Использование анализатора метаболического потока клеток в реальном времени для мониторинга биоэнергетики остеобластов

Резюме

Анализ метаболического потока клеток в режиме реального времени измеряет скорость потребления кислорода и скорость внеклеточного подкисления, что соответствует производству митохондриальных и гликолитических аденозинтрифосфатов с использованием датчиков pH и кислорода. Рукопись объясняет метод понимания энергетического статуса остеобластов, а также характеристику и интерпретацию клеточного биоэнергетического статуса.

Аннотация

Формирование кости остеобластами является важным процессом для правильного приобретения кости и оборота кости для поддержания скелетного гомеостаза и, в конечном счете, предотвращения перелома. В интересах оптимизации пиковой костной массы и борьбы с различными заболеваниями опорно-двигательного аппарата (например, постменопаузальным остеопорозом, нервной анорексией, сахарным диабетом 1 и 2 типа) в области костной биологии были предприняты невероятные усилия для полной характеристики остеобластов на протяжении всего процесса их дифференцировки. Учитывая основную роль зрелых остеобластов в секреции матричных белков и минерализующих везикул, было отмечено, что эти процессы забирают невероятное количество клеточной энергии, или аденозинтрифосфата (АТФ). Общий клеточный энергетический статус часто называют клеточной биоэнергетикой, и он включает в себя ряд метаболических реакций, которые ощущают доступность субстрата для получения АТФ для удовлетворения клеточных потребностей. Таким образом, текущий метод детализирует процесс выделения первичных стромальных клеток мыщеричного мозга (BMSCs) и мониторинга их биоэнергетического статуса с использованием анализатора метаболического потока клеток в реальном времени на различных стадиях дифференцировки остеобластов. Важно отметить, что эти данные продемонстрировали, что метаболический профиль резко меняется на протяжении всей дифференциации остеобластов. Таким образом, использование этого физиологически значимого типа клеток необходимо для полного понимания того, как биоэнергетический статус клетки может регулировать общую функцию.

Введение

Образование кости остеобластом сопровождается скоординированным разрушением или рассасыванием костей остеокластами. Баланс между остеобластным формированием кости и резорбцией остеокластов представляет собой связанный процесс, описывающий оборот или ремоделирование кости, который необходим для скелетного гомеостаза. Дисфункция остеобластов приводит к нарушению костеобразования и приводит к различным заболеваниям, в том числе^{остеопорозу 1,2,3}. Дифференцировка стромальных стволовых клеток костного мозга (BMSCs) ex vivo/in vitro к предшественникам остеобластов и зрелым ....

протокол

Все процедуры были основаны на руководящих принципах и одобрении Институционального комитета по уходу за животными и их использованию в Медицинском центре Университета Вандербильта.

1. Подготовка реагентов и пробирная установка

1. Выделение и культивирование стромальных клеток костного мозга (см. также предыдущую статью³⁰).
   1. Получают полную альфа-минимальную незаменимую среду (αMEM) клеточной культуры, дополняя минимальную необходимую среду альфа-модификацией 10% FBS (фетальная бычья сыворотка), 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.
   2. Подготовьте трубку для сбора ко....

Результаты

Рисунок 6: Репрезентативные графики для регулярно выполняемых анализов для понимания клеточного биоэнергетического профиля контрольной и лечебной группы с их соответствующими стандартными ошибками........

Обсуждение

Анализатор метаболического потока клеток в реальном времени может быть использован для изучения клеточной энергетики в различных условиях. Протокол иллюстрирует эффективную изоляцию BMSC, культивирование клеток в соответствующих пластинах клеточной культуры и их дифференцировку в з?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin EDTA	Sigma-Aldrich	T4049
2-cyano-3-(1-phenyl-1H-indol-3-yl)-2-propenoic acid	Sigma - Aldrich	PZ0160	UK5099
Antimycin A	Sigma - Aldrich	A8674
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544-100G
Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide	Sigma - Aldrich	SML0601	BPTES
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma - Aldrich	C2920	FCCP
Cytation 5 imaging reader	BioTek	N/A	Microplate imager
Etomoxir sodium salt hydrate	Sigma - Aldrich	E1905
Hoechst 33342 Solution (20 mM)	Thermo Scientific	62249
Insulin	Sigma - Aldrich	I6634
Oleic Acid-Albumin from bovine serum	Sigma - Aldrich	O3008
Oligomycin A - 5 mg	Sigma - Aldrich	75351
Rotenone	Sigma - Aldrich	R8875-1G
Seahorse XF 1.0 M Glucose Solution	Agilent Technologies	103577-100
Seahorse XF 100mM Pyruvate Solution	Agilent Technologies	103578-100
Seahorse XF 200mM Glutamine solution	Agilent Technologies	103579-100
Seahorse XF DMEM media	Agilent Technologies	103575-100	DMEM assay media eith 5mM HEPES, pH 7.4, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, pyruvate, and L-glutamine
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent Technologies	S7800B	Real- Time Metabolic flux analyzer
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent Technologies	102416-100	Includes XFe96 Sensor cartridges, Cell culture microplates, and Seahorse XF Calibrant solution
The Cell imaging 1.1.0.11 software	Agilent Technologies - BioTek
Wave software 2.6.1	Agilent Technologies
β-glycerol phosphate	Sigma-Aldrich	G9422-50G