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El ensayo de flujo metabólico celular en tiempo real mide la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de acidificación extracelular, que corresponde a la producción mitocondrial y glicolítica de trifosfato de adenosina, utilizando sensores de pH y oxígeno. El manuscrito explica un método para comprender el estado energético de los osteoblastos y la caracterización e interpretación del estado bioenergético celular.
La formación ósea por osteoblastos es un proceso esencial para la adquisición ósea adecuada y el recambio óseo para mantener la homeostasis esquelética y, en última instancia, prevenir la fractura. En el interés tanto de optimizar el pico de masa ósea como de combatir diversas enfermedades musculoesqueléticas (es decir, osteoporosis posmenopáusica, anorexia nerviosa, diabetes mellitus tipo 1 y 2), se han realizado esfuerzos increíbles en el campo de la biología ósea para caracterizar completamente los osteoblastos a lo largo de su proceso de diferenciación. Dado el papel principal de los osteoblastos maduros para secretar proteínas de la matriz y vesículas de mineralización, se ha observado que estos procesos requieren una cantidad increíble de energía celular, o trifosfato de adenosina (ATP). El estado general de la energía celular a menudo se conoce como bioenergética celular, e incluye una serie de reacciones metabólicas que detectan la disponibilidad de sustrato para derivar ATP para satisfacer las necesidades celulares. Por lo tanto, el método actual detalla el proceso de aislamiento de las células estromales primarias de la médula ósea murina (BMSC) y el monitoreo de su estado bioenergético utilizando el analizador de flujo metabólico celular en tiempo real en varias etapas de la diferenciación de osteoblastos. Es importante destacar que estos datos han demostrado que el perfil metabólico cambia drásticamente a lo largo de la diferenciación de osteoblastos. Por lo tanto, se requiere el uso de este tipo de célula fisiológicamente relevante para apreciar completamente cómo el estado bioenergético de una célula puede regular la función general.
La formación de hueso por el osteoblasto se acompaña de destrucción coordinada o reabsorción de huesos por osteoclastos. El equilibrio entre la formación de hueso osteoblástico y la reabsorción de osteoclastos es un proceso acoplado que describe el recambio óseo o la remodelación, que es esencial para la homeostasis esquelética. La disfunción osteoblástica conduce a una formación ósea deteriorada y da lugar a diversas enfermedades, incluida la osteoporosis 1,2,3. La diferenciación ex vivo/in vitro de células madre del estroma de la médula ósea (BMSC) a precursores de....
Todos los procedimientos se basaron en las pautas y la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt.
1. Preparación de reactivos y configuración del ensayo
Figura 6: Gráficos representativos para ensayos realizados rutinariamente para comprender el perfil bioenergético celular del grupo de control vs. tratamiento con sus respectivos errores estándar. (A) La prueba de fenotipo de energía celular. La gráfica representa la glucólisis (ECAR) vs. respiración mitocondrial (OCR).......
El analizador de flujo metabólico celular en tiempo real se puede utilizar para explorar la energía celular en diferentes condiciones. El protocolo ilustra el aislamiento eficiente de las BMSC, el cultivo de células en placas de cultivo celular apropiadas y su diferenciación a osteoblastos maduros, que se pueden usar para diversos ensayos utilizando el analizador de flujo extracelular. Además, también se explican en detalle los pasos críticos del ensayo de flujo metabólico celular en tiempo real, incluida la hidr.......
Los autores no tienen nada que revelar.
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud (NIH) Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel (NIAMS) Subvención AR072123 y el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (NIA) Subvención AG069795 (a ERR).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% Trypsin EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
2-cyano-3-(1-phenyl-1H-indol-3-yl)-2-propenoic acid | Sigma - Aldrich | PZ0160 | UK5099 |
Antimycin A | Sigma - Aldrich | A8674 | |
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-100G | |
Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide | Sigma - Aldrich | SML0601 | BPTES |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma - Aldrich | C2920 | FCCP |
Cytation 5 imaging reader | BioTek | N/A | Microplate imager |
Etomoxir sodium salt hydrate | Sigma - Aldrich | E1905 | |
Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | |
Insulin | Sigma - Aldrich | I6634 | |
Oleic Acid-Albumin from bovine serum | Sigma - Aldrich | O3008 | |
Oligomycin A - 5 mg | Sigma - Aldrich | 75351 | |
Rotenone | Sigma - Aldrich | R8875-1G | |
Seahorse XF 1.0 M Glucose Solution | Agilent Technologies | 103577-100 | |
Seahorse XF 100mM Pyruvate Solution | Agilent Technologies | 103578-100 | |
Seahorse XF 200mM Glutamine solution | Agilent Technologies | 103579-100 | |
Seahorse XF DMEM media | Agilent Technologies | 103575-100 | DMEM assay media eith 5mM HEPES, pH 7.4, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, pyruvate, and L-glutamine |
Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent Technologies | S7800B | Real- Time Metabolic flux analyzer |
Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | Includes XFe96 Sensor cartridges, Cell culture microplates, and Seahorse XF Calibrant solution |
The Cell imaging 1.1.0.11 software | Agilent Technologies - BioTek | ||
Wave software 2.6.1 | Agilent Technologies | ||
β-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | G9422-50G |
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