Abilità microchirurgiche di stabilire la cannulazione permanente della vena giugulare nei ratti per il campionamento seriale del sangue del farmaco somministrato per via orale

Riepilogo

Tecniche microchirurgiche dettagliate sono dimostrate per stabilire un modello di ratto di cannulazione della vena giugulare a lungo termine per la raccolta sequenziale del sangue nello stesso animale. I parametri fisiologici ed ematologici sono stati monitorati durante la fase di recupero del ratto. Questo modello è stato applicato per studiare la farmacocinetica del polifenolo somministrato per via orale senza indurre stress animale.

Abstract

Il prelievo di sangue in piccoli animali da laboratorio è necessario per l'ottimizzazione del piombo farmaceutico, ma può causare gravi danni e stress agli animali da esperimento, che potrebbero potenzialmente influenzare i risultati. La cannulazione venosa giugulare (JVC) nei ratti è un modello ampiamente utilizzato per la raccolta ripetuta di sangue, ma richiede un'adeguata formazione delle abilità chirurgiche e della cura degli animali. Questo articolo descrive in dettaglio le procedure microchirurgiche per stabilire e mantenere un modello di ratto JVC permanente con particolare attenzione al posizionamento e alla sigillatura della cannula giugulare. L'importanza del monitoraggio dei parametri fisiologici (ad esempio, peso corporeo, cibo e assunzione di acqua) ed ematologici, è stata evidenziata con risultati presentati per 6 giorni dopo l'intervento chirurgico durante il recupero del ratto. Il profilo farmaco-concentrazione plasmatica-tempo dell'acido fenolo ellagico naturale somministrato per via orale è stato determinato nel modello di ratto JVC.

Introduzione

L'acquisizione ripetuta di campioni di sangue da piccoli animali da laboratorio, come roditori, porcellini d'India e conigli, è un aspetto importante per l'ottimizzazione del piombo farmaceutico e anche per ridurre il numero di animali utilizzati nella ricerca ^1,2. La pipeline per lo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici e la formulazione di farmaci (ad esempio, vaccino) richiede l'accesso a diversi volumi di sangue al fine di valutarne la robustezza e le prestazioni in vivo, come la farmacocinetica (PK), la tossicità e la sensibilità ^3,4,5.

L'approccio di laboratorio alla raccolta di campioni di sangue è ampiamente classificato in due tipi, chirurgico e non chirurgico⁶. L'approccio non chirurgico è relativamente facile da afferrare per il ricercatore, che include tecniche comuni, come la puntura cardiaca, la puntura del seno orbitale e il sanguinamento della vena safena e della coda. Il prelievo di sangue multiplo è possibile con alcuni metodi non chirurgici, ma il volume del campione è piccolo e può causare ferite fisiche e stress psicologico agli animali¹. D'altra parte, l'approccio chirurgico è un'alternativa preferita alla venipuntura ripetuta e comporta il posizionamento di una cannula temporanea o permanente nei vasi sanguigni degli animali ^7,8,9. Il grande volume di sangue potrebbe essere ripetutamente prelevato attraverso la cannula nei ratti coscienti evitando lo stress e il dolore dovuti alla tecnica di manipolazione, alla trattenuta e all'anestesia 7,8,10,11. Tuttavia, l'impianto della cannula richiede un ricercatore esperto con una formazione adeguata per raccogliere con successo il sangue.

La raccolta di sangue attraverso la cannulazione venosa giugulare (JVC) nei ratti è il metodo più utilizzato per studiare il farmaco PK 6,10,12,13. Tuttavia, l'istituzione del modello di ratto JVC richiede un'attenta pratica delle abilità microchirurgiche e la conoscenza della cura e della manutenzione postchirurgica. Soprattutto, dopo l'intervento chirurgico, il ratto richiede la somministrazione di analgesici e un tempo di recupero sufficiente per raggiungere condizioni fisiologiche stabili per ulteriori esperimenti 13,14,15. Sebbene l'aumento di peso corporeo (cioè >10 g) sia un indicatore valido e comunemente applicato per il recupero del ratto, non è raro che i ratti abbiano una morte inaspettata postoperatoria a causa di disidratazione, infezione e infiammazione, che potrebbe essere sottile da notare^{all'esordio precoce 14,15}. Inoltre, l'ostruzione del catetere nel modello JVC rimane un problema durante la raccolta del sangue.

Il presente protocollo ha dimostrato in dettaglio le procedure microchirurgiche per JVC in un ratto anestetizzato con particolare attenzione all'identificazione, all'isolamento e alla cannulazione della vena giugulare. Viene evidenziata l'importanza del monitoraggio fisiologico ed ematologico dei ratti durante la fase di recupero. Infine, sono stati raccolti campioni di sangue seriale attraverso il catetere venoso per studiare la PK dell'acido fenolo ellagico naturale somministrato per via orale con scarsa biodisponibilità (cioè bassa concentrazione sistemica) per verificare il modello di ratto JVC.

Protocollo

Le procedure descritte di seguito sono state eseguite nell'ambito di un protocollo approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Northwestern Polytechnical University (n. 202101117).

1. Preparazione preoperatoria (il giorno prima dell'intervento)

NOTA: Soluzioni richieste: soluzione salina normale (0,9% p/v di cloruro di sodio), soluzione salina eparinizzata (1% p/v di eparina sodica), soluzione di blocco del catetere, farmaco antinfiammatorio non steroideo (FANS), come la soluzione di meloxicam (2 mg/mL).

1. Preparazione della soluzione
   1. Aliquota 200 μL di soluzione preconfezionata di blocco del catetere in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 mL.
      NOTA: La soluzione di blocco del catetere è composta da soluzione salina eparinizzata (0,4% v/v di eparina sodica) miscelata con glicerolo (v/v,1:1).
   2. Mescolare 1 g di eparina sodica in 100 ml di soluzione salina normale per preparare 1% di soluzione salina eparinizzata.
   3. Sciogliere meloxicam in soluzione salina normale per preparare una soluzione di concentrazione di 2 mg/mL per alleviare il dolore postoperatorio.
      NOTA: la soluzione salina e meloxicam preparata viene filtrata attraverso un filtro da 0,22 μm. Tutte le soluzioni sono sterilizzate e conservate a 4°C per un uso futuro.
2. Strumenti e materiali chirurgici
   1. Imballare tutti gli strumenti chirurgici puliti in una custodia e incollarlo con un pezzo di nastro adesivo per la sterilizzazione in autoclave. Fare riferimento alla Figura 1A per gli strumenti chirurgici specifici utilizzati.
   2. Autoclave della sacca chirurgica a 121 °C per 30 minuti per l'uso del giorno successivo.
3. Preparazione animale
   1. Prima dell'intervento, ospitare tutti i ratti maschi di Sprague-Dawley (SD) nella stanza standard degli animali con temperatura controllata a 22 ± 1 °C. Nutrili con il cibo di laboratorio standard e acqua ad libitum per almeno 7 giorni.
      NOTA: Sia i ratti maschi che quelli femmine possono essere utilizzati per il modello JVC e le loro età e pesi corporei tipici variano rispettivamente da 9-14 settimane e 294 ± 57 g.
   2. Anestetizzare il ratto con il 3% -3,5% di isoflurano mescolato con ossigeno in una camera pre-anestesia. Determinare se il ratto diventa incosciente per la mancanza di risposta al pizzico del piede.
   3. Estrarre delicatamente il ratto, posizionare il naso del ratto in un nasello anestetico che fornisce il 2% -2,5% di isoflurano.
   4. In posizione ventrale e dorsale, rimuovere accuratamente la pelliccia intorno alla spalla destra e alle aree posteriori del collo con crema depilatoria e un rasoio per animali domestici. Riportare il ratto nella gabbia per un intervento chirurgico da eseguire il giorno successivo.

2. Prima dell'intervento chirurgico del giorno

1. Preparare la postazione di lavoro asettica
   1. Spruzzare alcol medico al 75% per disinfettare l'area operativa, quindi posizionare la piastra riscaldante coperta da un cuscino pulito. Impostare la lampada a LED con una sorgente di luce fredda accanto alla postazione di lavoro.
   2. Preriscaldare le soluzioni richieste (punto 1.1) a temperatura ambiente.
   3. Riempire 0,6 mL di soluzione salina eparinizzata e 0,15 mL di soluzione di blocco del catetere in due siringhe sterili da 1,0 mL con punta smussata, rispettivamente. Prelevare 2,5 mL della normale soluzione salina utilizzando una siringa sterile da 5,0 mL.
   4. Immergere i batuffoli di cotone in alcool medico al 75%. Spremere l'etanolo in eccesso prima dell'uso.
   5. Pesare e registrare il peso corporeo del ratto.

3. Durante l'intervento chirurgico

1. Preparazione chirurgica
   1. Indossare il cappotto chirurgico, guanti sterili e maschera facciale. Quindi aprire la sacca chirurgica sterilizzata, lasciare tutti gli strumenti chirurgici in alcool medico al 75% e asciugarli prima dell'uso.
2. Isolamento della vena giugulare
   NOTA: il tempo di funzionamento stimato per questa parte è di 10 minuti.
   1. Anestetizzare il ratto pronto per l'intervento chirurgico e rasato con isoflurano 3%-3,5% mescolato con ossigeno in una camera di induzione e determinare se il ratto diventa incosciente per la mancanza di risposta al pizzico del piede.
   2. Posizionare il naso del ratto nel nasello fornito con il 2% -2,5% di isoflurano per mantenere l'anestesia.
   3. Iniettare per via sottocutanea (s.q.) meloxicam soluzione alla dose di 2 mg/kg.
      NOTA: Assicurarsi di selezionare analgesici che non interagiscono con il composto farmacologico di interesse nello studio di farmacocinetica.
   4. Usando del nastro adesivo, trattenere gli avambracci del ratto nella loro posizione ventrale su ciascun lato della piattaforma chirurgica.
   5. Strofinare delicatamente l'area chirurgica alternando batuffoli di cotone imbevuti di alcool medico al 75% e scrub a base di iodio per un totale di tre volte.
   6. Sollevare con attenzione la pelle vicino alla clavicola sul lato destro della linea mediana del collo con una pinza e fare un'incisione verso il torace di circa 1,5-2,0 cm di lunghezza con un paio di forbici chirurgiche.
   7. Smussato sezionare la sottile copertura di tessuto con forbici dell'iride per esporre la vena giugulare sottostante. L'estremità cefalica prossimale della vena giugulare esterna è costituita da due rami, che possono essere identificati visivamente.
      NOTA: A seconda dell'età e del sesso del ratto, i tessuti molli (ad esempio, ghiandole salivari, linfonodi e tessuti grassi) che coprono la vena giugulare variano. Rispetto ai ratti giovani, i ratti vecchi sono più grassi (ad esempio, BW > 300 g), e quindi hanno bisogno di una maggiore separazione dei tessuti prima che la vena giugulare sia visibile.
   8. Sollevare la vena giugulare insieme ai suoi tessuti membranosi connettivi per visualizzare la ghiandola linfatica attaccata alla vena giugulare. Separare accuratamente la vena lungo la direzione vascolare dal muscolo circostante, dal grasso e da altri tessuti.
   9. Spingere la pinza sotto la vena giugulare senza danneggiare i vasi sanguigni collaterali e passare due pezzi di sutura 6-0 sotto la vena per segnare le due estremità del vaso sanguigno individualmente.
   10. Tirare un pezzo della sutura il più lontano possibile verso la testa del ratto e legare la vena cranicamente con 2-3 nodi usando una pinza.
   11. Posizionare la seconda legatura sull'estremità caudale della vena con 1 nodo sciolto.
3. Cannulazione della vena giugulare
   NOTA: il tempo di funzionamento stimato per questa parte è di 15 min.
   1. Aprire la confezione contenente catetere in poliuretano (PU) da 11 cm (I.D. 0,6 mm x O.D. 0,9 mm, Figura 1B) e fissare il catetere alla siringa con punta smussata preparata riempita con la soluzione salina eparinizzata.
   2. Spingere lentamente la soluzione salina eparinizzata nel catetere per evitare bolle d'aria.
   3. Spingere il lato piatto senza punta della pinza sotto la vena giugulare per uscire dall'altro lato. Fare un piccolo taglio a forma di V sulla vena vicino alla cravatta cranica con un paio di micro forbici castroviejo e aprire delicatamente l'incisione con la punta della pinza dilatatrice del vaso del gomito.
      NOTA: Risciacquare l'incisione con soluzione salina normale preriscaldata (37 °C) se fuoriesce una piccola quantità di sangue.
   4. Ritagliare l'apertura obliqua dell'estremità anteriore del catetere della vena giugulare. Bloccare l'estremità obliqua del tubo con una pinza e farla scivolare nella vena giugulare.
      NOTA: questo passaggio potrebbe richiedere un'altra persona per facilitare lo scorrimento del catetere.
   5. Mentre si avanza il catetere, prelevare lentamente la pinza microchirurgica del gomito e bloccare la superficie esterna della nave con una pinza.
      NOTA: Se viene selezionato il vaso sanguigno giusto e la punta del catetere viene fatta scivolare con successo nel vaso sanguigno, l'intero processo di inserimento del catetere non deve sentire alcuna resistenza al flusso.
   6. Interrompere l'inserimento del catetere dopo aver colpito il primo segno blu del tubo PU (Figura 1B), che è lungo circa 3,0 cm.
   7. Fissare il catetere inserito alla vena con legature caudali e rostrali usando una pinza.
   8. Infilare una sutura 6-0 attraverso il tessuto esposto sul lato destro dell'incisione usando un ago di sutura (1/2 taglio curvo, 12 mm) e legare la legatura con un emostato.
   9. Piegare il catetere al secondo segno blu (Figura 1B) per legare con la stessa legatura (al punto 3.3.8) ed evitare di occludere il tubo in PU.
   10. Tagliare tutto il filo di sutura extra e chiudere il catetere sostituendo la siringa con punta smussata con un tappo in acciaio inossidabile da 22 G.
4. Esteriorizzazione del catetere
   NOTA: il tempo di funzionamento stimato per questa parte è di 10 minuti.
   1. Posizionare il ratto in posizione dorsale e pulire delicatamente l'area tra le scapole con il batuffolo di cotone imbevuto di alcool medico al 75%.
   2. Fai un'incisione molto piccola al centro del collo dorsale con le forbici chirurgiche. Attraverso l'incisione dorsale, guidare e spingere delicatamente il trochar sotto la pelle verso l'incisione ventrale sul lato destro del collo.
   3. Mettere il catetere venoso nel trochar e poi estrarre e guidare il catetere venoso verso l'incisione dorsale.
   4. Fissare il catetere esteriore nello strato muscolare allo stesso modo con la sutura (vedere la procedura nei passaggi 3.3.8 e 3.3.9).
   5. Chiudere lo strato cutaneo delle incisioni ventrali e dorsali con la sutura in nylon 6-0 e l'ago di sutura (taglio curvo 3/8, 17 mm). Tamponare tutte le incisioni chirurgiche con iodoforo.
      NOTA: Le clip per ferite sono un metodo alternativo per chiudere l'incisione cutanea.
   6. Rimuovere il tappo del catetere stringendo il catetere con la punta delle dita. Posizionare una nuova siringa con punta smussata e tirare lentamente indietro la siringa per testare il flusso sanguigno.
      NOTA: Poiché il ratto è in posizione supina, potrebbe non essere possibile ottenere campioni di sangue. I campioni di sangue potrebbero essere ottenuti passando a una posizione laterale del corpo.
   7. Tenere nuovamente il catetere con la punta delle dita e iniettare 0,2 mL di soluzione salina eparinizzata e 0,1 mL di soluzione di blocco nel catetere utilizzando la siringa con punta smussata.
   8. Tenere il catetere con la punta delle dita e sostituire la siringa con un tappo in acciaio inossidabile. Rimuovere il catetere e spingere leggermente la spina per garantire la tenuta del catetere.

4. Cure post-chirurgiche immediate

1. Recuperare il ratto nella posizione del decubito dorsale ingabbiandolo singolarmente con lettiera di pannocchia di mais fresca. Spesso, fornire una piastra riscaldante a temperatura regolata per mantenere la temperatura corporea interna.
   NOTA: Per il benessere degli animali, lasciare cibo e acqua sulla lettiera è un modo efficace per alleviare il dolore causato dai movimenti del collo quando si mangia e si beve.
2. Registrare l'ora di fine dell'intervento chirurgico e monitorare il ratto a intervalli di 2 ore per almeno 4 ore. Fornire ulteriore analgesia per il recupero se il ratto mostra segni di dolore o angoscia.

5. Monitoraggio fisiologico ed ematologico durante la fase di recupero

1. Monitorare il peso corporeo e l'assunzione di cibo e acqua ogni giorno e registrare i dati.
2. Per raccogliere un piccolo volume di sangue fresco per il test ematologico, posizionare il ratto in un dispositivo di ritenuta. Aprire il tappo e inserire la siringa nel catetere in PU venoso per assicurarsi che il catetere non sia ostruito.
   NOTA: La raccolta del sangue è stata eseguita contemporaneamente ogni giorno per 6 giorni consecutivi.
3. Scartare il sangue prelevato inizialmente, che contiene una miscela di sangue, soluzione salina eparinizzata e soluzione di blocco del catetere.
4. Utilizzare una nuova siringa per raccogliere 150 μL di campione di sangue fresco e trasferire il campione di sangue alla provetta da 0,5 mL contenente K2EDTA (1,8 mg/mL di sangue) essiccata a spruzzo sulla parete del tubo.
   NOTA: Se il catetere è bloccato, 0,2 mL di soluzione salina eparinizzata possono essere iniettati nel catetere per lavare il catetere pochi minuti prima del successivo tempo di raccolta del sangue.
5. Iniettare soluzione salina sterile nello stesso volume per compensare il sangue prelevato. Iniettare 150 μL di soluzione salina normale preriscaldata (37 °C) e infondere 0,2 mL di soluzione salina normale eparinizzata sterile attraverso il catetere.
6. Iniettare 100 μL della soluzione di blocco nel catetere per garantire la sigillatura e la sterilità del catetere prima della successiva raccolta del campione.
7. Analizzare i campioni di sangue entro 2 ore dalla raccolta utilizzando un contatore automatico di cellule del sangue.

6. Prelievo di sangue ripetuto per studi di farmacocinetica del farmaco somministrato per via orale

NOTA: I ratti con aumento di peso >10 g e livello ematologico stabile sono suggeriti per essere arruolati per studi futuri. Seguendo il protocollo attuale, i ratti JVC hanno richiesto da 4 a 6 giorni per riprendersi.

1. Dopo 4-6 giorni di intervento chirurgico, digiunare il ratto per 12 ore con libero accesso all'acqua.
   NOTA: A seconda dell'obiettivo sperimentale, il digiuno dell'animale è facoltativo.
2. Gavagare per via orale il ratto a digiuno con acido ellagico bioattivo naturale fenolo alla dose di 6 mg / kg con un ago di gavage dritto¹⁶.
3. Raccogliere 200 μL di campioni di sangue nei tubi eparinizzati attraverso la cannula della vena giugulare in punti temporali predeterminati nell'arco di 24 ore dopo la somministrazione orale. Il processo di raccolta del sangue segue la procedura nel passaggio 5.5.
   NOTA: il catetere non deve essere chiuso con la soluzione di blocco fino al completamento della raccolta del sangue.
4. Centrifugare immediatamente il campione di sangue a 3000 x g a 4 °C per 10 min.
5. Analizzare il campione di plasma estratto mediante cromatografia liquida-spettroscopia di massa^17,18.

Risultati

Questo protocollo ha dimostrato a fondo come stabilire un modello JVC a lungo termine utilizzando competenze microchirurgiche per la raccolta seriale di sangue. La Figura 1A mostra gli strumenti chirurgici essenziali e i materiali utilizzati per condurre l'intervento chirurgico. Viene anche illustrata la specifica del catetere PU con tre segni blu, che è utile per guidare il ricercatore a posizionare la cannula venosa nel passaggio 3.3., come utilizzare i segni sul catetere PU per ...

Discussione

Padroneggiare la tecnica della cannulazione dei vasi richiede una pratica significativa e l'apprendimento della lezione da ogni operazione. Christakis et al. utilizzando l'analisi della somma cumulativa (CUSUM), hanno scoperto che un ricercatore deve praticare 200 ratti per un periodo di un anno prima di essere pronto per la valutazione PK dei farmaci candidati²⁰. Tuttavia, il tempo operativo richiesto per la cannulazione venosa può essere significativamente ridotto dal numero di ratti eseguiti

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL test tube containing EDTA anticoagulant	Xinkang	N/A	collecting blood samples for hematology test
0.5*20 mm 1.0-mL syringe	KLMEDICAL	N/A	washing or replacing the fluid with saline
0.6*28.5 mm 5.0-mL syringe	HD	N/A	Subcutaneous injection
1.0-mL Blunt tipped syringe (22G)	skillsmodel	S4-PKT22G	Inject the saline and collect blood samples through catheter
1.5 mL sterile microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C-S	Store sterile catheter lock solution heparinized saline and meloxicam solution
1.5 mL microcentrifuge tubes	Biosharp	BS-15-M	blood collection
1/2  circle cutting 5*12 mm suture needle	skillsmodel	S4-FHZ	Thread the muscle layer to fix the catheter
3/8 circle cutting 7*17 mm suture needle	skillsmodel	S5-FHZ	Suture the incision of rat cortex
6-0 sterile non-absorbable silk suture thread	JUNSHENG	N/A	ligature
75% medical alcohol	HONGSONG	N/A	Disinfection
Adhensive tape	LIUTAI	N/A	positioning the rat
Autoclave sterilization tape	Biosharp	BS-QT-028	Mark sterilized items
Automated blood cell counter	Sysmex	XN-550	Hematology test
Castroviejo micro scissors	skillsmodel	WA1010	Cut the opening in the blood vessel
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002402	Plasma preparation
Clean cushion	Qingjie	N/A	Prepare the operation area
Cotton balls	HC	N/A	Wound disinfection and sterilization
Cotton swabs	BEITAGOGO	N/A	Disinfection
Curved hemostat	skillsmodel	N/A	ligature
DN50 Stainless-steel rat restrainer	skillsmodel	S4-RGDQ1	Restrict the movement of rats for easy operation
Ellagic acid	Aladdin	E102710-25g	natural phenol for oral administration
Half-curved forceps	skillsmodel	53072	Lift the muscle layer and tissue, isolate the jugular vein and tie the suture
Heating pad	Warm mate	N/A	preventing heat loss of animal
Heparin sodium	Solarbio	H8060	anticoagulant
Iodophor	Xidebao	N/A	Clean the wound
Iris scissors	skillsmodel	54002	Bluent separation the muscle layer
Isoflurane	RWD	R510-22-16	anaesthesia
LED lamp	EMPERORFEEL	N/A	sugery
Liquid chromatography-mass spectroscopy	Thermo Fisher Scientific	VQF01-20001/ TSQ02-10002	detection of drug concentration in plasma
Meloxicam	Hongqiang	N/A	Analgesic
Normal saline	KL	N/A	Prepara the solution and protect blood vessels from drying out
Pet razor	Codos	3180	Shaving the fur
Phosphate-buffered saline	ZHHC	PW012	Preparation of Ellagic acid solution
PU catheter	skillsmodel	RJVC-PU	Jugular vein cannulation
Small animal operation anesthesia console	RWD	68620	Operation workstation
Spray bottle	Other	N/A	aseptic workstation
Stainless steel plug (22G)	skillsmodel	S4-PKD22G	Plug the catheter to ensure its sealing
Stainless steel trochar	skillsmodel	S$-PKDGZ	Guide the catheter exteriorization
Sterile lock solution	skillsmodel	SK-FB	lock the catheter to ensure its sterility
Straight feeding needle	skillsmodel	N/A	Oral gavage
Surgical pouch	BKMAM	N/A	container for sterilization of surgical instruments
Surgical scissors	skillsmodel	J21070	Cut incision on rat skin
Vessel dilator balanced forceps	skillsmodel	WA3020	Expand the blood vessel and guide the cannula to slide in
ZS-MV Small animal anesthesia machine	ZSLab	1057003	inducing and maintaining anaesthesia