Habilidades microquirúrgicas para establecer la canulación permanente de la vena yugular en ratas para el muestreo de sangre en serie del medicamento administrado por vía oral

Resumen

Se han demostrado técnicas microquirúrgicas detalladas para establecer un modelo de rata de canulación de vena yugular a largo plazo para la recolección secuencial de sangre en el mismo animal. Los parámetros fisiológicos y hematológicos han sido monitoreados durante la fase de recuperación de la rata. Este modelo se ha aplicado para estudiar la farmacocinética del polifenol administrado por vía oral sin inducir estrés animal.

Resumen

El muestreo de sangre en pequeños animales de laboratorio es necesario para la optimización del plomo farmacéutico, pero puede causar un gran daño y estrés a los animales de experimentación, lo que podría afectar los resultados. La canulación de la vena yugular (JVC) en ratas es un modelo ampliamente utilizado para la recolección repetida de sangre, pero requiere un entrenamiento adecuado de las habilidades quirúrgicas y el cuidado de los animales. Este artículo detalla los procedimientos microquirúrgicos para establecer y mantener un modelo permanente de rata JVC con un enfoque específico en la colocación y sellado de la cánula yugular. Se destacó la importancia de monitorear los parámetros fisiológicos (por ejemplo, peso corporal, ingesta de alimentos y agua) y hematológicos, con resultados presentados durante 6 días después de la cirugía durante la recuperación de la rata. El perfil fármaco-concentración plasmática-tiempo del ácido elágico fenol natural administrado por vía oral se determinó en el modelo de rata JVC.

Introducción

La adquisición repetida de muestras de sangre de pequeños animales de laboratorio, como roedores, cobayas y conejos, es un aspecto importante para la optimización del plomo farmacéutico y también para reducir el número de animales utilizados en la investigación ^1,2. La cartera para desarrollar nuevas herramientas de diagnóstico y formulación de medicamentos (por ejemplo, vacunas) requiere acceso a diferentes volúmenes de sangre para evaluar su robustez y rendimiento in vivo, como la farmacocinética (PK), la toxicidad y la sensibilidad ^3,4,5.

El enfoque de laboratorio para la recolección de muestras de sangre se clasifica ampliamente en dos tipos, quirúrgico y no quirúrgico⁶. El enfoque no quirúrgico es relativamente fácil de comprender para el investigador, que incluye técnicas comunes, como la punción cardíaca, la punción del seno orbitario y el sangrado de la vena safena y de la cola. El muestreo múltiple de sangre es posible mediante algunos métodos no quirúrgicos, pero el volumen de la muestra es pequeño y puede causar heridas físicas y estrés psicológico a los animales¹. Por otro lado, el abordaje quirúrgico es una alternativa favorita a la venopunción repetida, e implica la colocación de una cánula temporal o permanente en los vasos sanguíneos de los animales ^7,8,9. El gran volumen de sangre podría extraerse repetidamente a través de la cánula en ratas conscientes, evitando el estrés y el dolor debido a la técnica de manipulación, la restricción y la anestesia 7,8,10,11. Sin embargo, la implantación de la cánula requiere un investigador experimentado con la capacitación adecuada para recolectar con éxito la sangre.

La recolección de sangre a través de la canulación de la vena yugular (JVC) en ratas es el método más utilizado para estudiar el fármaco PK ^6,10,12,13. Sin embargo, el establecimiento del modelo de rata JVC necesita una práctica cuidadosa de las habilidades microquirúrgicas y el conocimiento de la atención y el mantenimiento postquirúrgicos. Especialmente, después de la cirugía, la rata requiere la administración de analgésicos y el tiempo de recuperación suficiente para alcanzar una condición fisiológica estable para experimentos posteriores 13,14,15. Aunque el aumento de peso corporal (es decir, >10 g) es un indicador válido y comúnmente aplicado para la recuperación de la rata, no es raro que las ratas tengan una muerte inesperada después de la operación debido a deshidratación, infección e inflamación, que podría ser sutil notar al inicio temprano^14,15. Además, la obstrucción del catéter en el modelo JVC sigue siendo un problema durante la extracción de sangre.

El presente protocolo ha demostrado en detalle los procedimientos microquirúrgicos para JVC en una rata anestesiada con un enfoque específico en la identificación, aislamiento y canulación de la vena yugular. Se destaca la importancia del seguimiento fisiológico y hematológico de las ratas durante la fase de recuperación. Finalmente, se recogieron muestras de sangre seriadas a través del catéter venoso para estudiar el PK del ácido elágico fenol natural administrado por vía oral con mala biodisponibilidad (es decir, baja concentración sistémica) para verificar el modelo de rata JVC.

Protocolo

Los procedimientos que se describen a continuación se realizaron como parte de un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Politécnica del Noroeste (No. 202101117).

1. Preparación preoperatoria (el día antes de la cirugía)

NOTA: Soluciones requeridas: solución salina normal (cloruro de sodio al 0,9% p/v), solución salina heparinizada (1% p/v heparina sódica), solución de bloqueo del catéter, fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), como solución de meloxicam (2 mg/ml).

1. Preparación de la solución
   1. Alícuota de 200 μL de solución de bloqueo de catéter preempaquetada en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml.
      NOTA: La solución de bloqueo del catéter está compuesta de solución salina heparinizada (0,4% v/v de heparina sódica) mezclada con glicerol (v/v,1:1).
   2. Mezcle 1 g de heparina sódica en 100 ml de solución salina normal para preparar solución salina heparinizada al 1%.
   3. Disuelva el meloxicam en solución salina normal para preparar una solución de concentración de 2 mg/ml para el alivio del dolor postoperatorio.
      NOTA: La solución salina heparinizada preparada y la solución de meloxicam se filtran a través de un filtro de 0,22 μm. Todas las soluciones se esterilizan y almacenan a 4 °C para su uso futuro.
2. Instrumentos y materiales quirúrgicos
   1. Empaque todas las herramientas quirúrgicas limpias en una bolsa y péguelas con cinta adhesiva con un trozo de cinta de esterilización en autoclave. Consulte la Figura 1A para conocer los instrumentos quirúrgicos específicos utilizados.
   2. Autoclave la bolsa quirúrgica a 121 °C durante 30 min para el uso al día siguiente.
3. Preparación animal
   1. Antes de la cirugía, aloje a todas las ratas macho Sprague-Dawley (SD) en la sala de animales estándar con temperatura controlada a 22 ± 1 ° C. Aliméntelos con los alimentos y agua de laboratorio estándar ad libitum durante al menos 7 días.
      NOTA: Tanto las ratas macho como las hembras se pueden usar para el modelo JVC, y sus edades y pesos corporales típicos varían de 9 a 14 semanas y 294 ± 57 g, respectivamente.
   2. Anestesiar a la rata con 3%-3.5% de isoflurano mezclado con oxígeno en una cámara de preanestesia. Determine si la rata queda inconsciente por la falta de respuesta al pellizco del pie.
   3. Saque suavemente la rata, coloque la nariz de la rata en una pieza nasal anestésica que suministre 2% -2.5% de isoflurano.
   4. En la posición ventral y dorsal, retire el pelaje a fondo alrededor de su hombro derecho y las áreas posteriores del cuello con crema depilatoria y una maquinilla de afeitar para mascotas. Devuelva la rata a la jaula para la cirugía que se realizará al día siguiente.

2. Antes de la cirugía en el día

1. Preparar la estación de trabajo aséptica
   1. Rocíe alcohol medicinal al 75% para desinfectar el área de operación y luego coloque la almohadilla térmica cubierta con un cojín limpio. Coloque la lámpara LED con una fuente de luz fría al lado de la estación de trabajo.
   2. Precaliente las soluciones requeridas (paso 1.1) a temperatura ambiente.
   3. Llene 0,6 ml de solución salina heparinizada y 0,15 ml de solución de bloqueo de catéter en dos jeringas estériles de punta roma de 1,0 ml, respectivamente. Retire 2,5 ml de la solución salina normal con una jeringa estéril de 5,0 ml.
   4. Remoje las bolas de algodón en alcohol medicinal al 75%. Exprima el exceso de etanol antes de usarlo.
   5. Pesa y registra el peso corporal de la rata.

3. Durante la cirugía

1. Preparación quirúrgica
   1. Use la bata quirúrgica, los guantes estériles y la máscara facial. Luego abra la bolsa quirúrgica esterilizada, deje todas las herramientas quirúrgicas en alcohol medicinal al 75% y séquelas antes de usarlas.
2. Aislamiento de la vena yugular
   NOTA: El tiempo estimado de operación para esta parte es de 10 min.
   1. Anestesiar a la rata lista para la cirugía y afeitada con 3%-3.5% de isoflurano mezclado con oxígeno en una cámara de inducción y determinar si la rata queda inconsciente por la falta de respuesta al pellizco del pie.
   2. Coloque la nariz de la rata en la pieza nasal suministrada con 2% -2.5% de isoflurano para mantener la anestesia.
   3. Inyecte por vía subcutánea (s.q.) solución de meloxicam a una dosis de 2 mg/kg.
      NOTA: Asegúrese de seleccionar analgésicos que no interactúen con el compuesto farmacológico de interés en el estudio farmacocinético.
   4. Usando cinta adhesiva, sujete los antebrazos de la rata en su posición ventral a cada lado de la plataforma quirúrgica.
   5. Frote suavemente el área quirúrgica alternando entre bolas de algodón empapadas en alcohol medicinal al 75% y exfoliante a base de yodo para un total de tres veces.
   6. Levante cuidadosamente la piel cerca de la clavícula en el lado derecho de la línea media del cuello con fórceps y haga una incisión hacia el pecho de aproximadamente 1.5-2.0 cm de longitud con un par de tijeras quirúrgicas.
   7. Diseccionar la cubierta de tejido delgado con tijeras de iris para exponer la vena yugular inferior. El extremo cefálico proximal de la vena yugular externa consta de dos ramas, que se pueden identificar visualmente.
      NOTA: Dependiendo de la edad y el sexo de la rata, el tejido blando (por ejemplo, glándulas salivales, ganglios linfáticos y tejidos grasos) que cubre la vena yugular varía. En comparación con las ratas jóvenes, las ratas viejas son más gordas (por ejemplo, BW > 300 g) y, por lo tanto, necesitan más separación de tejido antes de que la vena yugular sea visible.
   8. Levante la vena yugular junto con sus tejidos membranosos conectivos para visualizar el ganglio linfático unido a la vena yugular. Separe cuidadosamente la vena a lo largo de la dirección vascular del músculo circundante, la grasa y otros tejidos.
   9. Empuje las pinzas debajo de la vena yugular sin dañar los vasos sanguíneos colaterales y pase dos piezas de sutura 6-0 debajo de la vena para marcar los dos extremos del vaso sanguíneo individualmente.
   10. Tire de una pieza de la sutura lo más lejos posible hacia la cabeza de la rata y ligar la vena cranealmente con 2-3 nudos usando fórceps.
   11. Coloque la segunda ligadura en el extremo caudal de la vena con 1 nudo suelto.
3. Canulación de la vena yugular
   NOTA: El tiempo estimado de operación para esta parte es de 15 min.
   1. Abra el envase que contiene el catéter de poliuretano (PU) de 11 cm (I.D. 0,6 mm x O.D. 0,9 mm, Figura 1B) y conecte el catéter a la jeringa de punta roma preparada llena de solución salina heparinizada.
   2. Empuje lentamente la solución salina heparinizada en el catéter para evitar burbujas de aire.
   3. Empuje el lado plano sin punta de las pinzas debajo de la vena yugular para salir por el otro lado. Haga un pequeño corte en forma de V en la vena cerca de la corbata craneal con un par de micro tijeras castroviejo y abra suavemente la incisión con la punta de las pinzas dilatadoras del vaso del codo.
      NOTA: Enjuague la incisión con solución salina normal precalentada (37 °C) si brota una pequeña cantidad de sangre.
   4. Corte la abertura oblicua del extremo frontal del catéter de la vena yugular. Sujete el extremo oblicuo del tubo con fórceps y deslícelo en la vena yugular.
      NOTA: Este paso puede necesitar otra persona para facilitar el deslizamiento del catéter.
   5. Mientras avanza el catéter, retire lentamente las pinzas microquirúrgicas del codo y sujete la superficie externa del vaso con fórceps.
      NOTA: Si se selecciona el vaso sanguíneo derecho y la punta del catéter se desliza con éxito en el vaso sanguíneo, todo el proceso de inserción del catéter no debe sentir ninguna resistencia al flujo.
   6. Deje de insertar el catéter al golpear la primera marca azul del tubo de PU (Figura 1B), que tiene aproximadamente 3,0 cm de longitud.
   7. Asegure el catéter insertado a la vena con ligaduras caudales y rostrales con fórceps.
   8. Enhebrar una sutura 6-0 a través del tejido expuesto en el lado derecho de la incisión con una aguja de sutura (1/2 corte curvo, 12 mm) y atar la ligadura con un hemostático.
   9. Doble el catéter en la segunda marca azul (Figura 1B) para unirse con la misma ligadura (en el paso 3.3.8) y evitar ocluir el tubo de PU.
   10. Corte todo el hilo de sutura adicional y cierre el catéter reemplazando la jeringa de punta roma con un tapón de acero inoxidable de 22 G.
4. Exteriorización del catéter
   NOTA: El tiempo estimado de operación para esta parte es de 10 min.
   1. Coloque la rata en la posición dorsal y limpie suavemente el área entre las escápulas con la bola de algodón empapada en alcohol medicinal al 75%.
   2. Haga una incisión muy pequeña en el centro del cuello dorsal con tijeras quirúrgicas. A través de la incisión dorsal, guíe y empuje suavemente el trochar debajo de la piel hacia la incisión ventral en el lado derecho del cuello.
   3. Coloque el catéter venoso en el trochar y luego extraiga y guíe el catéter venoso hacia la incisión dorsal.
   4. Asegure el catéter exteriorizado en la capa muscular de la misma manera que con la sutura (consulte el procedimiento en los pasos 3.3.8 y 3.3.9).
   5. Cierre la capa cutánea de las incisiones ventrales y dorsales con la sutura de nylon 6-0 y la aguja de sutura (corte curvo de 3/8, 17 mm). Frote todas las incisiones quirúrgicas con yodóforo.
      NOTA: Los clips de la herida son un método alternativo para cerrar la incisión en la piel.
   6. Retire el tapón del catéter sujetando el catéter con las yemas de los dedos. Coloque una jeringa nueva con punta roma y retire lentamente la jeringa para analizar el flujo sanguíneo.
      NOTA: Dado que la rata está en posición supina, es posible que no se puedan obtener muestras de sangre. Las muestras de sangre se pueden obtener cambiando a una posición lateral del cuerpo.
   7. Sostenga el catéter nuevamente con las yemas de los dedos e inyecte 0.2 ml de solución salina heparinizada y 0.1 ml de solución de bloqueo en el catéter usando la jeringa de punta roma.
   8. Sostenga el catéter con las yemas de los dedos y reemplace la jeringa con un tapón de acero inoxidable. Desenganche el catéter y empuje el tapón ligeramente hacia adentro para asegurar la estanqueidad del catéter.

4. Atención postquirúrgica inmediata

1. Recupere la rata en la posición de decúbito dorsal enjaulando individualmente con ropa de cama de mazorca de maíz fresca. A menudo, proporcione una almohadilla térmica con temperatura regulada para mantener la temperatura corporal central.
   NOTA: Para el bienestar animal, dejar comida y agua en la ropa de cama es una forma efectiva de aliviar el dolor causado por los movimientos del cuello al comer y beber.
2. Registre la hora de finalización de la cirugía y controle a la rata a intervalos de 2 h durante al menos 4 h. Proporcione analgesia adicional para la recuperación si la rata muestra signos de dolor o angustia.

5. Seguimiento fisiológico y hematológico durante la fase de recuperación

1. Controle el peso corporal y la ingesta de alimentos y agua diariamente y registre los datos.
2. Para recolectar un pequeño volumen de sangre fresca para la prueba hematológica, coloque a la rata en un retenedor. Abra el tapón e inserte la jeringa en el catéter venoso de PU para asegurarse de que el catéter no esté obstruido.
   NOTA: La extracción de sangre se realizó al mismo tiempo diariamente durante 6 días consecutivos.
3. Deseche la sangre extraída inicialmente, que contiene una mezcla de sangre, solución salina heparinizada y solución de bloqueo del catéter.
4. Use una jeringa nueva para recolectar 150 μL de muestra de sangre fresca y transfiera la muestra de sangre al tubo de 0.5 ml que contiene K2EDTA (1.8 mg / ml de sangre) secado por pulverización en la pared del tubo.
   NOTA: Si el catéter está bloqueado, se pueden inyectar 0,2 ml de solución salina heparinizada en el catéter para enjuagar el catéter unos minutos antes de la próxima hora de extracción de sangre.
5. Inyecte solución salina estéril en el mismo volumen para compensar la sangre extraída. Inyecte 150 μL de solución salina normal precalentada (37 °C) e infunda 0,2 ml de solución salina normal heparinizada estéril a través del catéter.
6. Inyecte 100 μL de la solución de bloqueo en el catéter para asegurar el sellado y la esterilidad del catéter antes de la siguiente recolección de muestras.
7. Analice las muestras de sangre dentro de las 2 h posteriores a la recolección utilizando un contador automatizado de células sanguíneas.

6. Muestreo de sangre repetido para estudios farmacocinéticos de fármacos administrados por vía oral

NOTA: Se sugiere que las ratas con aumento de peso >10 g y nivel hematológico estable se inscriban para futuros estudios. Siguiendo el protocolo actual, las ratas JVC requirieron de 4 a 6 días para recuperarse.

1. Después de 4-6 días de cirugía, ayune a la rata durante 12 h con acceso gratuito al agua.
   NOTA: Dependiendo del objetivo experimental, el ayuno del animal es opcional.
2. Sonda oral de la rata en ayunas con ácido elágico bioactivo fenol natural a una dosis de 6 mg/kg con una aguja de sonda recta¹⁶.
3. Recolectar 200 μL de muestras de sangre en los tubos heparinizados a través de la cánula de la vena yugular en puntos de tiempo predeterminados durante 24 h después de la administración oral. El proceso de recolección de sangre sigue el procedimiento en el paso 5.5.
   NOTA: No es necesario cerrar el catéter con la solución de bloqueo hasta que se complete la extracción de sangre.
4. Centrifuga inmediatamente la muestra de sangre a 3000 x g a 4 °C durante 10 min.
5. Analizar la muestra de plasma extraída mediante cromatografía líquida-espectroscopia de masas^17,18.

Resultados

Este protocolo ha demostrado a fondo cómo establecer un modelo JVC a largo plazo utilizando habilidades microquirúrgicas para la recolección de sangre en serie. La Figura 1A muestra los instrumentos y materiales quirúrgicos esenciales utilizados para llevar a cabo la cirugía. También se ilustra la especificación del catéter de PU con tres marcas azules, lo que es útil para guiar al investigador a colocar la cánula venosa en el paso 3.3., cómo usar las marcas en el catéte...

Discusión

Dominar la técnica de canulación de vasos requiere una práctica significativa y aprender la lección de cada operación. Christakis et al. utilizando el análisis de suma acumulativa (CUSUM), encontraron que un investigador necesita practicar 200 ratas durante un período de un año antes de estar listo para la evaluación pk de los candidatos a fármacos²⁰. Sin embargo, el tiempo de operación requerido para la canulación de la vena puede reducirse significativamente por el número de ratas r...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL test tube containing EDTA anticoagulant	Xinkang	N/A	collecting blood samples for hematology test
0.5*20 mm 1.0-mL syringe	KLMEDICAL	N/A	washing or replacing the fluid with saline
0.6*28.5 mm 5.0-mL syringe	HD	N/A	Subcutaneous injection
1.0-mL Blunt tipped syringe (22G)	skillsmodel	S4-PKT22G	Inject the saline and collect blood samples through catheter
1.5 mL sterile microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C-S	Store sterile catheter lock solution heparinized saline and meloxicam solution
1.5 mL microcentrifuge tubes	Biosharp	BS-15-M	blood collection
1/2  circle cutting 5*12 mm suture needle	skillsmodel	S4-FHZ	Thread the muscle layer to fix the catheter
3/8 circle cutting 7*17 mm suture needle	skillsmodel	S5-FHZ	Suture the incision of rat cortex
6-0 sterile non-absorbable silk suture thread	JUNSHENG	N/A	ligature
75% medical alcohol	HONGSONG	N/A	Disinfection
Adhensive tape	LIUTAI	N/A	positioning the rat
Autoclave sterilization tape	Biosharp	BS-QT-028	Mark sterilized items
Automated blood cell counter	Sysmex	XN-550	Hematology test
Castroviejo micro scissors	skillsmodel	WA1010	Cut the opening in the blood vessel
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002402	Plasma preparation
Clean cushion	Qingjie	N/A	Prepare the operation area
Cotton balls	HC	N/A	Wound disinfection and sterilization
Cotton swabs	BEITAGOGO	N/A	Disinfection
Curved hemostat	skillsmodel	N/A	ligature
DN50 Stainless-steel rat restrainer	skillsmodel	S4-RGDQ1	Restrict the movement of rats for easy operation
Ellagic acid	Aladdin	E102710-25g	natural phenol for oral administration
Half-curved forceps	skillsmodel	53072	Lift the muscle layer and tissue, isolate the jugular vein and tie the suture
Heating pad	Warm mate	N/A	preventing heat loss of animal
Heparin sodium	Solarbio	H8060	anticoagulant
Iodophor	Xidebao	N/A	Clean the wound
Iris scissors	skillsmodel	54002	Bluent separation the muscle layer
Isoflurane	RWD	R510-22-16	anaesthesia
LED lamp	EMPERORFEEL	N/A	sugery
Liquid chromatography-mass spectroscopy	Thermo Fisher Scientific	VQF01-20001/ TSQ02-10002	detection of drug concentration in plasma
Meloxicam	Hongqiang	N/A	Analgesic
Normal saline	KL	N/A	Prepara the solution and protect blood vessels from drying out
Pet razor	Codos	3180	Shaving the fur
Phosphate-buffered saline	ZHHC	PW012	Preparation of Ellagic acid solution
PU catheter	skillsmodel	RJVC-PU	Jugular vein cannulation
Small animal operation anesthesia console	RWD	68620	Operation workstation
Spray bottle	Other	N/A	aseptic workstation
Stainless steel plug (22G)	skillsmodel	S4-PKD22G	Plug the catheter to ensure its sealing
Stainless steel trochar	skillsmodel	S$-PKDGZ	Guide the catheter exteriorization
Sterile lock solution	skillsmodel	SK-FB	lock the catheter to ensure its sterility
Straight feeding needle	skillsmodel	N/A	Oral gavage
Surgical pouch	BKMAM	N/A	container for sterilization of surgical instruments
Surgical scissors	skillsmodel	J21070	Cut incision on rat skin
Vessel dilator balanced forceps	skillsmodel	WA3020	Expand the blood vessel and guide the cannula to slide in
ZS-MV Small animal anesthesia machine	ZSLab	1057003	inducing and maintaining anaesthesia