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En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El ensayo de flujo metabólico celular en tiempo real mide la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de acidificación extracelular, que corresponde a la producción mitocondrial y glicolítica de trifosfato de adenosina, utilizando sensores de pH y oxígeno. El manuscrito explica un método para comprender el estado energético de los osteoblastos y la caracterización e interpretación del estado bioenergético celular.

Resumen

La formación ósea por osteoblastos es un proceso esencial para la adquisición ósea adecuada y el recambio óseo para mantener la homeostasis esquelética y, en última instancia, prevenir la fractura. En el interés tanto de optimizar el pico de masa ósea como de combatir diversas enfermedades musculoesqueléticas (es decir, osteoporosis posmenopáusica, anorexia nerviosa, diabetes mellitus tipo 1 y 2), se han realizado esfuerzos increíbles en el campo de la biología ósea para caracterizar completamente los osteoblastos a lo largo de su proceso de diferenciación. Dado el papel principal de los osteoblastos maduros para secretar proteínas de la matriz y vesículas de mineralización, se ha observado que estos procesos requieren una cantidad increíble de energía celular, o trifosfato de adenosina (ATP). El estado general de la energía celular a menudo se conoce como bioenergética celular, e incluye una serie de reacciones metabólicas que detectan la disponibilidad de sustrato para derivar ATP para satisfacer las necesidades celulares. Por lo tanto, el método actual detalla el proceso de aislamiento de las células estromales primarias de la médula ósea murina (BMSC) y el monitoreo de su estado bioenergético utilizando el analizador de flujo metabólico celular en tiempo real en varias etapas de la diferenciación de osteoblastos. Es importante destacar que estos datos han demostrado que el perfil metabólico cambia drásticamente a lo largo de la diferenciación de osteoblastos. Por lo tanto, se requiere el uso de este tipo de célula fisiológicamente relevante para apreciar completamente cómo el estado bioenergético de una célula puede regular la función general.

Introducción

La formación de hueso por el osteoblasto se acompaña de destrucción coordinada o reabsorción de huesos por osteoclastos. El equilibrio entre la formación de hueso osteoblástico y la reabsorción de osteoclastos es un proceso acoplado que describe el recambio óseo o la remodelación, que es esencial para la homeostasis esquelética. La disfunción osteoblástica conduce a una formación ósea deteriorada y da lugar a diversas enfermedades, incluida la osteoporosis 1,2,3. La diferenciación ex vivo/in vitro de células madre del estroma de la médula ósea (BMSC) a precursores de....

Protocolo

Todos los procedimientos se basaron en las pautas y la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt.

1. Preparación de reactivos y configuración del ensayo

  1. Aislamiento y cultivo de células estromales de la médula ósea (véase también el artículoanterior 30).
    1. Preparar medios celulares esenciales alfa mínimos (αMEM) completos complementando medios esenciales mínimos con modificación alfa con 10% de FBS (suero fetal bovino), 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina.
    2. Prepare el tubo de recolecc....

Resultados

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Figura 6: Gráficos representativos para ensayos realizados rutinariamente para comprender el perfil bioenergético celular del grupo de control vs. tratamiento con sus respectivos errores estándar. (A) La prueba de fenotipo de energía celular. La gráfica representa la glucólisis (ECAR) vs. respiración mitocondrial (OCR).......

Discusión

El analizador de flujo metabólico celular en tiempo real se puede utilizar para explorar la energía celular en diferentes condiciones. El protocolo ilustra el aislamiento eficiente de las BMSC, el cultivo de células en placas de cultivo celular apropiadas y su diferenciación a osteoblastos maduros, que se pueden usar para diversos ensayos utilizando el analizador de flujo extracelular. Además, también se explican en detalle los pasos críticos del ensayo de flujo metabólico celular en tiempo real, incluida la hidr.......

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud (NIH) Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel (NIAMS) Subvención AR072123 y el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (NIA) Subvención AG069795 (a ERR).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin EDTASigma-AldrichT4049
2-cyano-3-(1-phenyl-1H-indol-3-yl)-2-propenoic acidSigma - AldrichPZ0160UK5099
Antimycin ASigma - AldrichA8674
Ascorbic acidSigma-AldrichA4544-100G
Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfideSigma - AldrichSML0601BPTES
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazoneSigma - AldrichC2920FCCP
Cytation 5 imaging readerBioTekN/AMicroplate imager
Etomoxir sodium salt hydrateSigma - AldrichE1905
Hoechst 33342 Solution (20 mM)Thermo Scientific62249
InsulinSigma - AldrichI6634
Oleic Acid-Albumin from bovine serumSigma - AldrichO3008
Oligomycin A - 5 mgSigma - Aldrich75351
RotenoneSigma - AldrichR8875-1G
Seahorse XF 1.0 M Glucose SolutionAgilent Technologies103577-100
Seahorse XF 100mM Pyruvate SolutionAgilent Technologies103578-100
Seahorse XF 200mM Glutamine solutionAgilent Technologies103579-100
Seahorse XF DMEM mediaAgilent Technologies103575-100DMEM assay media eith 5mM HEPES, pH 7.4, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, pyruvate, and L-glutamine
Seahorse XFe96 AnalyzerAgilent TechnologiesS7800BReal- Time Metabolic flux analyzer
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent Technologies102416-100Includes XFe96 Sensor cartridges, Cell culture microplates, and Seahorse XF Calibrant solution
The Cell imaging 1.1.0.11 softwareAgilent Technologies - BioTek
Wave software 2.6.1Agilent Technologies
β-glycerol phosphateSigma-AldrichG9422-50G

Referencias

  1. Rodan, G. A. Bone homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (23), 13361-13362 (1998).
  2. Nakahama, K. I. Cellular communications in bone homeostasis and repair. Cellular and Molecular Life Scien....

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