Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩

요약

이 프로토콜은 최대 36 시간 동안 지속적인 식품 공급이있는 상태에서 C. elegans를 성장시키는 데 사용되는 간단한 미세 유체 칩 설계 및 미세 가공 방법론을 설명합니다. 성장 및 이미징 장치는 또한 며칠 동안 개발 중에 세포 및 하위 세포 프로세스의 간헐적 인 장기 고해상도 이미징을 가능하게합니다.

초록

Caenorhabditis elegans (C. elegans) 는 발달 및 세포 생물학적 과정을 연구하기위한 귀중한 모델 시스템임이 입증되었습니다. 이러한 생물학적 과정을 이해하려면 종종 동일한 동물의 장기적이고 반복적 인 이미징이 필요합니다. 한천 패드에서 수행되는 기존의 고정 방법과 관련된 긴 회복 시간은 동물 건강에 해로운 영향을 미치므로 장기간에 걸쳐 동일한 동물을 반복적으로 이미지화하는 것은 부적절합니다. 이 논문은 미세 유체 칩 설계, 제조 방법, 온칩 C. elegans 배양 프로토콜 및 개별 동물의 발달 과정을 연구하기위한 장기 이미징의 세 가지 예를 설명합니다. 폴리 디메틸 실록산으로 제작되고 커버 유리에 접착 된이 칩은 질소 가스를 사용하여 편향되는 엘라스토머 멤브레인을 사용하여 유리 기판에 동물을 고정시킵니다. C. elegans 의 완전한 고정화는 마취 없는 방식으로 세포 및 하위 세포 이벤트의 강력한 타임 랩스 이미징을 가능하게 합니다. 단면이 큰 채널 형상을 통해 동물은 부분적으로 밀봉 된 두 개의 격리 막 내에서 자유롭게 움직일 수있어 지속적인 먹이 공급으로 채널에서 성장할 수 있습니다. 이 간단한 칩을 사용하여 동물이 채널 내부에서 성장함에 따라 PVD 감각 뉴런의 신경 과정 성장, 외음부 발달 및 수지상 수목 화와 같은 발달 현상의 이미징을 수행 할 수 있습니다. 장기 성장 및 이미징 칩은 단일 압력 라인, 외부 밸브 없음, 저렴한 유체 소모품으로 작동하며 C. elegans를 사용하는 다른 실험실에서 쉽게 적용할 수 있는 표준 웜 처리 프로토콜을 활용합니다.

서문

Caenorhabditis elegans는 세포 생물학, 노화, 발달 생물학 및 신경 생물학을 연구하는 강력한 모델 유기체임이 입증되었습니다. 투명한 몸체, 짧은 수명주기, 쉬운 유지 관리, 정의 된 수의 세포, 여러 인간 유전자와의 상 동성 및 잘 연구 된 유전학과 같은 장점으로 인해 C. elegans는 기초 생물학 발견과 응용 연구 ^1,2 모두에서 인기있는 모델이되었습니다. 개별 동물에 대한 반복적 인 장기 관찰을 통해 세포의 생물학적 및 발달 과정을 이해하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 통상적으로, C. elegans는 한천 패드에 마취되고 현미경으로 이미지화된다. 동물의 건강에 대한 마취제의 부작용은 동일한 동물의 장기간 및 반복 간헐적 인 영상에 마취 된 동물의 사용을 제한합니다 ^3,4. 최근 미세 유체 기술의 발전과 건강 위험이 무시할 수있는 C. elegans의 마취없는 포획에 대한 적응은 단기간에 걸쳐 동일한 동물의 고해상도 이미징을 가능하게합니다.

미세....

프로토콜

1. 성장 및 이미징 장치의 제작

1. SU8 금형 제작
   1. 워드 프로세싱 소프트웨어 (또는 컴퓨터 지원 설계 CAD 소프트웨어)에서 직사각형 모양을 사용하여 패턴 1 (플로우 레이어) 및 2 (제어 레이어)를 설계하고 폴리 에스테르 기반 필름에 최소 피처 크기가 8μm 인 레이저 플로터를 사용하여 포토 마스크를 인쇄합니다 (그림 1).
   2. 실리콘 웨이퍼를 2.5cm× 2.5cm 조각으로 자르고 20% KOH로 1분 동안 청소합니다. 웨이퍼를 탈이온수(DI)로 헹굽니다. 흐름과 제어 레이어에 각각 하나의 웨이퍼를 사용하십시오.
      주의 : KOH는 부식성이있어주의해서 취급해야합니다.
   3. 조각을 14psi 압축 질소 가스로 건조시킨 다음 120°C의 핫 플레이트에서 4시간 동안 탈수합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 두 조각을 실온으로 식히십시오.
   4. 실리콘 조각 중 하나를 스핀 코터의 척에 놓고 진공을 켜서 웨이퍼를 제자리에 고정합니다. 실리콘 조각에 ~20μL의 헥사메틸디실란(HMDS)을 넣고 스핀 코터를 사용하여 분당 500회전(rpm)으로 5초 동안 코팅한 다음 3,000rpm으로 30초 동안 코팅합니다.
      주의: 이 단계는 노란....

결과

장치 특성화: 성장 및 이미징 장치는 비가역적 플라즈마 결합을 사용하여 함께 결합된 두 개의 PDMS 층(그림 1)으로 구성됩니다. 길이가 10mm이고 높이가 40μm 또는 80μm 인 유동층 (패턴 1)을 통해 액체 배양에서 동물을 키울 수 있습니다 (그림 1A). 트래핑 층(패턴 2)은 고해상도 이미징을 위해 동물을 고정화하기 위한 2mm 너비의 멤브레인(

토론

이 논문에서는 개발 과정에서 단일 동물의 지속적인 식량 공급과 고해상도 이미징으로 C. elegans 를 성장시키기위한 간단한 미세 유체 장치의 제조 및 사용을위한 프로토콜이 설명되었습니다. 이 제조 공정은 간단하며 비멸균 환경에서 수행할 수 있습니다. 먼지가 없는 환경은 제조 단계에서 매우 중요합니다. 먼지 입자가 있으면 두 접합 표면 사이에 부적절한 접촉이 발생하여 C. elegans

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G needles	Sigma-Aldrich, Bangalore, India	Gauge 18
3-way stopcock	Cole-Parmer	WW-30600-02	Masterflex fitting with luer lock
CCD camera	Andor Technology	EMCCD C9100-13no
Circuit board film	Fine Line Imaging, Colorado, USA		The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)
Convection Oven	Meta-Lab Scientific Industries, India	MSI-5
Coverslips	Blue stat microscopic cover glass		22mm x 10Gms
Ethanol	Hi media
Harris uni-core puncher 1mm	Qiagen	Z708801
Hexamethyldisilazane	Sigma-Aldrich, Bangalore, India	440191
Hot plate	IKA	RCT B S 22
Isopropanol	Fisher Scientific	26895
KOH	Fisher Scientific
Laser Scanning Microscope	ZEISS	LSM 5 LIVE
Micropipette tips	Tarsons		0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply
Negative Photoresist-1	Microchem	SU8-2025	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2	Microchem	SU8-2050	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Nitrogen gas	Local Supplier	Commercial nitrogen gas	Cylinder volume of 7 cubic meter
PDMS (Curing solution)	Dow Corning Corporation, MI, USA	Sylgard curing solution	curing agent
Petri plates	Praveen Scientific Corporation
Plasma cleaner	Harrick Plasma, NY, USA	PDC-32G
Razor and blades	Lister surgical Blade
Silicon Elastomer (Base)	Dow Corning Corporation, MI, USA	Sylgard 184 base	elastomer base
Silicon tubes	Fisher Scientific		Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm
Silicon wafer	University Wafer, MA, USA	[100] orientation, 4-inch diameter	Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer
Spin Coater	SPS-Europe B.V., The Netherlands	SPIN 150
Spinning Disk microscope	Perkin Elmer ultra-view VOX system	CSU-X1-A3 N	The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.
SU8 developer	Microchem, MA, USA	SU8 Developer
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane	Sigma-Aldrich, Bangalore, India	448931	Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic
UV lamp	Oriel Instruments, Bangalore, India		200 Watt and collimated UV light source
Volocity software	Perkin-Elmer		Image analysis