Un semplice chip microfluidico per la crescita a lungo termine e l'imaging di Caenorhabditis elegans

Riepilogo

Il protocollo descrive una semplice progettazione di chip microfluidici e una metodologia di microfabbricazione utilizzata per coltivare C. elegans in presenza di una fornitura continua di cibo fino a 36 ore. Il dispositivo di crescita e imaging consente inoltre l'imaging intermittente ad alta risoluzione a lungo termine dei processi cellulari e subcellulari durante lo sviluppo per diversi giorni.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) ha dimostrato di essere un valido sistema modello per lo studio dei processi biologici dello sviluppo e cellulare. La comprensione di questi processi biologici richiede spesso immagini a lungo termine e ripetute dello stesso animale. I lunghi tempi di recupero associati ai metodi di immobilizzazione convenzionali eseguiti su cuscinetti di agar hanno effetti dannosi sulla salute degli animali rendendo inappropriato visualizzare ripetutamente lo stesso animale per lunghi periodi di tempo. Questo articolo descrive la progettazione di chip microfluidici, il metodo di fabbricazione, il protocollo di coltura di C. elegans su chip e tre esempi di imaging a lungo termine per studiare i processi di sviluppo nei singoli animali. Il chip, fabbricato con polidimetilsilossano e legato su un vetro di copertura, immobilizza gli animali su un substrato di vetro utilizzando una membrana elastomerica che viene deviata usando azoto gassoso. L'immobilizzazione completa di C. elegans consente una solida imaging time-lapse di eventi cellulari e subcellulari in modo privo di anestesia. Una geometria del canale con un'ampia sezione trasversale consente all'animale di muoversi liberamente all'interno di due membrane di isolamento parzialmente sigillate che consentono la crescita nel canale con un continuo apporto di cibo. Utilizzando questo semplice chip, è possibile eseguire l'imaging di fenomeni di sviluppo come la crescita del processo neuronale, lo sviluppo vulvare e l'arborizzazione dendritica nei neuroni sensoriali PVD, mentre l'animale cresce all'interno del canale. Il chip di crescita e imaging a lungo termine funziona con una singola linea di pressione, senza valvole esterne, materiali di consumo fluidici economici e utilizza protocolli standard di gestione dei vermi che possono essere facilmente adattati da altri laboratori che utilizzano C. elegans.

Introduzione

Caenorhabditis elegans ha dimostrato di essere un potente organismo modello per studiare la biologia cellulare, l'invecchiamento, la biologia dello sviluppo e la neurobiologia. Vantaggi come il suo corpo trasparente, il breve ciclo di vita, la facilità di manutenzione, un numero definito di cellule, l'omologia con diversi geni umani e la genetica ben studiata hanno portato C. elegans a diventare un modello popolare sia per le scoperte di biologia fondamentale che per la ricerca applicata ^1,2. Comprendere i processi biologici e di sviluppo delle cellule dall'osservazione ripetuta a lungo termine dei singoli animali può rivelarsi utile. Convenzionalmente, C. elegans viene anestetizzato su cuscinetti di agar e ripreso al microscopio. Gli effetti avversi degli anestetici sulla salute degli animali limitano l'uso di animali anestetizzati per l'imaging intermittente a lungo termine e ripetuto dello stesso animale ^3,4. I recenti progressi nelle tecnologie microfluidiche e il loro adattamento per l'intrappolamento senza anestesia di C. elegans con rischi trascurabili per la salute consentono l'imaging ad alta risoluzione dello stesso animale per un breve e lungo periodo di tempo.

I chip microfluidici sono stati progettati per lo screening ad alta produttività di C. elegans'5 ^6,7,8, l'intrappolamento e l'erogazione 9, lo screening farmacologico 10,11, la stimolazione neuronale con imaging ad alta risoluzione 12 e l'imaging ad alta risoluzione dell'animale ^12,13,14. Sono stati sviluppati anche fogli microfluidici ultrasottili per l'immobilizzazione su vetrini¹⁵. Studi a lungo termine su C. elegans sono stati condotti utilizzando immagini a bassa risoluzione di animali che crescono in coltura liquida per osservare la crescita, la dinamica del calcio, gli effetti dei farmaci sul loro comportamento^16,17,18,19, la loro longevità e l'invecchiamento²⁰. Sono stati condotti studi a lungo termine utilizzando microscopia ad alta risoluzione per valutare lo sviluppo sinaptico²¹, la rigenerazione neuronale 22 e l'aggiunta mitocondriale²³. L'imaging ad alta risoluzione a lungo termine e il tracciamento del destino cellulare e della differenziazione sono stati effettuati in dispositivi multicanale^24,25. Diversi eventi cellulari e subcellulari si verificano su scale temporali di diverse ore e richiedono l'intrappolamento dello stesso individuo in diversi punti temporali durante il loro sviluppo per caratterizzare tutte le fasi intermedie del processo per comprendere le dinamiche cellulari in vivo. Per visualizzare il processo biologico come l'organogenesi, lo sviluppo neuronale e la migrazione cellulare, l'animale deve essere immobilizzato nello stesso orientamento in più punti temporali. Abbiamo precedentemente pubblicato un protocollo per l'imaging ad alta risoluzione di C. elegans per oltre 36 ore per determinare dove vengono aggiunti i mitocondri lungo i neuroni del recettore tattile (TRN)²³.

Questo documento fornisce un protocollo per stabilire una metodologia basata sulla microfluidica per l'imaging ripetuto ad alta risoluzione. Questo dispositivo, con un singolo canale di flusso, è più adatto per l'imaging ripetuto di un singolo animale per dispositivo. Per migliorare la produttività e l'immagine di molti animali contemporaneamente, è possibile collegare più dispositivi alla stessa linea di pressione, ma con connettori a tre vie separati che controllano un singolo animale in ciascun dispositivo. Il design è utile per studi che richiedono immagini time-lapse ad alta risoluzione come processi di sviluppo post-embrionali, migrazione cellulare, trasporto di organelli, studi di espressione genica, ecc. La tecnologia potrebbe essere limitante per alcune applicazioni come la durata della vita e gli studi sull'invecchiamento che richiedono una crescita parallela e l'imaging di molti animali in fase avanzata. L'elastomero di polidimetilsilossano (PDMS) è stato utilizzato per fabbricare questo dispositivo grazie alla sua biostabilità²⁶, biocompatibilità 27,28, permeabilità ai gas ^29,30 e modulo elastico sintonizzabile ³¹. Questo dispositivo a due strati consente la crescita di animali con alimentazione continua in un canale microfluidico e l'intrappolamento di singoli C. elegans tramite compressione a membrana PDMS utilizzando azoto gassoso. Questo dispositivo è un'estensione del dispositivo precedentemente pubblicato con il vantaggio di crescere e visualizzare lo stesso animale nel microcanale sotto una fornitura continua di cibo³. La rete aggiuntiva di membrane di isolamento e una membrana di intrappolamento larga 2 mm consentono un'immobilizzazione efficiente degli animali in via di sviluppo. Il dispositivo è stato utilizzato per osservare lo sviluppo neuronale, lo sviluppo vulvare e l'arborizzazione dendritica nei neuroni PVD sensoriali. Gli animali crescono senza effetti avversi sulla salute nel dispositivo e possono essere ripetutamente immobilizzati per facilitare l'imaging di eventi subcellulari nello stesso animale durante il suo sviluppo.

L'intero protocollo è diviso in cinque parti. La Parte 1 descrive la fabbricazione del dispositivo per il chip di crescita e imaging. La Parte 2 descrive come impostare un sistema di pressione per la deflessione della membrana PDMS per immobilizzare e isolare i singoli C. elegans. La Parte 3 descrive come sincronizzare C. elegans su una piastra NGM (nematode growth medium) per l'imaging del dispositivo. La Parte 4 descrive come caricare un singolo animale nel dispositivo e far crescere l'animale all'interno del dispositivo microfluidico per diversi giorni. La Parte 5 descrive come immobilizzare un singolo animale in più punti temporali, catturare immagini ad alta risoluzione utilizzando obiettivi diversi e analizzare le immagini utilizzando le Fiji.

Protocollo

1. Fabbricazione di dispositivi di crescita e imaging

1. Fabbricazione di stampi SU8
   1. Progettare i modelli 1 (strato di flusso) e 2 (strato di controllo) utilizzando forme rettangolari in un software di elaborazione testi (o un software CAD di progettazione assistita da computer) e stampare le fotomaschere con l'aiuto di un plotter laser con una dimensione minima di 8 μm su pellicola a base di poliestere (Figura 1).
   2. Tagliare i wafer di silicone in pezzi da 2,5 cm × 2,5 cm e pulirli con KOH al 20% per 1 minuto. Risciacquare i wafer in acqua deionizzata (DI). Utilizzare un wafer ciascuno per il flusso e il livello di controllo.
      ATTENZIONE: KOH è corrosivo e deve essere maneggiato con cura.
   3. Asciugare i pezzi con azoto gassoso compresso a 14 psi seguito da disidratazione su piastra calda a 120 °C per 4 ore. Prima di procedere al passaggio successivo, raffreddare i due pezzi a temperatura ambiente.
   4. Prendi uno dei pezzi di silicone e mettilo sul mandrino di un rivestimento di rotazione e accendi il vuoto per tenere il wafer in posizione. Sul pezzo di silicio, mettere ~ 20 μL di esametildisilano (HMDS) e rivestirlo usando lo spin coater a 500 rotazione al minuto (rpm) per 5 s seguito da 3.000 giri / min per 30 s.
      ATTENZIONE: questo passaggio deve essere eseguito in luce gialla. Non usare la luce bianca nella stanza.
   5. Per ottenere uno spessore fotoresist uniforme di ~ 40 μm (specifico per lo strato di flusso; adatto per l'imaging di animali dallo stadio larvale iniziale 1 allo stadio 3 (L1 - L3), rivestire il wafer di silicio con ~ 1,5 ml di fotoresist-1 negativo utilizzando uno spin coater a 500 giri / min per 5 s seguito da 2.000 giri / min per 30 s.
   6. Ripetere i passaggi 1.1.4 e 1.1.5 con il secondo wafer per ottenere uno spessore fotoresist uniforme di ~40 μm specifico per lo strato di controllo.
   7. In alternativa, per aumentare lo spessore dello strato di flusso a ~ 80 μm per gli animali più anziani, rivestire i wafer di silicio con ~ 1,5 ml di fotoresist-2 negativo utilizzando lo spin coater a 500 giri / min per 5 s seguito da 2.000 giri / min per 30 s. Questo spessore è adatto per lo stadio L3 agli animali adulti.
      ATTENZIONE: Tenere i wafer di silicio sui lati per evitare danni agli strati rivestiti di rotazione. Tenere spente le luci bianche durante questo passaggio.
   8. Cuocere i pezzi di silicone rivestiti di fotoresist (per gli strati di flusso e controllo) su una piastra calda a 65 °C per 1 minuto seguita da 95 °C per 10 minuti. Raffreddare i pezzi cotti a temperatura ambiente.
      NOTA: I pezzi di silicone cotto possono essere conservati per un giorno prima di procedere alla fase successiva. Conservare al buio e non esporre alla luce bianca.
   9. Posizionare pezzi di silicone cotti morbidi sullo stadio di esposizione dell'illuminatore UV con la superficie rivestita in fotoresist rivolta verso la lampada UV. Esporre i due pezzi separatamente ai raggi UV per 15 s, utilizzando una lampada da 200 W, attraverso una fotomaschera con motivi 1 e 2 per ottenere rispettivamente il flusso e gli strati di controllo.
      ATTENZIONE: Indossare occhiali di sicurezza ed evitare l'esposizione diretta ai raggi UV. Non accendere la luce bianca nella stanza durante questa fase.
   10. Cuocere i due pezzi di silicone esposti con lo strato rivestito rivolto verso l'alto, a 65 °C seguito da 95 °C per 1 min e 10 min rispettivamente. Raffreddare i pezzi a temperatura ambiente prima di procedere al passaggio successivo.
   11. Sviluppare i modelli immergendo i pezzi di silicio nella soluzione di sviluppo photoresist (diluizione 1:3 dello sviluppatore in isopropanolo) per 20 minuti. Una volta che il motivo è visibile, sciacquare i pezzi con alcool isopropilico puro (IPA) e asciugare delicatamente con azoto gassoso (14 psi).
       ATTENZIONE: Utilizzare un ambiente ben ventilato per questo trattamento chimico per evitare l'esposizione umana. Utilizzare la luce bianca solo dopo che le caratteristiche sono state sviluppate e risciacquate con alcool isopropilico.
   12. Tenere i pezzi di silicio in un essiccatore con la superficie rivestita rivolta verso l'alto. Esporre i pezzi ai vapori di silano versando 50 μL di tricloro puro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottil) silano su un piccolo bicchiere di plastica o un vetrino. Posizionare la tazza/vetrino all'interno di un essiccatore e incubare per 2 ore.
       ATTENZIONE: Evitare l'esposizione diretta al vapore silano. Utilizzare sempre una camera sigillata per il trattamento con vapori silanici.
       NOTA: Se necessario, i pezzi di silicio sviluppati possono essere conservati per 1-2 giorni prima di procedere alla fase successiva.
2. Fabbricazione di chip PDMS
   1. Preparare PDMS in un bicchiere di plastica mescolando la base di elastomero con l'agente polimerizzante in un rapporto 10: 1. Mescolare bene il contenuto mescolando continuamente per 3 minuti. La miscelazione creerà molte bolle d'aria nella miscela PDMS.
   2. Degasare la miscela PDMS in un essiccatore per 30 minuti per rimuovere tutte le bolle d'aria.
      ATTENZIONE: Assicurarsi che le bolle d'aria vengano rimosse dalla miscela PDMS prima che venga versata sulle caratteristiche poiché le bolle possono causare dispositivi difettosi e non funzionanti.
   3. Posizionare i wafer di silicio con lo strato di controllo (modello 2) in una capsula di Petri. Versare delicatamente uno strato di miscela PDMS di 5 mm di spessore sul pezzo di silicio evitando la formazione di bolle.
   4. Degasare la miscela PDMS in un essiccatore per rimuovere le bolle aggiuntive che si formano durante il processo di versamento PDMS.
   5. Posizionare il wafer di silicio con strato di flusso (modello 1) sul mandrino dello spinner applicando una pressione del vuoto di 200-500 mTorr per trattenere il wafer. Versare ~ 1 mL di PDMS sul wafer di silicio e rivestirlo usando uno spin coater a 500 giri / min per 5 s seguito da 1.000 giri / min per 30 s per ottenere uno strato spesso ~ 80 μm.
   6. Cuocere i due wafer di silicio con il PDMS rivestito di spin e versare gli strati PDMS a 50 °C in un forno a convezione ad aria calda per 6 h. Dopo la cottura, attendere che i pezzi si raffreddino a temperatura ambiente.
   7. Tagliare lo strato PDMS spesso 5 mm dal pezzo di silicio attorno allo strato di controllo (modello 2) utilizzando una lama affilata e staccarlo dal substrato di silicio.
   8. Perforare due fori di ~ 1 mm di diametro utilizzando un perforatore Harris nel serbatoio del blocco PDMS per collegare il canale di immobilizzazione e le prese del canale di isolamento alle tubazioni del gas per le deflessioni della membrana PDMS.
   9. Posizionare il pezzo di silicone con lo strato PDMS rivestito di spin sul modello 1 (strato di flusso), con la superficie rivestita PDMS rivolta verso l'alto, su un vassoio di plastica. Tenere il blocco PDMS perforato con pattern 2 (strato di controllo) sul vassoio con il lato stampato rivolto verso l'alto.
   10. Tenere il vassoio di plastica all'interno di un detergente al plasma ed esporre le due superfici PDMS a plasma d'aria da 18 W per 2 minuti in basso vuoto (200-600 mTorr). Applicare il vuoto fino a quando la camera diventa viola brillante. Eseguire questo passaggio in condizioni di scarsa illuminazione per vedere il cambiamento di colore del plasma.
   11. Estrarre i due blocchi trattati al plasma e legarli delicatamente premendo insieme le superfici trattate al plasma dei modelli 1 e 2. Cuocere i modelli incollati a 50 °C per 2 ore in forno a convezione ad aria calda.
   12. Estrarre il dispositivo incollato dal forno. Tagliare il dispositivo incollato dal wafer di silicio con pattern 1 e pattern 2 e perforare i fori nei serbatoi di ingresso e uscita dello strato di flusso utilizzando il perforatore Harris.
   13. Posizionare il blocco PDMS incollato con lo strato di flusso rivolto verso l'alto su un vassoio di plastica. Tenere un bicchiere di copertura pulito (# 1.5) sullo stesso vassoio. Esporre i blocchi e il vetro di copertura al plasma d'aria da 18 W per 2 min. Regolare la pressione del vuoto per vedere una camera viola.
       NOTA: questo passaggio deve essere eseguito in condizioni di scarsa illuminazione per vedere il cambiamento di colore del plasma. Per pulire il vetro di copertura, lavarlo con alcool isopropilico e asciugare con azoto gassoso a 14 psi.
   14. Posizionare il blocco PDMS esposto al plasma sopra il vetro di copertura e cuocere la struttura incollata in forno a 50 °C per 2 ore. Conservare il dispositivo in una camera bianca per eventuali esperimenti futuri.

2. Adescamento della membrana PDMS

1. Prendi il dispositivo e mettilo su uno stereomicroscopio e attacca i tubi. Collegare il tubo micro flex (diametro interno ~ 5 mm, diametro esterno ~ 8 mm) a una linea di gas azoto compresso su un'estremità. Collegare un connettore a tre vie all'altra estremità. I tubi 1 e 2 dei connettori a tre vie saranno collegati rispettivamente alla trappola e alle membrane isolanti.
2. Collegare due microtubi flessibili (diametro interno ~1,6 mm, diametro esterno ~5 mm) alle due porte di uscita del rubinetto di arresto a tre vie. Collegare l'altra estremità dei due tubi a un ago da 18 G lungo 8 mm.
3. Riempire lo strato di flusso con tampone M9 utilizzando una micropipetta attraverso la porta di ingresso. Riempire entrambi i tubi con acqua DI attraverso l'estremità collegata all'ago. Inserire i due aghi nei fori perforati, collegando rispettivamente la membrana isolante e quella intrappolante.
4. Aprire il regolatore del gas azoto a 14 psi e ruotare la valvola a tre vie dal tubo 1 per spingere l'acqua nel dispositivo attraverso i canali microfluidici negli strati di controllo, vale a dire la trappola e le membrane di isolamento.
5. Attendere che l'acqua riempia il canale senza la presenza di alcuna goccia d'aria in entrambi i canali. Una volta che i canali sono completamente riempiti d'acqua, i canali sono considerati adescati.
6. Rilasciare la pressione utilizzando il rubinetto a tre vie una volta che i canali sono stati riempiti d'acqua e adescati. L'adescamento può portare a bolle nello strato di flusso, rimuovere le bolle facendo scorrere mezzi aggiuntivi attraverso il canale di flusso.

3. Manutenzione e sincronizzazione di C. elegans

NOTA: Ceppi di C. elegans: Lo studio ha utilizzato i seguenti transgeni PS3239 (dpy-20(e1282) syIs49 IV [MH86p(dpy-20(+) + pJB100(ZMP-1::GFP)]) per lo sviluppo vulvare 32, jsIs609 (mec7p::MLS(segnale di localizzazione della matrice mitocondriale)::GFP⁾³³ per lo sviluppo del neurone del recettore tattile (TRN) e l'imaging del trasporto dei mitocondri, e wdIs51(F49H12.4::GFP + unc-119(+)) per tracciare lo sviluppo PVD³⁴. Il protocollo standard di coltura e mantenimento di C. elegans è stato seguito³⁵.

1. Coltivare C. elegans sul terreno di crescita dei nematodi (NGM) piastre di Petri con E. coli OP50 come fonte di cibo a 22 °C. Mantenere i ceppi di C. elegans trasferendo ripetutamente alcuni ermafroditi o tagliando una piccola quantità di agar con alcuni animali su una nuova piastra NGM con un prato OP50.
2. Dopo 3-5 giorni, controllare la piastra NGM per la crescita animale e le uova di C. elegans. Raccogliere e trasferire circa 30 uova da un piatto a un piatto NGM fresco con prato OP50.
3. Per sincronizzare gli animali per l'imaging, trasferire tutte le uova non schiuse dalla piastra ogni 2 ore a una piastra fresca e mantenerle a 22 °C. Circa 15-20 uova si schiuderanno su ogni piatto.
4. Scegli gli animali tra 14-16 h e 28-30 h dopo la schiusa rispettivamente per gli stadi larvali 2 (L2) e larvali 3 (L3). Trasferire gli animali al dispositivo microfluidico per l'imaging. Aggiungere cibo come descritto nella sezione successiva per mantenere l'animale all'interno del dispositivo per esperimenti di crescita e imaging a lungo termine.

4. Crescita di C. elegans all'interno del dispositivo microfluidico di crescita e imaging

1. Montare un dispositivo microfluidico di crescita e imaging su un microscopio invertito e visualizzare il modello 2, dopo aver collegato le membrane di isolamento e la membrana di immobilizzazione, a bassi ingrandimenti (4x o 10x). Assicurarsi che i canali siano riempiti con acqua distillata pulita.
2. Preparare una soluzione fresca da 1 L di terreno S utilizzando 10 ml di citrato di potassio 1 M pH 6,0, 10 mL di soluzione di metalli in tracce, 3 ml di 1 M CaCl₂, 3 mL di 1 M MgSO₄. Preparare la soluzione in condizioni sterili. Non autoclavare il mezzo S.
3. Riempire il canale di flusso con il mezzo di crescita (S medium) 10 minuti prima dell'esperimento. Evitare bolle d'aria nel canale di flusso. Far scorrere il mezzo aggiuntivo se necessario per rimuovere le bolle d'aria.
4. Prelevare un singolo animale dalla fase di sviluppo richiesta da una piastra NGM in 10 μL di mezzo S utilizzando una micropipetta e spingere l'animale nel canale di flusso attraverso il foro di ingresso.
5. Monitorare la posizione dell'animale nel canale di flusso utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento. Far scorrere il mezzo aggiuntivo attraverso l'ingresso o l'uscita per spingere l'animale e posizionarlo all'interno del canale di flusso ristretto tra le due membrane di isolamento.
6. Aprire il rubinetto di arresto a tre vie per applicare una pressione di 14 psi nei canali di isolamento e spingere le membrane verso il basso nel canale di flusso.
   NOTA: La membrana sigilla parzialmente il canale di flusso e limita il movimento degli animali alla regione tra le due membrane di isolamento.
7. Utilizzare una singola colonia di E. coli OP50 da una piastra striata per inoculare 250 ml di brodo L (2,5 g bacto-triptone, 1,25 g bacto-lievito, 1,25 g NaCl in H₂O). Coltivare la coltura inoculata durante la notte a 37 °C.
8. Aliquot 500 μL di coltura OP50 in provette sterili da centrifuga da 1,5 mL e conservare il materiale madre e l'aliquota per 2 settimane a 4 °C.
9. Pellet in coltura OP50 mediante centrifugazione a 1,3 x g per 5 min. Sciogliere il pellet con 1 mL di terreno S fresco (diluizione 0,5x) e conservarlo a temperatura ambiente per 3-4 giorni. Utilizzare questo OP50 diluito per alimentare C. elegans all'interno di dispositivi microfluidici.
10. Lasciare una goccia di mezzo S sopra i serbatoi di ingresso e uscita per ridurre l'evaporazione del mezzo S nel canale di flusso.
11. Assumere una soluzione di OP50 diluita in una micropipetta da 10 μL. Rimuovere la micropunta riempita con la soluzione OP50 dalla pipetta e inserire la punta nel serbatoio di ingresso. Quindi posizionare un'altra punta di micropipetta con 10 μL di soluzione alimentare e inserirla nel serbatoio di uscita.
12. Sigillare la testa della punta esercitando pressione utilizzando un dito per garantire la continuità delle soluzioni alimentari senza alcun traferro. Cambiare la punta della micropipetta con la soluzione OP50 ogni giorno che non è più vecchia di 3-4 giorni.
13. Riempire altri 20-30 μL di soluzione alimentare in entrambe le punte. Aggiungere o rimuovere la soluzione alimentare da e verso la punta della micropipetta per regolare il gradiente per spingere l'animale nel canale di flusso e per regolare la posizione dell'animale sotto la membrana di intrappolamento per l'imaging.
14. Monitorare il flusso di batteri per assicurarsi che sia continuo attraverso le membrane di isolamento parzialmente chiuse nel canale di flusso utilizzando immagini a campo chiaro.
    NOTA: In assenza di flusso batterico, gli animali potrebbero mangiare i batteri disponibili nel canale di flusso tra le due membrane di isolamento. In caso di assenza di batteri o di flusso nel canale, sostituire le due punte delle micropipette all'ingresso e all'uscita con nuove punte per pipette riempite con alimenti preparati al momento.

5. Immobilizzazione e imaging di C. elegans

1. Immobilizzazione di C. elegans sotto la membrana di intrappolamento
   1. Individua un singolo animale nel canale di crescita a bassi ingrandimenti. Regolare le altezze della soluzione alimentare nelle due punte di micropipette collegate ai serbatoi di ingresso e di uscita. Spingere l'animale nella direzione richiesta utilizzando le differenze di pressione idrostatica nel canale di flusso.
   2. Posizionare l'animale al centro della membrana di intrappolamento e monitorare il suo comportamento di nuoto utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento (4x).
   3. Ruotare il rubinetto a tre vie per aumentare lentamente la pressione nel canale di trappola. Immobilizzare l'animale sotto la membrana della trappola in una postura diritta lungo la parete di confine del canale di crescita.
      ATTENZIONE: Evitare di intrappolare l'animale attraverso il canale di flusso in posizione di piegatura Z o U. Ciò fa sì che il corpo animale venga schiacciato con una maggiore pressione e provoca danni permanenti alla sua salute.
2. C. elegans imaging e rilascio dalla membrana
   1. Trasportare e caricare il dispositivo su un palcoscenico per microscopio. Impostare un microscopio invertito con le impostazioni di imaging desiderate con tutti i componenti ottici necessari (obiettivo, sorgente luminosa, filtri a fluorescenza e un rilevatore) per il campo luminoso ad alta risoluzione, il contrasto di imaging differenziale (DIC) o l'imaging a fluorescenza (Figura supplementare 1).
   2. Acquisire una o più immagini di fluorescenza time-lapse per catturare eventi cellulari e subcellulari.
   3. Acquisire immagini di fluorescenza dei neuroni di C. elegans in funzione del loro sviluppo utilizzando un obiettivo 60x, apertura numerica 1,4 (NA), un laser a lunghezza d'onda 488 nm con potenza laser 7% -10%, una camera CCD, su un microscopio a disco rotante. Eseguire l'imaging time-lapse utilizzando il software fornito con il microscopio e acquisire immagini a una velocità di 4 fotogrammi al secondo (Figura supplementare 1).
   4. Dopo l'acquisizione delle immagini, rilasciare la pressione di intrappolamento e monitorare la locomozione dell'animale a bassi ingrandimenti - 4x e 10x. Mantenere l'animale limitato all'interno della regione definita da membrane isolanti (mantenute sotto i 14 psi per tutto l'esperimento).
   5. Regolare il volume della soluzione alimentare nelle due punte delle micropipette per continuare un lento flusso di cibo guidato dalla gravità nel canale di crescita. Questo flusso di cibo è ottenuto regolando i livelli delle soluzioni alimentari in micropipette all'ingresso e all'uscita (tipicamente 1-5 mm di differenza di altezza).
   6. Visualizza il flusso sotto un campo luminoso dal modello di flusso dei batteri nel canale di crescita.
      NOTA: In assenza di flusso, l'animale mangia i batteri OP50 disponibili, il canale appare libero e l'animale muore di fame per alcune ore. Un animale affamato sviluppa tipicamente un'alta autofluorescenza, facilmente osservabile quando si acquisiscono immagini di fluorescenza time-lapse. Tali eventi hanno effetti dannosi sulla fisiologia animale e sono stati evitati negli esperimenti.
   7. Ripetere i passaggi 5.2.1-5.2.3 dopo un intervallo di tempo predeterminato per acquisire immagini a fluorescenza/DIC/campo luminoso dello stesso individuo in più punti temporali.
   8. Dopo che le immagini sono state acquisite in più punti temporali desiderati dallo stesso singolo animale, rilasciare l'isolamento e la pressione di intrappolamento. Lavare il canale con tampone M9 e spingere l'animale attraverso il serbatoio di ingresso. Recuperare l'animale dal serbatoio e posizionarlo su una piastra NGM fresca per un ulteriore monitoraggio della salute.
   9. Lavare il canale con tampone M9 alcune volte per rimuovere i batteri. Risciacquare il canale di flusso con alcool etilico al 70% (diluito in acqua distillata). Asciugare i canali spingendo l'aria con una siringa. Conservare il dispositivo in un luogo asciutto e privo di polvere per un uso ripetuto in futuro.
3. Analisi delle immagini e statistiche
   1. Utilizzare il software FIJI ImageJ per l'analisi delle immagini tiff. Immagini tiff aperte delle immagini time-lapse PVD degli animali wdIs51 in Fiji ImageJ. Estrarre i piani migliori dalla pila di piani z che mostrano i processi primari selezionando la scheda Immagine > Stacks > progetto Z.
   2. Esamina l'intera serie di immagini e trova fotogrammi di immagini specifici che coprono con successo l'intero processo neuronale utilizzando sezioni sovrapposte dei fotogrammi delle immagini animali. Selezionare Plugin > Analyze > Cell Counter dalla barra degli strumenti delle FIJI. Questo aprirà una finestra per numerare diversi rami e tenere un conteggio di ogni neurone selezionato.
   3. Selezionare Inizializza contatori > > Type1, quindi contrassegnare i rami secondari. Quindi selezionare Tipo 2 e contrassegnare Quaternario, fare clic sulla finestra Risultati che mostra i conteggi di tutti i rami (Figura supplementare 2). Questo metodo visualizzerà i rami già contati.
   4. Apri l'immagine sovrapposta successiva e conta i rami rimanenti. Questo processo impedirà il doppio conteggio e garantirà che ogni processo venga conteggiato. Identificare e contare il numero totale di rami primari presenti nelle prime fasi larvali di C. elegans. Eseguire analisi simili per le immagini per i processi secondari e quaternari negli animali più anziani.
      NOTA: Gli adulti mostrano molti processi che innervano i muscoli della parete corporea e possono essere difficili da contare. Assicurati che ogni processo venga conteggiato una sola volta.
   5. Calcolare la distanza tra i corpi cellulari PVD negli animali wdIs51 tracciando una linea segmentata dal corpo cellulare PVD (CB) al PVC CB. Per gli animali allo stadio larvale 4 (L4), i corpi cellulari sono molto distanti e non sono nello stesso fotogramma quando vengono ripresi con un obiettivo 60x.
   6. Seleziona le immagini sovrapposte dalla pila per coprire l'intera lunghezza dell'animale dalla testa alla coda utilizzando la scheda Immagine > Stacks > Z project di ImageJ. Disegna linee segmentate lungo il processo neuronale tra i CB PVD e PVC.
   7. Misurare le lunghezze di tutte le linee segmentate utilizzando ImageJ > Analizza > misura. Aggiungi le lunghezze per tutti i segmenti per calcolare la distanza totale tra PVD e PVC CB per ogni punto temporale.
   8. Per la lunghezza dei neuroni dei TRN negli animali jsIs609 , caricare le immagini nelle Fiji. Tracciare una linea segmentata lungo i microtubuli laterali posteriori (PLM; visibili con GFP solubile) dal corpo cellulare al centroide del primo mitocondrio. Calcolare la lunghezza della linea per il primo valore di distanza.
   9. Disegna una linea segmentata dal centro del primo al secondo mitocondrio. Ripeti questo processo per ogni coppia di mitocondri fino alla fine della lunghezza del processo neuronale. Aggiungi tutte le lunghezze per calcolare la lunghezza totale del processo neuronale.
   10. Per l'analisi della linea cellulare, caricare tutte le immagini vulvali nelle Fiji ed estrarre la migliore immagine a fuoco delle cellule dalle immagini time-lapse di più piani z.
   11. Rappresentare i dati come media ± errore standard della media (SEM). Calcola la significatività statistica utilizzando ANOVA unidirezionale per più di due campioni o un test t a due campioni per una coppia di campioni. Indica la significatività con il valore p < 0,05 (*), il valore p < 0,005 (**) e il valore p > 0,05 (ns, non significativo).

Risultati

Caratterizzazione del dispositivo: Il dispositivo di crescita e imaging è costituito da due strati PDMS legati insieme (Figura 1) utilizzando legami plasmatici irreversibili. Lo strato di flusso (modello 1) che è lungo 10 mm e alto 40 μm o 80 μm ci consente di coltivare l'animale in coltura liquida (Figura 1A). Lo strato di cattura (modello 2) ha una membrana larga 2 mm (Figura 1B) per immobilizzare l'animale p...

Discussione

In questo articolo, è stato descritto un protocollo per la fabbricazione e l'uso di un semplice dispositivo microfluidico per la crescita di C. elegans con costante approvvigionamento di cibo e imaging ad alta risoluzione di un singolo animale durante il suo sviluppo. Questo processo di fabbricazione è semplice e può essere eseguito in un ambiente non sterile. Un ambiente privo di polvere è fondamentale durante le fasi di fabbricazione. La presenza di particelle di polvere porterebbe a un contatto improprio ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G needles	Sigma-Aldrich, Bangalore, India	Gauge 18
3-way stopcock	Cole-Parmer	WW-30600-02	Masterflex fitting with luer lock
CCD camera	Andor Technology	EMCCD C9100-13no
Circuit board film	Fine Line Imaging, Colorado, USA		The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)
Convection Oven	Meta-Lab Scientific Industries, India	MSI-5
Coverslips	Blue stat microscopic cover glass		22mm x 10Gms
Ethanol	Hi media
Harris uni-core puncher 1mm	Qiagen	Z708801
Hexamethyldisilazane	Sigma-Aldrich, Bangalore, India	440191
Hot plate	IKA	RCT B S 22
Isopropanol	Fisher Scientific	26895
KOH	Fisher Scientific
Laser Scanning Microscope	ZEISS	LSM 5 LIVE
Micropipette tips	Tarsons		0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply
Negative Photoresist-1	Microchem	SU8-2025	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2	Microchem	SU8-2050	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Nitrogen gas	Local Supplier	Commercial nitrogen gas	Cylinder volume of 7 cubic meter
PDMS (Curing solution)	Dow Corning Corporation, MI, USA	Sylgard curing solution	curing agent
Petri plates	Praveen Scientific Corporation
Plasma cleaner	Harrick Plasma, NY, USA	PDC-32G
Razor and blades	Lister surgical Blade
Silicon Elastomer (Base)	Dow Corning Corporation, MI, USA	Sylgard 184 base	elastomer base
Silicon tubes	Fisher Scientific		Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm
Silicon wafer	University Wafer, MA, USA	[100] orientation, 4-inch diameter	Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer
Spin Coater	SPS-Europe B.V., The Netherlands	SPIN 150
Spinning Disk microscope	Perkin Elmer ultra-view VOX system	CSU-X1-A3 N	The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.
SU8 developer	Microchem, MA, USA	SU8 Developer
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane	Sigma-Aldrich, Bangalore, India	448931	Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic
UV lamp	Oriel Instruments, Bangalore, India		200 Watt and collimated UV light source
Volocity software	Perkin-Elmer		Image analysis