduls ³¹ zur Herstellung dieses Geräts verwendet. Diese zweischichtige Vorrichtung ermöglicht das Wachstum von Tieren mit kontinuierlicher Nahrungszufuhr in einem mikrofluidischen Kanal und das Einfangen einzelner C. elegans mittels PDMS-Membrankompression mit Stickstoffgas. Dieses Gerät ist eine Erweiterung des zuvor veröffentlichten Geräts mit dem Vorteil, das gleiche Tier im Mikrokanal unter einer kontinuierlichen Nahrungszufuhr zu züchten und abzubilden³. Das zusätzliche Isoliermembrannetz und eine 2 mm breite Fangmembran ermöglichen eine effiziente Immobilisierung von sich entwickelnden Tieren. Das Gerät wurde verwendet, um neuronale Entwicklung, Vulvaentwicklung und dendritische Arborisierung in sensorischen PVD-Neuronen zu beobachten. Die Tiere wachsen ohne gesundheitsschädliche Auswirkungen im Gerät und können wiederholt immobilisiert werden, um die Bildgebung subzellulärer Ereignisse im selben Tier während seiner Entwicklung zu erleichtern.

Das gesamte Protokoll gliedert sich in fünf Teile. Teil 1 beschreibt die Geräteherstellung für den Wachstums- und Bildgebungschip. Teil 2 beschreibt, wie ein Drucksystem für die PDMS-Membranauslenkung eingerichtet wird, um einzelne C. elegans zu immobilisieren und zu isolieren. Teil 3 beschreibt, wie C. elegans auf einer Nematoden-Wachstumsmedium-Platte (NGM) für die Gerätebildgebung synchronisiert wird. Teil 4 beschreibt, wie man ein einzelnes Tier in das Gerät lädt und das Tier mehrere Tage lang in das mikrofluidische Gerät züchtet. Teil 5 beschreibt, wie man ein einzelnes Tier zu mehreren Zeitpunkten immobilisiert, hochauflösende Bilder mit verschiedenen Zielen aufnimmt und die Bilder mit Fidschi analysiert.

Protokoll

1. Herstellung von Wachstums- und Bildgebungsgeräten

1. SU8 Formenbau
   1. Entwerfen Sie die Muster 1 (Fließschicht) und 2 (Kontrollschicht) unter Verwendung rechteckiger Formen in einer Textverarbeitungssoftware (oder einer computergestützten Design-CAD-Software) und drucken Sie die Fotomasken mit Hilfe eines Laserplotters mit einer Mindeststrukturgröße von 8 μm auf Polyesterfolie (Abbildung 1).
   2. Siliziumwafer in 2,5 cm × 2,5 cm große Stücke schneiden und mit 20% KOH 1 min reinigen. Spülen Sie die Wafer in entionisiertem (DI) Wasser ab. Verwenden Sie je einen Wafer für den Durchfluss und die Kontrollschicht.
      ACHTUNG: KOH ist ätzend und sollte mit Vorsicht behandelt werden.
   3. Trocknen Sie die Stücke mit 14 psi komprimiertem Stickstoffgas und anschließender Dehydratisierung auf einer Heizplatte bei 120 °C für 4 h. Bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren, kühlen Sie die beiden Teile auf Raumtemperatur ab.
   4. Nehmen Sie eines der Siliziumstücke und legen Sie es auf das Futter eines Schleuderbeschichters und schalten Sie das Vakuum ein, um den Wafer an Ort und Stelle zu halten. Geben Sie ~ 20 μL Hexamethyldisilan (HMDS) auf das Siliziumstück und beschichten Sie es mit dem Spin-Coater bei 500 Umdrehungen pro Minute (U/min) für 5 s, gefolgt von 3.000 U / min für 30 s.
      ACHTUNG: Dieser Schritt sollte bei gelbem Licht durchgeführt werden. Verwenden Sie kein weißes Licht im Raum.
   5. Um eine gleichmäßige Fotolackdicke von ~40 μm (spezifisch für die Strömungsschicht; geeignet für die Abbildung von Tieren im frühen Larvenstadium 1 bis Stadium 3 (L1 - L3) zu erhalten), beschichten Sie den Siliziumwafer mit ~ 1,5 ml negativem Fotolack-1 mit einem Spin-Coater bei 500 U/min für 5 s, gefolgt von 2.000 U/min für 30 s.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.4 und 1.1.5 mit dem zweiten Wafer, um eine gleichmäßige Fotolackdicke von ~40 μm zu erhalten, die für die Kontrollschicht spezifisch ist.
   7. Alternativ, um die Dicke der Fließschicht auf ~80 μm für ältere Tiere zu erhöhen, beschichten Sie Siliziumwafer mit ~ 1,5 ml negativem Fotolack-2 mit dem Spin-Coater bei 500 U/min für 5 s und 2.000 U/min für 30 s. Diese Dicke ist für L3-Stadium bis zu erwachsenen Tieren geeignet.
      VORSICHT: Halten Sie die Siliziumwafer seitlich fest, um Schäden an den spinbeschichteten Schichten zu vermeiden. Lassen Sie die weißen Lichter während dieses Schritts ausgeschaltet.
   8. Die fotolackbeschichteten Silikonstücke (für Fließ- und Kontrollschichten) auf einer heißen Platte bei 65 °C für 1 min backen, gefolgt von 95 °C für 10 min. Die Backstücke auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
      HINWEIS: Die gebackenen Silikonstücke können einen Tag lang gelagert werden, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Im Dunkeln lagern und nicht weißem Licht aussetzen.
   9. Legen Sie weich gebackene Silikonstücke auf die Belichtungsstufe des UV-Strahlers, wobei die fotolackbeschichtete Oberfläche der UV-Lampe zugewandt ist. Besetzen Sie die beiden Teile mit einer 200-W-Lampe 15 s lang separat UV durch eine Fotomaske mit den Mustern 1 und 2, um Fluss- bzw. Kontrollschichten zu erhalten.
      ACHTUNG: Tragen Sie eine Schutzbrille und vermeiden Sie direkte UV-Einwirkung. Schalten Sie während dieser Phase kein weißes Licht im Raum ein.
   10. Backen Sie die beiden freiliegenden Silikonstücke mit beschichteter Schicht nach oben bei 65 °C gefolgt von 95 °C für 1 min bzw. 10 min. Kühlen Sie die Teile auf Raumtemperatur ab, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
   11. Entwickeln Sie die Muster, indem Sie die Silikonstücke in der Fotolack-Entwicklerlösung (1:3-Verdünnung des Entwicklers in Isopropanol) für 20 min einweichen. Sobald das Muster sichtbar ist, spülen Sie die Stücke mit reinem iso-Propylalkohol (IPA) ab und föhnen Sie sie vorsichtig mit Stickstoffgas (14 psi) trocken.
       VORSICHT: Verwenden Sie für diese chemische Behandlung eine gut belüftete Umgebung, um eine Exposition des Menschen zu vermeiden. Verwenden Sie weißes Licht erst, nachdem Merkmale entwickelt und mit IPA gespült wurden.
   12. Bewahren Sie die Silikonstücke in einem Exsikkator mit der beschichteten Oberfläche nach oben auf. Setzen Sie die Stücke Silandämpfen aus, indem Sie 50 μL reines Trichlorsilan (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyl) auf einen kleinen Plastikbecher oder einen Glasobjektträger gießen. Legen Sie den Becher/Objektträger in einen Exsikkator und inkubieren Sie ihn 2 h lang.
       VORSICHT: Vermeiden Sie eine direkte Exposition gegenüber Silandampf. Verwenden Sie immer eine versiegelte Kammer für die Silandampfbehandlung.
       HINWEIS: Bei Bedarf können die entwickelten Silikonstücke 1-2 Tage gelagert werden, bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird.
2. Herstellung von PDMS-Chips
   1. Stellen Sie PDMS in einem Kunststoffbecher her, indem Sie die Elastomerbasis mit dem Härter im Verhältnis 10:1 mischen. Mischen Sie den Inhalt gut unter ständigem Rühren für 3 min. Das Mischen erzeugt viele Luftblasen in der PDMS-Mischung.
   2. Entgasen Sie die PDMS-Mischung in einem Exsikkator für 30 Minuten, um alle Luftblasen zu entfernen.
      VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass Luftblasen aus der PDMS-Mischung entfernt werden, bevor sie auf die Merkmale gegossen wird, da Blasen defekte und nicht funktionierende Geräte verursachen können.
   3. Legen Sie die Siliziumwafer mit der Kontrollschicht (Muster 2) in eine Petrischale. Gießen Sie vorsichtig eine 5 mm dicke PDMS-Mischschicht auf das Silikonstück, um Blasenbildung zu vermeiden.
   4. Entgasen Sie die PDMS-Mischung in einem Exsikkator, um zusätzliche Blasen zu entfernen, die während des PDMS-Gießprozesses entstehen.
   5. Platzieren Sie den Siliziumwafer mit Fließschicht (Muster 1) auf dem Spinnerfutter und üben Sie 200-500 mTorr Vakuumdruck aus, um den Wafer zu halten. Gießen Sie ~ 1 ml PDMS auf den Siliziumwafer und beschichten Sie ihn mit einem Spin-Coater bei 500 U/min für 5 s, gefolgt von 1.000 U/min für 30 s, um eine ~ 80 μm dicke Schicht zu erhalten.
   6. Die beiden Siliziumwafer mit dem schleuderbeschichteten PDMS backen und PDMS-Schichten bei 50 °C in einen Heißluftkonvektionsofen für 6 h gießen. Warten Sie nach dem Backen, bis die Stücke bei Raumtemperatur abgekühlt sind.
   7. Schneiden Sie die 5 mm dicke PDMS-Schicht aus dem Silikonstück um die Kontrollschicht (Muster 2) mit einer scharfen Klinge und ziehen Sie sie vom Silikonsubstrat ab.
   8. Stanzen Sie zwei Löcher mit einem Durchmesser von ~ 1 mm mit einem Harris-Locher am Reservoir des PDMS-Blocks, um den Immobilisierungskanal und die Isolationskanaleinlässe mit den Gasleitungen für PDMS-Membranauslenkungen zu verbinden.
   9. Legen Sie das Silikonstück mit der spinbeschichteten PDMS-Schicht auf das Muster 1 (Fließschicht), wobei die PDMS-beschichtete Oberfläche nach oben zeigt, auf eine Kunststoffschale. Halten Sie den gestanzten PDMS-Block mit Muster 2 (Kontrollschicht) auf dem Fach mit der geformten Seite nach oben.
   10. Bewahren Sie die Kunststoffschale in einem Plasmareiniger auf und setzen Sie die beiden PDMS-Oberflächen 2 Minuten lang 18 W Luftplasma unter Niedervakuum (200-600 mTorr) aus. Wenden Sie Vakuum an, bis die Kammer hellviolett wird. Führen Sie diesen Schritt bei schwachem Licht aus, um zu sehen, wie sich die Plasmafarbe ändert.
   11. Nehmen Sie die beiden plasmabehandelten Blöcke heraus und binden Sie die Blöcke vorsichtig, indem Sie die plasmabehandelten Oberflächen der Muster 1 und 2 zusammendrücken. Die Klebemuster bei 50 °C für 2 h im Heißluft-Umluftofen backen.
   12. Nehmen Sie das verklebte Gerät aus dem Ofen. Schneiden Sie die geklebte Vorrichtung aus Siliziumwafern mit Muster 1 und Muster 2 und stanzen Sie mit dem Harris-Locher Löcher in die Einlass- und Auslassbehälter der Strömungsschicht.
   13. Legen Sie den geklebten PDMS-Block mit der Fließschicht nach oben auf eine Kunststoffschale. Bewahren Sie ein sauberes Deckglas (# 1.5) auf demselben Tablett auf. Die Blöcke und das Deckglas 2 min lang 18 W Luftplasma aussetzen. Stellen Sie den Vakuumdruck ein, um eine violette Kammer zu sehen.
       HINWEIS: Dieser Schritt sollte bei schlechten Lichtverhältnissen durchgeführt werden, um zu sehen, wie sich die Plasmafarbe ändert. Um das Deckglas zu reinigen, waschen Sie es mit IPA und föhnen Sie es mit Stickstoffgas bei 14 psi.
   14. Legen Sie den plasmaexponierten PDMS-Block auf das Deckglas und backen Sie die gebundene Struktur in einem Ofen bei 50 °C für 2 h ein. Lagern Sie das Gerät in einer sauberen Kammer für zukünftige Experimente.

2. PDMS-Membrangrundierung

1. Nehmen Sie das Gerät und legen Sie es auf ein Stereomikroskop und befestigen Sie die Schläuche. Verbinden Sie Micro Flex Tube (Innendurchmesser ~5 mm, Außendurchmesser ~8 mm) an einer komprimierten Stickstoffgasleitung an einem Ende. Schließen Sie einen Drei-Wege-Stecker am anderen Ende an. Die Rohre 1 und 2 der Dreiwegeverbinder werden mit den Fallen- bzw. Trennmembranen verbunden.
2. Verbinden Sie zwei Microflex-Schläuche (Innendurchmesser ~1,6 mm, Außendurchmesser ~5 mm) mit den beiden Auslassöffnungen des Dreiseitenhahns. Verbinden Sie das andere Ende der beiden Röhrchen mit einer 8 mm langen 18 G Nadel.
3. Füllen Sie die Fließschicht mit M9-Puffer mit einer Mikropipette durch den Einlassanschluss. Füllen Sie beide Röhrchen mit DI-Wasser durch das mit der Nadel verbundene Ende. Führen Sie die beiden Nadeln in die gestanzten Löcher ein und verbinden Sie die Isolier- bzw. die Fangmembran.
4. Öffnen Sie den Stickstoffgasregler bei 14 psi und drehen Sie das Dreiwegeventil aus Rohr 1, um das Wasser durch die mikrofluidischen Kanäle in den Kontrollschichten, nämlich den Abscheider- und Isolationsmembranen, in das Gerät zu drücken.
5. Warten Sie, bis Wasser den Kanal füllt, ohne dass in beiden Kanälen Lufttröpfchen vorhanden sind. Sobald die Kanäle vollständig mit Wasser gefüllt sind, gelten die Kanäle als grundiert.
6. Lassen Sie den Druck mit dem Dreiwegehahn ab, sobald die Kanäle mit Wasser gefüllt und grundiert sind. Grundierung kann zu Blasen in der Strömungsschicht führen, entfernen Sie die Blasen, indem zusätzliche Medien durch den Strömungskanal fließen.

3. C. elegans Wartung und Synchronisation

HINWEIS: C. elegans-Stämme: Die Studie verwendete folgende Transgene PS3239 (dpy-20(e1282) syIs49 IV [MH86p(dpy-20(+) + pJB100(ZMP-1::GFP)]) für die Vulvaentwicklung 32, jsIs609 (mec7p::MLS(mitochondriales Matrixlokalisierungssignal)::GFP)³³ für die Entwicklung von Berührungsrezeptorneuronen (TRN) und die Bildgebung des Mitochondrientransports und wdIs51(F49H12.4::GFP + unc-119(+)) zur Verfolgung der PVD-Entwicklung ³⁴. Standard C. elegans Kultur- und Erhaltungsprotokoll wurde^{befolgt 35}.

1. Züchten Sie C. elegans auf den Nematoden-Wachstumsmedium (NGM) Petriplatten mit E. coli OP50 als Nahrungsquelle bei 22 °C. Pflegen Sie die C. elegans-Stämme, indem Sie wiederholt ein paar Hermaphroditen übertragen oder eine kleine Menge Agar mit ein paar Tieren auf eine neue NGM-Platte mit einem OP50-Rasen klopfen.
2. Überprüfen Sie nach 3-5 Tagen die NGM-Platte auf Tierwachstum und C. elegans-Eier. Sammeln und übertragen Sie ca. 30 Eier von einem Teller auf einen frischen NGM-Teller mit OP50-Rasen.
3. Um die Tiere für die Bildgebung zu synchronisieren, alle nicht geschlüpften Eier alle 2 Stunden vom Teller auf eine frische Platte geben und bei 22 °C halten. Auf jedem Teller schlüpfen etwa 15-20 Eier.
4. Wählen Sie die Tiere zwischen 14-16 h und 28-30 h nach dem Schlüpfen für Larve 2 (L2) bzw. Larve 3 (L3) Stadien. Übertragen Sie die Tiere zur Bildgebung in das mikrofluidische Gerät. Fügen Sie das Futterangebot wie im nächsten Abschnitt beschrieben hinzu, um das Tier für langfristige Wachstums- und Bildgebungsexperimente im Gerät zu halten.

4. C. elegans-Wachstum innerhalb des mikrofluidischen Wachstums- und Bildgebungsgeräts

1. Montieren Sie ein mikrofluidisches Wachstums- und Bildgebungsgerät auf einem inversen Mikroskop und betrachten Sie Muster 2, nachdem Sie die Isoliermembranen und die Immobilisierungsmembran bei geringen Vergrößerungen (4x oder 10x) angeschlossen haben. Stellen Sie sicher, dass die Kanäle mit sauberem destilliertem Wasser gefüllt sind.
2. Bereiten Sie eine frische 1 L Lösung des S-Mediums unter Verwendung von 10 mL 1 M Kaliumcitrat pH 6,0, 10 ml Spurenmetalllösung, 3 ml 1 M CaCl2_{, 3} ml 1 M_MgSO4 vor. Bereiten Sie die Lösung unter sterilen Bedingungen vor. Autoklavieren Sie das S-Medium nicht.
3. Füllen Sie den Strömungskanal 10 min vor dem Experiment mit Wachstumsmedien (S-Medium). Vermeiden Sie Luftblasen im Strömungskanal. Fließen Sie bei Bedarf zusätzliches Medium, um Luftblasen zu entfernen.
4. Nehmen Sie ein einzelnes Tier aus dem erforderlichen Entwicklungsstadium aus einer NGM-Platte in 10 μL S-Medium mit einer Mikropipette und drücken Sie das Tier durch das Einlassloch in den Strömungskanal.
5. Überwachen Sie die Tierposition im Strömungskanal mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung. Fließen Sie zusätzliches Medium durch den Einlass oder Auslass, um das Tier zu drücken und es innerhalb des Strömungskanals zwischen den beiden Isoliermembranen zu positionieren.
6. Öffnen Sie den Dreiwegehahn, um 14 psi Druck in die Isolationskanäle auszuüben, und drücken Sie die Membranen nach unten in den Strömungskanal.
   HINWEIS: Die Membran dichtet den Strömungskanal teilweise ab und beschränkt die Tierbewegung auf den Bereich zwischen den beiden Isoliermembranen.
7. Verwenden Sie eine einzelne Kolonie von E. coli OP50 aus einer gestreiften Platte, um 250 ml L-Brühe (2,5 g Bacto-Trypton, 1,25 g Bacto-Hefe, 1,25 g NaCl in_H2O) zu impfen. Die geimpfte Kultur über Nacht bei 37 °C anbauen.
8. Aliquot 500 μL OP50-Kultur in 1,5 mL sterile Zentrifugenröhrchen geben und den Bestand und das Aliquot 2 Wochen bei 4 °C lagern.
9. Pellet down OP50 Kultur durch Zentrifugation bei 1,3 x g für 5 min. Das Pellet mit 1 ml frischem S-Medium (0,5x Verdünnung) auflösen und bei Raumtemperatur 3-4 Tage lagern. Verwenden Sie dieses verdünnte OP50, um C. elegans in mikrofluidischen Geräten zu füttern.
10. Lassen Sie einen Tropfen S-Medium auf den Einlass- und Auslassbehältern, um die Verdunstung des S-Mediums im Strömungskanal zu reduzieren.
11. Nehmen Sie die verdünnte OP50-Lösung in einer 10-μL-Mikropipette ein. Entfernen Sie die mit der OP50-Lösung gefüllte Mikrospitze aus der Pipette und drücken Sie die Spitze in den Einlassbehälter. Legen Sie dann eine weitere Mikropipettenspitze mit 10 μL Lebensmittellösung ein und führen Sie sie in den Auslassbehälter ein.
12. Versiegeln Sie den Spitzenkopf mit einem Finger, um die Kontinuität der Lebensmittellösungen ohne Luftspalt zu gewährleisten. Wechseln Sie die Mikropipettenspitze mit OP50-Lösung jeden Tag, der nicht älter als 3-4 Tage ist.
13. Füllen Sie zusätzliche 20-30 μL Lebensmittellösung in beide Spitzen. Fügen Sie der Mikropipettenspitze eine Futterlösung hinzu oder entfernen Sie sie, um den Farbverlauf einzustellen, um das Tier in den Strömungskanal zu drücken und die Position des Tieres unter der Fangmembran für die Bildgebung anzupassen.
14. Überwachen Sie den Bakterienfluss, um sicherzustellen, dass er kontinuierlich durch die teilweise geschlossenen Isoliermembranen im Strömungskanal mit Hilfe von Hellfeldbildern erfolgt.
    HINWEIS: In Abwesenheit eines Bakterienflusses können Tiere die verfügbaren Bakterien im Strömungskanal zwischen den beiden Isoliermembranen fressen. Falls keine Bakterien oder kein Fluss im Kanal vorhanden sind, ersetzen Sie die beiden Mikropipettenspitzen am Ein- und Auslass durch neue Pipettenspitzen, die mit frisch zubereiteten Lebensmitteln gefüllt sind.

5. C. elegans Immobilisierung und Bildgebung

1. C. elegans Immobilisierung unter der Fangmembran
   1. Lokalisieren Sie ein einzelnes Tier im Wachstumskanal bei geringer Vergrößerung. Stellen Sie die Höhe der Lebensmittellösung in den beiden Mikropipettenspitzen ein, die mit den Einlass- und Auslassbehältern verbunden sind. Schieben Sie das Tier mithilfe der hydrostatischen Druckdifferenzen im Strömungskanal in die gewünschte Richtung.
   2. Positionieren Sie das Tier in der Mitte der Fangmembran und überwachen Sie sein Schwimmverhalten mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung (4x).
   3. Drehen Sie den Dreiwegehahn, um den Druck im Fallenkanal langsam zu erhöhen. Immobilisieren Sie das Tier unter der Fallenmembran in einer geraden Haltung entlang der Begrenzungsmauer des Wachstumskanals.
      VORSICHT: Vermeiden Sie es, das Tier über den Strömungskanal in einer Z- oder U-Biegeposition einzufangen. Dies führt dazu, dass der tierische Körper mit größerem Druck zusammengedrückt wird und seine Gesundheit dauerhaft schädigt.
2. C. elegans Bildgebung und Freisetzung aus der Membran
   1. Tragen und laden Sie das Gerät auf einen Mikroskoptisch. Richten Sie ein inverses Mikroskop mit den gewünschten Bildeinstellungen mit allen erforderlichen optischen Komponenten (Objektiv, Lichtquelle, Fluoreszenzfilter und Detektor) für hochauflösende Hellfeld-, differentielle Bildkontrast- (DIC) oder Fluoreszenzbildgebung ein (ergänzende Abbildung 1).
   2. Nehmen Sie einzelne oder mehrere Zeitraffer-Fluoreszenzbilder auf, um zelluläre und subzelluläre Ereignisse zu erfassen.
   3. Erfassen Sie Fluoreszenzbilder von C. elegans-Neuronen als Funktion ihrer Entwicklung mit einem 60x-Objektiv mit numerischer Apertur (NA), einem Laser mit 488 nm Wellenlänge und 7% -10% Laserleistung, einer CCD-Kamera, auf einem Spinning-Disc-Mikroskop. Führen Sie Zeitrafferaufnahmen mit der mit dem Mikroskop gelieferten Software durch und erfassen Sie Bilder mit einer Geschwindigkeit von 4 Bildern pro Sekunde (ergänzende Abbildung 1).
   4. Lassen Sie nach der Aufnahme der Bilder den Fangdruck los und überwachen Sie die Fortbewegung des Tieres bei niedrigen Vergrößerungen - 4x und 10x. Halten Sie das Tier innerhalb des durch Isoliermembranen definierten Bereichs begrenzt (während des gesamten Experiments unter 14 psi).
   5. Passen Sie das Volumen der Lebensmittellösung in den beiden Mikropipettenspitzen an, um einen langsamen, schwerkraftgetriebenen Nahrungsfluss im Wachstumskanal fortzusetzen. Dieser Nahrungsfluss wird durch Einstellen der Niveaus der Lebensmittellösungen in Mikropipetten am Ein- und Auslass (typischerweise 1-5 mm Höhenunterschied) erreicht.
   6. Visualisieren Sie die Strömung unter einem hellen Feld aus dem Strömungsmuster der Bakterien im Wachstumskanal.
      HINWEIS: In Abwesenheit von Strömung frisst das Tier die verfügbaren OP50-Bakterien, der Kanal erscheint klar und das Tier verhungert über einige Stunden. Ein ausgehungertes Tier entwickelt typischerweise eine hohe Autofluoreszenz, die bei der Aufnahme von Zeitrafferfluoreszenzbildern leicht zu beobachten ist. Solche Ereignisse wirken sich nachteilig auf die Tierphysiologie aus und wurden in den Versuchen vermieden.
   7. Wiederholen Sie die Schritte 5.2.1-5.2.3 nach einem vorgegebenen Zeitintervall, um Fluoreszenz-/DIC-/Hellfeldbilder derselben Person zu mehreren Zeitpunkten aufzunehmen.
   8. Nachdem die Bilder zu mehreren gewünschten Zeitpunkten von demselben einzelnen Tier aufgenommen wurden, lassen Sie den Isolations- und Fangdruck los. Spülen Sie den Kanal mit M9-Puffer und drücken Sie das Tier durch den Einlassbehälter. Bergung des Tieres aus dem Reservoir und legen Sie das Tier zur weiteren Gesundheitsüberwachung auf eine frische NGM-Platte.
   9. Spülen Sie den Kanal einige Male mit M9-Puffer, um Bakterien zu entfernen. Spülen Sie den Strömungskanal mit 70% Ethylalkohol (verdünnt in destilliertem Wasser). Trocknen Sie die Kanäle, indem Sie Luft mit einer Spritze drücken. Lagern Sie das Gerät an einem trockenen, staubfreien Ort für den späteren wiederholten Gebrauch.
3. Bildanalyse und Statistik
   1. Verwenden Sie die FIJI ImageJ-Software für die TIFF-Bildanalyse. Öffnen Sie tiff-Bilder der PVD-Zeitrafferbilder der wdIs51-Tiere in Fiji ImageJ. Extrahieren Sie die besten Ebenen aus dem Stapel von Z-Ebenen, die die primären Prozesse anzeigen, indem Sie die Registerkarte Bild > Stapel > Z-Projekt auswählen.
   2. Screenen Sie die gesamte Bildserie und finden Sie spezifische Bildrahmen, die die gesamten neuronalen Prozesse erfolgreich abdecken, indem Sie überlappende Abschnitte der Tierbildrahmen verwenden. Wählen Sie in der FIJI-Symbolleiste Plugin > Analyze > Cell Counter aus. Dies öffnet ein Fenster zum Nummerieren verschiedener Zweige und zum Zählen jedes ausgewählten Neurons.
   3. Wählen Sie > Leistungsindikatoren initialisieren > Typ1 aus, und markieren Sie dann die sekundären Zweige. Wählen Sie dann Typ 2 aus, markieren Sie Quartär, klicken Sie auf das Fenster Ergebnisse mit der Anzahl aller Zweige (ergänzende Abbildung 2). Diese Methode zeigt die Zweige an, die bereits gezählt wurden.
   4. Öffnen Sie das nächste überlappende Bild und zählen Sie die verbleibenden Zweige. Dieser Prozess verhindert Doppelzählungen und stellt sicher, dass jeder Prozess gezählt wird. Identifizieren und zählen Sie die Gesamtzahl der primären Zweige, die in den frühen Larvenstadien von C. elegans vorhanden sind. Führen Sie eine ähnliche Analyse für die Bilder für sekundäre und quartäre Prozesse bei älteren Tieren durch.
      HINWEIS: Erwachsene zeigen viele Prozesse, die sich in den Körperwandmuskeln innervieren und schwer zu zählen sein können. Stellen Sie sicher, dass jeder Prozess nur einmal gezählt wird.
   5. Berechnen Sie den Abstand zwischen den PVD-Zellkörpern in den wdIs51-Tieren , indem Sie eine segmentierte Linie vom PVD-Zellkörper (CB) zu PVC CB zeichnen. Bei Tieren im Larvenstadium 4 (L4) liegen die Zellkörper weit auseinander und befinden sich nicht im selben Rahmen, wenn sie mit einem 60x-Objektiv abgebildet werden.
   6. Wählen Sie überlappende Bilder vom Stapel aus, um die gesamte Tierlänge von Kopf bis Schwanz abzudecken, indem Sie die Registerkarte Bild > das Projekt Stapel > Z von ImageJ verwenden. Zeichnen Sie segmentierte Linien entlang des neuronalen Prozesses zwischen PVD- und PVC-CBs.
   7. Messen Sie die Längen für alle segmentierten Linien mit ImageJ > Analyze > Measure. Addieren Sie die Längen für alle Segmente, um den Gesamtabstand zwischen PVD und PVC CBs für jeden Zeitpunkt zu berechnen.
   8. Für die Neuronenlänge von TRNs in jsIs609-Tieren laden Sie die Bilder in Fidschi. Zeichnen Sie eine segmentierte Linie entlang der hinteren lateralen Mikrotubuli (PLMs; sichtbar mit löslichem GFP) vom Zellkörper bis zum Schwerpunkt des ersten Mitochondriums. Berechnen Sie die Länge der Linie für den ersten Entfernungswert.
   9. Zeichne eine segmentierte Linie vom Zentrum des ersten zum zweiten Mitochondrium. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Paar Mitochondrien bis zum Ende der neuronalen Prozesslänge. Addieren Sie alle Längen, um die gesamte neuronale Prozesslänge zu berechnen.
   10. Laden Sie für die Zelllinienanalyse alle Vulvabilder in Fidschi und extrahieren Sie das beste Fokusbild der Zellen aus den Zeitrafferbildern mehrerer Z-Ebenen.
   11. Stellen Sie die Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dar. Berechnen Sie die statistische Signifikanz unter Verwendung einer Einweg-ANOVA für mehr als zwei Stichproben oder eines t-Tests mit zwei Stichproben für ein Stichprobenpaar. Geben Sie die Signifikanz mit dem p-Wert < 0,05 (*), dem p-Wert < 0,005 (**) und dem p-Wert > 0,05 (ns, nicht signifikant) an.

Ergebnisse

Gerätecharakterisierung: Das Wachstums- und Bildgebungsgerät besteht aus zwei PDMS-Schichten, die mittels irreversibler Plasmabindung miteinander verbunden sind (Abbildung 1). Die Fließschicht (Muster 1), die 10 mm lang und 40 μm oder 80 μm hoch ist, ermöglicht es uns, das Tier in flüssiger Kultur zu züchten (Abbildung 1A). Die Fangschicht (Muster 2) hat eine 2 mm breite Membran (Abbildung 1B) zur Immobilis...

Diskussion

In dieser Arbeit wurde ein Protokoll für die Herstellung und Verwendung einer einfachen mikrofluidischen Vorrichtung für den Anbau von C. elegans mit konstanter Nahrungszufuhr und hochauflösender Bildgebung eines einzelnen Tieres während seiner Entwicklung beschrieben. Dieser Herstellungsprozess ist einfach und kann in einer nicht sterilen Umgebung durchgeführt werden. Eine staubfreie Umgebung ist während der Fertigungsschritte kritisch. Das Vorhandensein von Staubpartikeln würde zu einem unsachgemäßen ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G needles	Sigma-Aldrich, Bangalore, India	Gauge 18
3-way stopcock	Cole-Parmer	WW-30600-02	Masterflex fitting with luer lock
CCD camera	Andor Technology	EMCCD C9100-13no
Circuit board film	Fine Line Imaging, Colorado, USA		The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)
Convection Oven	Meta-Lab Scientific Industries, India	MSI-5
Coverslips	Blue stat microscopic cover glass		22mm x 10Gms
Ethanol	Hi media
Harris uni-core puncher 1mm	Qiagen	Z708801
Hexamethyldisilazane	Sigma-Aldrich, Bangalore, India	440191
Hot plate	IKA	RCT B S 22
Isopropanol	Fisher Scientific	26895
KOH	Fisher Scientific
Laser Scanning Microscope	ZEISS	LSM 5 LIVE
Micropipette tips	Tarsons		0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply
Negative Photoresist-1	Microchem	SU8-2025	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2	Microchem	SU8-2050	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Nitrogen gas	Local Supplier	Commercial nitrogen gas	Cylinder volume of 7 cubic meter
PDMS (Curing solution)	Dow Corning Corporation, MI, USA	Sylgard curing solution	curing agent
Petri plates	Praveen Scientific Corporation
Plasma cleaner	Harrick Plasma, NY, USA	PDC-32G
Razor and blades	Lister surgical Blade
Silicon Elastomer (Base)	Dow Corning Corporation, MI, USA	Sylgard 184 base	elastomer base
Silicon tubes	Fisher Scientific		Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm
Silicon wafer	University Wafer, MA, USA	[100] orientation, 4-inch diameter	Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer
Spin Coater	SPS-Europe B.V., The Netherlands	SPIN 150
Spinning Disk microscope	Perkin Elmer ultra-view VOX system	CSU-X1-A3 N	The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.
SU8 developer	Microchem, MA, USA	SU8 Developer
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane	Sigma-Aldrich, Bangalore, India	448931	Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic
UV lamp	Oriel Instruments, Bangalore, India		200 Watt and collimated UV light source
Volocity software	Perkin-Elmer		Image analysis